肌酸對神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激的保護(hù)作用

張婷，張倩，孫悅，李巧彥，田云云，王鐵鵬

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 石河子 832000)

神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默氏癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等)的發(fā)生與衰老相關(guān)，在全球老齡化程度不斷加劇的背景下，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)措施的研究受到研究人員越來越多的重視[1]。盡管各種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病原因不同，但在疾病后期神經(jīng)元的退變過程中，都經(jīng)歷了相同的神經(jīng)元死亡通路，即神經(jīng)興奮性毒性機(jī)制[2]。研究表明，高濃度的一氧化氮及其介導(dǎo)的硝化應(yīng)激作用是介導(dǎo)神經(jīng)興奮性毒性作用的核心因素，抑制一氧化氮產(chǎn)生及硝化應(yīng)激作用，神經(jīng)興奮性毒性作用幾乎可以得到完全逆轉(zhuǎn)[3]。

在干預(yù)神經(jīng)興奮性毒性的研究中，科研人員不斷嘗試著多種藥物對神經(jīng)毒性的保護(hù)作用。近年來，肌酸作為潛在的神經(jīng)毒性保護(hù)藥物，逐漸得到了人們的關(guān)注[1,4]。肌酸作為一種含有胍基的內(nèi)源性化合物，與肌酸激酶一起構(gòu)成了“肌酸和肌酸激酶能量穿梭機(jī)制(Creatine-Creatine kinase Shuttle)”，被認(rèn)為是細(xì)胞維持能量代謝平衡的緩沖體系和重要保障[5]。在利用肌酸保護(hù)不同類型神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型的研究中，不同的研究小組分別闡述了肌酸通過發(fā)揮能量代謝調(diào)節(jié)以外的機(jī)制保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用途徑[6]，如肌酸具有還原劑作用[7-9]、肌酸具有穩(wěn)定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔作用[10]、肌酸可以調(diào)節(jié)NMDAR(N-methyl-D-aspartic acid Receptor)受體功能等[11]。針對肌酸是否對于神經(jīng)興奮性毒性具有保護(hù)作用以及具體的保護(hù)機(jī)制的問題，由于各種研究報(bào)道使用的實(shí)驗(yàn)材料不同、模型的復(fù)雜程度各異，不同的研究報(bào)告之間存在著較大爭議，甚至出現(xiàn)截然相反的報(bào)道[6]。同時(shí)，盡管硝化應(yīng)激是誘發(fā)神經(jīng)興奮性毒性作用的核心因素[3]，直接探討肌酸對于神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激調(diào)節(jié)作用的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究采用性質(zhì)均一的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞系作為研究對象，以排除復(fù)雜因素干擾，并利用一氧化氮供體GSNO(S-Nitrosoglutathione)建立硝化應(yīng)激條件，以期通過對單純模型的研究揭示肌酸對于神經(jīng)興奮性毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen；氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)試劑、Hoechst33342染料、DNFB(2,4-Dinitrofluorobenzene)、肌酸、GSNO、α-tubulin抗體購自Sigma公司；AMPK(Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase)及磷酸化AMPK抗體購自Cell Signaling Technology公司；ATP檢測試劑盒購自Beyotime公司；BCA定量試劑盒及電泳相關(guān)試劑購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

5H-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，完全培養(yǎng)基中添加抗生素防止污染(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)，細(xì)胞培養(yǎng)到貼壁密度為90%-95%左右，采用相應(yīng)濃度一氧化氮供體GSNO處理至指定時(shí)間。GSNO置于-20 ℃保存，使用時(shí)需新鮮配制，采用DMEM完全培養(yǎng)基為溶劑制備不同濃度的GSNO細(xì)胞處理液。鑒定肌酸的保護(hù)作用時(shí)，先采用不同濃度的肌酸孵育SH-SY5Y細(xì)胞30 min，之后在含有肌酸的培養(yǎng)基中添加GSNO試劑處理，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

SH-SY5Y細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，藥物處理后，添加10×MTT儲液(采用DMEM培養(yǎng)基配制)，使得MTT終濃度達(dá)到5 mg/mL。細(xì)胞繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，而后吸掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔添加200 μL DMSO溶液，在搖床上搖動(dòng)混勻10 min，以充分溶解紫色產(chǎn)物，空孔中添加200 μL DMSO作為對照。酶標(biāo)儀上設(shè)定565 nm波長下測定吸光度，各組間通過吸光度指標(biāo)比較細(xì)胞活力，以對照組吸光度值為標(biāo)準(zhǔn)做歸一化處理。

1.2.3 Hoechst33342染色

待染色細(xì)胞利用PBS洗2次，以4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，吸除固定液。采用終濃度為5 μg/mL的hoechst33342細(xì)胞染色液染色10 min，再用PBS溶液洗凈非特異結(jié)合染料。培養(yǎng)皿中添加2 mL PBS，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，染料激發(fā)波長為346 nm。

1.2.4 ATP含量檢測

ATP濃度檢測利用熒光素酶催化熒光素底物發(fā)光時(shí)需要消耗ATP，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與ATP含量成正比的原理進(jìn)行定量檢測。細(xì)胞加藥處理完畢后，使用PBS洗細(xì)胞2次，在4 ℃冰盒上，使用ATP檢測試劑盒專用裂解液裂解細(xì)胞。裂解后采用4 ℃，12000 g離心5 min，取上清用于檢測。將標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液用ATP檢測裂解液稀釋成不同的濃度梯度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品檢測使用96孔化學(xué)發(fā)光板，每孔加入100 μL ATP檢測輔助工作液，室溫放置5分鐘，之后加入10 μL待定量樣品于檢測孔中，間隔2 s后，采用Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀測定化學(xué)發(fā)光數(shù)值。利用BCA蛋白定量試劑盒定量待檢測樣品的蛋白濃度，將各樣品中ATP濃度換算成nmol/mg蛋白形式，并以對照組為標(biāo)準(zhǔn)做歸一化處理。

1.2.5 Western blot檢測

細(xì)胞處理完畢，除去培養(yǎng)基，使用PBS(Phosphate buffer saline)緩沖液洗細(xì)胞2次以除去培養(yǎng)基成分。利用RIPA細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，在4 ℃冰盒上裂解細(xì)胞15 min后采用BCA試劑盒定量裂解液蛋白濃度。單泳道上樣蛋白約20 μg，采用10%濃度SDS-PAGE電泳膠分離蛋白，濃縮膠條件為80 V恒壓，分離膠條件為120 V恒壓。電泳完畢，利用濕轉(zhuǎn)印記儀將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素(Nitrocellulose，NC)膜上，濕轉(zhuǎn)條件為恒壓80 V，轉(zhuǎn)印2 h。采用李春紅S染色檢測蛋白條帶，并裁剪轉(zhuǎn)印膜，之后將NC膜在含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉2 h，TBST液洗2次后，配制相應(yīng)稀釋度抗體4 ℃孵育過夜。次日，TBST液洗膜4次，每次5～10 min。稀釋二抗在室溫下孵育NC膜1 h，TBST溶液再次洗膜4次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。通過FluoChem HD-2成像儀拍照，利用AlphaWiew軟件掃描蛋白條帶灰度。實(shí)驗(yàn)中以α-tubulin為上樣內(nèi)參，待測蛋白的比較采用目標(biāo)蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度值做定量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 硝化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞活力的影響

使用不同濃度的GSNO處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，利用MTT法檢測神經(jīng)細(xì)胞活力(圖1A)。

圖1 GSNO處理SH-SY5Y細(xì)胞的劑量及時(shí)間效應(yīng)Fig.1 The dose- and time-dependent effect of GSNO treatment on SH-SY5Y cell

結(jié)果(圖1)顯示，GSNO的細(xì)胞毒性表現(xiàn)為濃度依賴性遞增，當(dāng)其濃度增至500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力減低為對照組活力的81.90%，與對照組相比出現(xiàn)顯著性差異(P<0.001)。隨著GSNO濃度進(jìn)一步增加，細(xì)胞毒性表現(xiàn)得更加顯著。GSNO的細(xì)胞毒性也表現(xiàn)為時(shí)間依賴性增加。采用1000 μmol/L GSNO處理SH-SY5Y細(xì)胞不同時(shí)間(圖1B)，6 h時(shí)細(xì)胞活力降低至對照組72.36%(P<0.001)，與對照組出現(xiàn)顯著差異；刺激時(shí)間延長到24 h時(shí)，細(xì)胞活力降低到對照組60.74%(P<0.001)。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肌酸對于GSNO誘發(fā)硝化應(yīng)激的保護(hù)作用，在細(xì)胞活力下降至60%左右時(shí)表現(xiàn)得最為明顯，當(dāng)細(xì)胞活力減低至40%以下，肌酸的保護(hù)作用不再顯著。因而，在我們的研究中，最終確定以1000 μmol/L GSNO處理24 h為造模條件。

2.2 肌酸對硝化應(yīng)激條件下神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

為確定肌酸的使用劑量，我們在1000 μmol/L GSNO刺激SH-SY5Y細(xì)胞24 h的硝化應(yīng)條件下，采用不同濃度的肌酸預(yù)處理細(xì)胞30 min，驗(yàn)證其對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用(圖2)。結(jié)果顯示，GSNO處理使細(xì)胞活力降低至對照組57.93%；添加不同劑量肌酸后，其對于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用隨著肌酸濃度的提升而不斷增強(qiáng)。肌酸濃度達(dá)到2.5 μmol/L時(shí)，已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的保護(hù)效應(yīng)(P<0.05)；濃度增加到5 μmol/L時(shí)，可將細(xì)胞活力提升至未刺激組的75.82%(P<0.001)，保護(hù)效應(yīng)最顯著(圖2)。由此，確定后續(xù)研究中采用5 μmol/L的肌酸保護(hù)劑濃度。

圖2 肌酸保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激的劑量效應(yīng)Fig.2 The dose-dependent effect of creatine protection on neurocyte under nitrosative stress

2.3 肌酸通過肌酸激酶途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激

肌酸是一種內(nèi)源性能量代謝中間分子，細(xì)胞能量充裕時(shí)，在肌酸激酶的催化作用下，肌酸可接受ATP的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)換為磷酸肌酸，作為能量儲備；當(dāng)細(xì)胞處于能量應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，肌酸激酶可催化磷酸肌酸釋放高能磷酸鍵生成ATP，以維持細(xì)胞能量代謝平衡。因此，“肌酸和肌酸激酶能量穿梭機(jī)制(Creatine-Creatine kinase Shuttle)”被認(rèn)為是細(xì)胞能量代謝平衡的重要緩沖體系[5]。為驗(yàn)證肌酸對于神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激的保護(hù)作用是否通過“肌酸-肌酸激酶”的能量轉(zhuǎn)換機(jī)制實(shí)現(xiàn)，我們采用肌酸激酶的特異性抑制劑DNFB處理細(xì)胞，以抑制肌酸激酶活力[12]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用5 μmol/L的DNFB處理細(xì)胞，并不影響SH-SY5Y活力(圖3)，但可以幾乎完全抑制細(xì)胞內(nèi)肌酸激酶活性。如圖3所示，在GSNO引發(fā)的硝化應(yīng)激條件下，SH-SY5Y細(xì)胞活力減低至對照組的57.27%(P<0.001)；肌酸保護(hù)組可增強(qiáng)細(xì)胞活力至對照組78.82%(P<0.001)，與無保護(hù)劑組相比差異顯著。但是，當(dāng)肌酸保護(hù)組中添加肌酸激酶抑制劑DNFB后，肌酸的保護(hù)作用被完全拮抗(圖3)。研究結(jié)果表明，肌酸激酶的活性是肌酸發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的必要條件。

圖3 肌酸通過肌酸激酶途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞Fig.3 Creatine protect neurocyte through creatine kinase pathway

2.4 肌酸對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)作用

肌酸對于神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激的保護(hù)作用也體現(xiàn)在對細(xì)胞形態(tài)的影響上。對照組細(xì)胞(圖4a，4e)，可見光下形態(tài)飽滿，hoechst33342細(xì)胞核染色時(shí)，細(xì)胞核著色均勻，熒光顯微鏡下部分細(xì)胞核正處于有絲分裂期(圖4e)。GSNO處理24 h后(圖4b，4f)，細(xì)胞胞體皺縮、染色質(zhì)凝集、DNA染色加深，表明細(xì)胞處于凋亡過程后期[13]。肌酸保護(hù)組可明顯保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)，防止細(xì)胞核凝結(jié)(圖4c，4 g)；但添加肌酸激酶抑制劑DNFB(5 μmol/L)后，肌酸的保護(hù)作用消失(圖4 d，4h)。

a，e：對照組細(xì)胞；b，f：GSNO處理組；c，g：肌酸干預(yù)組；d，h：肌酸+DNFB組圖4 肌酸對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)作用Fig.4 The protective effect of creatine on neurocyte morphology

2.5 肌酸對硝化應(yīng)激條件下ATP含量的影響

如果肌酸是通過“肌酸-肌酸激酶能量穿梭”機(jī)制對硝化應(yīng)激條件下的神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用，那么，該保護(hù)作用應(yīng)當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)通過ATP含量指標(biāo)直接表現(xiàn)出來。為此，我們利用基于化學(xué)發(fā)光方法的ATP定量試劑盒檢測了肌酸處理前后的胞內(nèi)ATP水平。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSNO處理后，細(xì)胞內(nèi)ATP含量在刺激后10～15 min區(qū)間測定值最低，表現(xiàn)為“能量應(yīng)激”，之后ATP含量又隨著時(shí)間逐漸增加，30 min左右其含量恢復(fù)到刺激前水平[13]。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇GSNO處理后10 min，作為檢測胞內(nèi)ATP含量的時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞具有較高的ATP基礎(chǔ)含量，但1000 μmol/L GSNO處理10 min后，其ATP含量顯著減低至對照組的78.91%(P<0.001)(圖5)。硝化應(yīng)激條件下，肌酸保護(hù)組可增加胞內(nèi)ATP含量至對照組的90.34%，與無保護(hù)劑組相比差異顯著(P<0.05)，而肌酸對胞內(nèi)ATP含量的提升作用可被DNFB(5 μmol/L)完全拮抗(圖5)。

圖5 肌酸對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ATP含量的調(diào)節(jié)作用Fig.5 The modulation on intracellular ATP content of neurocyte by creatine

2.6 肌酸對AMPK的調(diào)節(jié)作用

肌酸對AMPK的調(diào)節(jié)作用作用見圖6。

***，P<0.001，與對照組比較；###，P<0.001，與GSNO 處理組比較；ns，P>0.05，與GSNO處理組比較圖6 肌酸對AMPK磷酸化的調(diào)節(jié)作用Fig.6 The modulatory role of creatine on AMPK phosphorylation

AMPK是細(xì)胞內(nèi)最敏感的能量狀態(tài)“感受器”，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)能量應(yīng)激時(shí)，胞內(nèi)AMP/ATP比值增加，此時(shí)AMPK會發(fā)生磷酸化激活，并通過激活下游的多條能量發(fā)生機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的能量供給[14]。因此，AMPK的磷酸化水平是衡量細(xì)胞內(nèi)ATP相對含量或體現(xiàn)細(xì)胞“荷能”狀態(tài)的直接標(biāo)志[14]。為確定肌酸對神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激保護(hù)作用是否影響了細(xì)胞的能量代謝，即是否改變了細(xì)胞的荷能狀態(tài)，我們檢測了不同組別中AMPK的總含量(t-AMPK)及其磷酸化蛋白含量(p-AMPK)，并采用AMPK磷酸化比率(p-AMPK/t-AMPK，灰度值比)的指標(biāo)，表征細(xì)胞是否處于能量應(yīng)激狀態(tài)中[13]。研究結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞的AMPK基礎(chǔ)磷酸化水平很低，AMPK磷酸化比率約為0.27；GSNO處理后AMPK的磷酸化水平急劇增加(圖6)，其AMPK磷酸化比率顯著提高至1.13(與對照組相比差異顯著，P<0.001)；肌酸干預(yù)組則顯著降低AMPK的磷酸化水平，使AMPK磷酸化比率下調(diào)至0.46(與GSNO處理組差異顯著，P<0.001)；但當(dāng)肌酸干預(yù)組中添加了肌酸激酶抑制劑DNFB后，AMPK磷酸化比率回升至0.98，與GSNO處理組無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

肌酸對神經(jīng)退行性疾病以及對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用是近年來的研究熱點(diǎn)之一[1,4-5]。肌酸是機(jī)體內(nèi)源性化合物，水溶性好，且口服高劑量也不會對機(jī)體產(chǎn)生毒副作用，因而具有較好的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值[15]。神經(jīng)興奮性毒性作用是由于一氧化氮及硝化應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制[3]，盡管人們利用不同模型研究肌酸對于興奮性毒性的調(diào)節(jié)作用，但結(jié)果和作用機(jī)制不盡相同，且直接將肌酸用于保護(hù)硝化應(yīng)激的研究鮮有報(bào)道。

Valastro和Wills等小組的研究表明，在帕金森氏癥模型中，肌酸干預(yù)效果顯著[16-17]；但Bender和Kieburtz等小組的獨(dú)立研究分別報(bào)告肌酸在帕金森氏癥模型中無效[18-19]。類似的，在肌萎縮型脊髓側(cè)索硬化癥[10-20]、亨廷頓舞蹈癥[21-22]等研究體系中，使用肌酸作為神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)劑，分別呈現(xiàn)出有效和無效的不同結(jié)果。

關(guān)于肌酸保護(hù)作用的機(jī)制也存在不同主張。Guidi和Fimognari等團(tuán)隊(duì)獨(dú)立報(bào)道，肌酸本身具有抗氧化劑功能，可通過降低活性氧含量保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[8,9]；但Genius和Juravleva等研究組的研究表明，肌酸的加入非但沒有降低氧化應(yīng)激，相反增加了活性氧的產(chǎn)生[6,23]。Royes等還報(bào)道肌酸的神經(jīng)保護(hù)作用體現(xiàn)在其對谷氨酸受體NMDAR的調(diào)控作用上[11]， Klivenyi則主張肌酸的作用主要在于對線粒體“通透性轉(zhuǎn)換孔”及線粒體膜電位的維持上[10]，Cunha等則提出肌酸可以通過激活特殊的促細(xì)胞存活的信號通路實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用[24]。

以上相關(guān)研究中出現(xiàn)的差異性報(bào)道表明，不同的實(shí)驗(yàn)體系復(fù)雜程度不同，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖谳^大差別，而且肌酸本身，的確可能通過多種作用機(jī)制對神經(jīng)細(xì)胞毒性產(chǎn)生影響[6]。為避免過多復(fù)雜因素的干擾，我們利用NO供體GSNO處理SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激體系，模型簡明直接，專注于興奮性毒性作用中最重要的硝化應(yīng)激機(jī)制[3]，也降低了復(fù)雜實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?如動(dòng)物模型、臨床試驗(yàn))中的不可控因素影響[6]，方便闡明問題。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，利用1000 μmol/L GSNO處理SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞活力顯著下降到對照組64.65%左右(圖1，圖3)，且通過GSNO處理的時(shí)間曲線確定24 h(細(xì)胞活力降低至60.74%)為較合適的刺激時(shí)間(圖1)。研究結(jié)果表明，在上述刺激條件下，肌酸可以對神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出較明顯的保護(hù)作用(圖3)，而當(dāng)GSNO濃度過高、處理時(shí)間過久，肌酸的保護(hù)作用則將難以體現(xiàn)。

部分文獻(xiàn)報(bào)道表明，肌酸可能通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)細(xì)胞保護(hù)作用，如肌酸作為抗氧化劑[8,9]、肌酸影響NMDAR受體[11]、肌酸調(diào)節(jié)線粒體通透性及膜電位等[10]，本研究在單純的硝化應(yīng)激細(xì)胞模型中未能對上述機(jī)制加以驗(yàn)證。我們的結(jié)果顯示，5 mmol/L肌酸處理能夠顯著提升硝化應(yīng)激壓力下的神經(jīng)細(xì)胞活力(圖2，圖3)，但當(dāng)肌酸激酶活性被抑制后(DNFB處理)，肌酸的保護(hù)作用幾乎完全消失(圖3)，肌酸對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)作用也表現(xiàn)出一致性的結(jié)果(圖4)。上述發(fā)現(xiàn)提示，在我們的模型條件下，肌酸的神經(jīng)保護(hù)作用可能主要是通過肌酸激酶催化，提高了胞內(nèi)磷酸肌酸的荷載，使細(xì)胞處于高荷能狀態(tài)，能夠抵御硝化應(yīng)激下的能量排空損傷實(shí)現(xiàn)的。如果肌酸激酶失去活性，肌酸的保護(hù)作用便完全無法發(fā)揮(圖3)，因此，在簡單的硝化應(yīng)激細(xì)胞模型中，肌酸主要是通過能量緩沖作用保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，而文獻(xiàn)報(bào)道中提到的其他肌酸保護(hù)機(jī)制可能不是其在本模型下的優(yōu)勢作用途徑。

進(jìn)一步，我們檢測了細(xì)胞內(nèi)的直接能量供體ATP的含量。結(jié)果顯示，硝化應(yīng)激條件下肌酸預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)的ATP含量顯著高于非肌酸干預(yù)組(圖5)。另外，通過檢測細(xì)胞內(nèi)的能量指標(biāo)“傳感器”AMPK的磷酸化水平，也表明肌酸干預(yù)組的確顯著抑制了AMPK的磷酸化(圖6)，表明肌酸處理有效保護(hù)了硝化應(yīng)激條件下的細(xì)胞能量供給。

綜上所述，在一氧化氮供體引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞硝化應(yīng)激條件下，肌酸能夠有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞活力，其保護(hù)機(jī)制主要是通過肌酸激酶機(jī)制提高神經(jīng)細(xì)胞能量荷載以抵御能量應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。值得注意的是，在不同的神經(jīng)興奮性毒性模型中報(bào)道的肌酸作用機(jī)制存在差異，這可能與具體模型中的“復(fù)雜”影響因素相關(guān)。例如，當(dāng)機(jī)體衰老導(dǎo)致肌酸激酶活性降低[25]，或者當(dāng)模型中的肌酸激酶氧化失活時(shí)[6]，肌酸的保護(hù)作用無法通過能量保護(hù)機(jī)制發(fā)揮，此時(shí)肌酸的其他保護(hù)機(jī)制可能會得以凸顯。因而，在研究肌酸的神經(jīng)保護(hù)作用中，把各種簡單實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭庇^明了的優(yōu)點(diǎn)與復(fù)雜研究體系整合多種機(jī)制的優(yōu)勢相結(jié)合，將大大促進(jìn)人們對肌酸作用機(jī)制的認(rèn)識，并能促進(jìn)肌酸的臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用。