小擬南芥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及NHX2基因的克隆與表達(dá)

孫琦，黃薇，劉芳，金玉環(huán)，肖建旺，黃先忠

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,特色植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832003)

植物在生長(zhǎng)過程中不斷面臨著各種生物和非生物因素的威脅，鹽脅迫已成為影響全球農(nóng)作物生產(chǎn)的主要非生物因素之一[1-5]。鈉離子的過量積累造成細(xì)胞膜透性增加、蛋白功能紊亂、有毒物質(zhì)積累及氧化損傷等，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[6-7]。植物通過不斷適應(yīng)高鹽的環(huán)境而進(jìn)化出了一些有效的策略以保證生存[8-10]。在細(xì)胞水平上，通過將Na+有效分隔到液泡和其他細(xì)胞器官中以及將Na+從根部排出是避免細(xì)胞質(zhì)Na+濃度過高和維持細(xì)胞質(zhì)K+/Na+比值的有效機(jī)制[11-13]。

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transport protein)是膜蛋白的一大類，介導(dǎo)生物膜內(nèi)外的化學(xué)物質(zhì)及信號(hào)的交換。因脂質(zhì)雙分子層在細(xì)胞或細(xì)胞器周圍形成了一道疏水屏障，導(dǎo)致大部分親水性化合物，如糖、氨基酸、離子等都需要特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的幫助來通過疏水屏障。因此，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、代謝產(chǎn)物釋放以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛的細(xì)胞活動(dòng)中起著重要的作用[14]。已有研究[15]表明植物體內(nèi)存在多個(gè)與Na+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白，如液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX)和細(xì)胞質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS)。液泡膜NHX主要行使Na+在液泡中區(qū)域化的功能，在提高植物耐鹽性方面發(fā)揮了重要作用[16]。He等[17]將擬南芥AtNHX1轉(zhuǎn)入棉花后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因能在高濃度NaCl條件下正常生長(zhǎng)。Wu等[18]將水稻液泡型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsNHX1基因轉(zhuǎn)入獐毛中，轉(zhuǎn)基因獐毛植株能夠在350 mM NaCl處理10周后正常存活。另外，過量表達(dá)NHX基因在轉(zhuǎn)基因植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)[19]，番茄(Lycopersiconesculentum)[20]，茄果(Solanumpennellii)[21]和水稻(Oryzasativa)[2]中也證實(shí)了耐鹽性的改善。

十字花科短命植物小擬南芥(Arabidopsispumila)，是十字花科擬南芥的近源物種，主要生長(zhǎng)在干旱少雨、土壤鹽堿化嚴(yán)重的新疆的北部，具有耐鹽堿、耐干旱等特點(diǎn)[22]。近年來，我們從小擬南芥中克隆了一些抗逆基因[23-29]，但目前對(duì)于小擬南芥NHX2基因的克隆還沒有研究，其響應(yīng)鹽堿脅迫的機(jī)制還不清楚。

近年來利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定耐鹽相關(guān)的基因及功能分析，更好的解析了植物的耐鹽機(jī)制[30-31]。前期我們利用二代和三代測(cè)序技術(shù)測(cè)序了小擬南芥響應(yīng)高鹽脅迫的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)了8075個(gè)差異表達(dá)基因，初步分析了小擬南芥的鹽適應(yīng)機(jī)制[32]。本研究中，我們基于小擬南芥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出了1157個(gè)鹽脅迫下差異表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并通過K均值(K-means)方法對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行聚類，分析了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在20個(gè)子聚類中的表達(dá)特征，從上調(diào)表達(dá)的子聚類中篩選并克隆了一個(gè)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ApNHX2。本研究所獲得了差異表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，為今后深入研究小擬南芥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在耐鹽性方面的作用提供了理論依據(jù)，為探索短命植物適應(yīng)環(huán)境的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

新疆小擬南芥種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。種子萌發(fā)使用1/2 MS固體培養(yǎng)基。種子消毒參照文獻(xiàn)[23]所述方法進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小擬南芥脅迫處理、總RNA的提取和cDNA的合成

小擬南芥種子經(jīng)滅菌后均勻播種在1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃春化處理3 d后，放置于長(zhǎng)日照光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗,溫度為22 ℃)。將生長(zhǎng)2周后的小擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至含250 mM NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上分別處理0、0.5、3、6、12、24和48 h后收集材料。另外收集小擬南芥成熟植株的根、莖、葉、花以及果莢組織材料。采用TIANGEN公司的RNA prep pure Plant Kit試劑盒按照說明書提取所有樣品的RNA。根據(jù)北京百泰克公司的M-MLV Reverse Transcriptase合成cDNA模板第一鏈。

1.2.2 小擬南芥響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分析

根據(jù)七大數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swiss-prot，KEGG，GO)的基因功能注釋結(jié)合TransportDB2.0(http://www.membranetransport.org/transportDB2/index.html/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以transport為關(guān)鍵詞在小擬南芥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的8075個(gè)差異表達(dá)基因功能注釋信息文件[32]中手動(dòng)查找轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，按功能進(jìn)行細(xì)化分類。將查找到的所有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在基因表達(dá)量注釋信息文件中進(jìn)行搜素，記錄每個(gè)基因在鹽脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量，以FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced，F(xiàn)PKM：每百萬(wàn)堿基對(duì)每千堿基轉(zhuǎn)錄物序列的預(yù)期片段數(shù))值表示。利用R studio(https://www.rstudio.com/)繪制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)熱圖。

對(duì)篩選得到的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因以基因的相對(duì)表達(dá)水平值log2(ratios)進(jìn)行K-means聚類分析并統(tǒng)計(jì)分布在每個(gè)subcluster中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的數(shù)量。對(duì)于每個(gè)基因來說ratios為該基因在樣品2的FPKM與該基因在樣品1的FPKM值的比值。采用相應(yīng)的距離算法計(jì)算每個(gè)基因之間的距離，根據(jù)基因的相對(duì)距離遠(yuǎn)近分成不同的subcluster，從而實(shí)現(xiàn)聚類。

1.2.3 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的篩選

根據(jù)K-means聚類分析得到的20個(gè)subcluster中，發(fā)現(xiàn)有一類整體趨勢(shì)表現(xiàn)為上調(diào)的K subcluster，查找分布于該K subcluster中的基因表達(dá)量log10(FPKM+1)值，利用R studio(https://www.rstudio.com/)繪制熱圖，以直觀分析各個(gè)基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)特征。將分布于該上調(diào)聚類中的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列在CDS預(yù)測(cè)信息文件中查找編碼區(qū)序列，對(duì)每1條基因在tair數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)中進(jìn)行Blast比對(duì)，并記錄比對(duì)后的結(jié)果。根據(jù)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因中有1條與擬南芥AtNHX2基因序列相似性極高的同源基因ApNHX2，在鹽脅迫處理后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著上調(diào)。

1.2.4ApNHX2基因的克隆和測(cè)序

使用DNAStar分析ApNHX2完整開放閱讀框(ORF)，根據(jù)ORF利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物ApNHX2-F和ApNHX2-R，在兩端分別加上KpnI和XbaI酶切位點(diǎn)(表1)。以250 mM NaCl脅迫處理12 h后的2周大的小擬南芥幼苗cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在20 μL的反應(yīng)體系中加入10×PCR Buffer 2 μL，dNTP 1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 2 μL，Ex Taq (TaKaRa)酶0.3 μL，ddH2O 13.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共38個(gè)循環(huán)，終延伸為72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在1% (w/v)的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物利用凝膠回收試劑盒回收純化后連接到pMD19-T(TaKaRa)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取單克隆于液體LB培養(yǎng)基中37 ℃、200 rpm下振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒交由北京華大基因公司測(cè)序。

1.2.5 ApNHX2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析與進(jìn)化樹構(gòu)建

利用TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析該蛋白的跨膜區(qū)。利用NCBI的Blastp程序檢索ApNHX2的同源蛋白，氨基酸序列的多重比對(duì)采用Clustal X2.0程序完成，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中用Neighbor-Joining方法進(jìn)行1000次Bootstrap分析[33]。

1.2.6ApNHX2基因的組織表達(dá)分析

采用qRT-PCR進(jìn)行基因的組織表達(dá)分析。ApNHX2基因引物為qRT-ApNHX2-F和qRT-ApNHX2-R，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因[35]，引物為GAPDH-F和GAPDH-R (表1)。qRT-PCR采用Fast SYBR Mixture試劑盒(康為世紀(jì))，利用美國(guó)ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technologies,Foster City,CA,USA)進(jìn)行擴(kuò)增。在10 μL的反應(yīng)體系中加入cDNA模板2 μL，UltraSYBR Mixture 5 μL，ROX 0.2 μL，正反向引物(10 μM)各0.2 μL，ddH2O 2.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃讀取熒光值。檢測(cè)每份樣品的ApNHX2基因和GAPDH內(nèi)參基因的Ct值，每份樣品3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析[23]。采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan法進(jìn)行多組樣本之間的差異顯著性分析(P<0.05)[32]。

表1 本研究所用的PCR引物序列Tab.1 PCR primers used in this study

注：下劃線代表限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。

1.2.7 過量表達(dá)載體構(gòu)建

將測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD19-T∶ApNHX2以及載體pCAMBIA2300-CaMV35S-OCS使用KpnI和XbaI進(jìn)行雙酶切，電泳檢測(cè)后回收目的片段。利用T4連接酶4 ℃下過夜連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃下倒置培養(yǎng)14～16 h。挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜培養(yǎng)，通過抽提質(zhì)粒和進(jìn)行酶切驗(yàn)證，利用1.2% (w/v)的瓊脂糖電泳檢測(cè)，構(gòu)建35S∶ApNHX2載體。將鑒定正確的質(zhì)粒，用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將鑒定正確的單克隆菌液甘油保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選小擬南芥中耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

根據(jù)七大數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋從8075個(gè)差異表達(dá)基因中找到1157個(gè)耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，基因表達(dá)熱圖分析表明在鹽脅迫的早期階段(0.5～6 h)，一些基因被快速激活上調(diào)表達(dá)，一些基因在脅迫的后期(12～48 h)被激活上調(diào)表達(dá)，而另外一些基因則表現(xiàn)為隨脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量持續(xù)上升(圖1 A)。將1157個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因按功能分為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporter)；Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Calcium-transporter)；K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Potassium transporter)；Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sodium- transporter)以及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sugar transporter)等(圖1B)。統(tǒng)計(jì)主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的數(shù)量包括24個(gè)Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，36個(gè)K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，30個(gè)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，9個(gè)Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因以及ATPase相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族H+-PPase、F-ATPase和P-ATPase中所含基因的數(shù)量分別為70、2和80個(gè)，從中得出P-ATPase家族中所包含的基因數(shù)量最多，而Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因數(shù)量最少(圖1B)。

A：1157個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在250 mM NaCl脅迫不同時(shí)間的表達(dá)熱圖；B：主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的數(shù)量分布情況圖1 1157個(gè)鹽脅迫差異表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的分析Fig.1 Analysis of the 1157 differently expressed transporter genes under salt stress

2.2 K-means聚類方法分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

K-means聚類分析結(jié)果顯示，1157個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分布于20個(gè)K subcluster中，其中在K6，K9以及K15子聚類中的基因數(shù)量分布較多，分別為172，193以及190個(gè)，而在K5子聚類中基因分布最少，數(shù)量為5個(gè)(圖2 A)。根據(jù)log2(ratio)值繪制的差異基因表達(dá)量聚類圖表明分布于K6子聚類中的基因相對(duì)表達(dá)水平整體表現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)(圖2B)。通過查找分布于K6子聚類中的基因表達(dá)量log10(FPKM+1)值所繪制的熱圖結(jié)果顯示，經(jīng)鹽脅迫處理后的基因一部分表現(xiàn)為早期(0.5～12 h)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，一部分表現(xiàn)為后期(12～48 h)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，而有一部分基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)(圖2C)。有一個(gè)差異表達(dá)明顯的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ApNHX2分布在K6子聚類中，隨著處理時(shí)間的增加，ApNHX2基因的表達(dá)量逐漸升高且在處理12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，之后則表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，但ApNHX2基因在6個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均高于對(duì)照條件下(0 h)的表達(dá)量(圖2D)，暗示該基因在小擬南芥耐鹽反應(yīng)中起著重要作用。

A：1157個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在20個(gè)子聚類中的數(shù)量分布：B：K6差異基因表達(dá)量聚類圖；C：K6子聚類中172個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 響應(yīng)250 mM NaCl脅迫的表達(dá)熱圖，箭頭所指表示差異表達(dá)顯著的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ApNHX2； D：ApNHX2基因在250 mM NaCl脅迫不同時(shí)間的表達(dá)圖2 K-means聚類分析Fig.2 K-means clustering analysis

2.3 ApNHX2基因的克隆及生物信息學(xué)分析

利用引物ApNHX2-F和ApNHX2-R擴(kuò)增得到約1.6 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果結(jié)合全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明ApNHX2全長(zhǎng)為2299 bp，ORF大小為1626 bp，推測(cè)其編碼541個(gè)氨基酸(圖3)。ApNHX2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ApNHX2是一個(gè)典型的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，其中包括2個(gè)未完全跨膜區(qū)(圖4)。

2.4 ApNHX2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索ApNHX2的同源蛋白序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建了小擬南芥ApNHX2與擬南芥(Arabidopsisthaliana)，野甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.oleracea)，歐洲油菜(Brassicanapus)，鹽角草(Salicorniaeuropaea)，木薯(Manihotesculenta)，玫瑰(Rosarugosa)，醉蝶花(Tarenayahassleriana)，榴蓮(Duriozibethinus)，濱藜(Atriplexhalimus)，橡膠樹(Heveabrasiliensis)，白樺(Betulaplatyphylla)以及胡楊(Populuspruinosa)中NHX2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果表明，ApNHX2與擬南芥以及歐洲油菜等的NHX2蛋白進(jìn)化關(guān)系均較近，與擬南芥NHX2屬于同一進(jìn)化分支。

2.5 ApNHX2基因的組織表達(dá)分析

組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，ApNHX2基因在小擬南芥各組織中均有表達(dá)，在花中表達(dá)量最高，在其它組織中表達(dá)量均較低且無(wú)明顯差異(圖6)。

2.6 植物過量表達(dá)載體35S∶ApNHX2的構(gòu)建

經(jīng)KpnI和XbaI酶切的pMD19-T∶ApNHX2質(zhì)粒以及pCAMBIA2300-p35s-OCS載體用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，質(zhì)粒1和質(zhì)粒2酶切后條帶均與目的基因大小一致，均在接近1600 bp處，說明目的片段已連接到表達(dá)載體上，成功構(gòu)建植物過量表達(dá)載體35S∶ApNHX2(圖7 A)。最終載體35S∶ApNHX2含有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子，章魚堿合成酶基因OCS終止子及植物篩選標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTⅡ (圖7B)。將35S∶ApNHX2載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，通過菌液PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出約1600 bp長(zhǎng)度的條帶，表明該載體已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)化菌GV3101(圖7C)。

圖3 ApNHX2的核苷酸序列及推測(cè)氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and putative amino acid sequence of ApNHX2

紅色框代表2個(gè)未完全跨膜區(qū)；綠色框代表10個(gè)強(qiáng)跨膜區(qū)圖4 ApNHX2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of transmembrane structure of ApNHX2

▲代表本研究克隆的ApNHX2蛋白；圖中分支點(diǎn)的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1000次 重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比；標(biāo)尺代表每一位點(diǎn)堿基替換率圖5 植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX2的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of Na+/H+ antiporter NHX2 from different plants

小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖6 qRT-PCR驗(yàn)證的ApNHX2基因在在 根、莖、葉、花和果莢中的表達(dá)Fig.6 Expression pattern of ApNHX2 in different tissues of Arabidopsis pumila

A：ApNHX2基因的質(zhì)粒酶切檢測(cè)，M為marker Ⅲ，1,2為35S∶ApNHX2；B：35S∶ApNHX2載體模式圖；C：ApNHX2基因的 農(nóng)桿菌PCR檢測(cè)，M為marker Ⅲ，1為ApNHX2陽(yáng)性對(duì)照，2-5為ApNHX2，6為ApNHX2陰性對(duì)照?qǐng)D7 過表達(dá)載體35S∶ApNHX2的構(gòu)建Fig.7 Construction of plant overexpression vector 35S∶ApNHX2

3 討論

轉(zhuǎn)錄組分析在闡明各種生長(zhǎng)和發(fā)育過程以及應(yīng)激條件下基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性中起著重要作用[35]。迄今為止的大多數(shù)研究[36-38]都報(bào)道了由二代測(cè)序(second-generation sequencing,SGS)技術(shù)產(chǎn)生的短讀序列用于分析植物組織的轉(zhuǎn)錄組，但是這些序列阻止了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本組裝，降低了序列組裝的準(zhǔn)確性，使生物信息學(xué)分析變得困難。單分子實(shí)時(shí)(single-molecule real-time,SMRT)測(cè)序平臺(tái)提供的第三代測(cè)序(third-generation sequencing,TGS)技術(shù)可以克服上述限制，由于其長(zhǎng)讀取而被廣泛用于基因組測(cè)序[39-40]。盡管TGS具有相對(duì)較高的錯(cuò)誤率，但通過使用短而高精度的SGS讀數(shù)進(jìn)行校正可以克服這一缺點(diǎn)[37-38]。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，我們結(jié)合SGS和TGS技術(shù)測(cè)序以產(chǎn)生更完整的A.pumila轉(zhuǎn)錄組[32]，作為本研究的基礎(chǔ)。

通過在小擬南芥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中手動(dòng)查找和篩選，從8075個(gè)差異表達(dá)基因中共整理出1157個(gè)功能注釋為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，包括24個(gè)小擬南芥Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(圖1)。目前隨著擬南芥和楊樹(Populuspruinosa)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作的完成，分析顯示擬南芥中存在10個(gè)Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[41]，楊樹中存在11個(gè)Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[42]，研究者們對(duì)植物中的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因有了進(jìn)一步了解。本研究篩選出的小擬南芥Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因數(shù)量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過擬南芥和楊樹，因此我們推測(cè)Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在小擬南芥適應(yīng)高鹽環(huán)境中起著重要的作用。

邱生平等[43]采用RT-PCR的方法從水稻中克隆了液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNHX2的全長(zhǎng)cDNA，包含1635 bp的開放閱讀框，編碼544個(gè)氨基酸。李中虎等[44]在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，得到了濱麥(Leymusmollis)液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因LmNHX2的DNA序列，包含1617 bp的開放閱讀框，編碼538個(gè)氨基酸。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到小擬南芥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ApNHX2的cDNA序列，包含1626 bp的全長(zhǎng)開放閱讀框，編碼541個(gè)氨基酸(圖3)。水稻OsNHX2和濱麥LmNHX2的跨膜結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)二者均含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，其中包括2個(gè)未完全跨膜區(qū)[43-44]。本研究對(duì)小擬南芥ApNHX2跨膜結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)與水稻OsNHX2和濱麥LmNHX2具有相似的結(jié)果，含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，其中包括2個(gè)未完全跨膜區(qū)(圖4)。另外，邱生平等[43]通過系統(tǒng)發(fā)育分析表明OsNHX2與液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源關(guān)系較近而與質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源關(guān)系較遠(yuǎn)，這些結(jié)果說明OsNHX2可能是液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。而基于LmNHX2和其他NHX蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹[44]顯示，濱麥LmNHX2與小麥(Triticumaestivum) TaNHX2二者氨基酸序列相似度高達(dá)99%，這與濱麥?zhǔn)切←湹囊吧壏N的關(guān)系相符合。本研究通過系統(tǒng)發(fā)育分析表明ApNHX2與擬南芥NHX2蛋白進(jìn)化關(guān)系較近，屬于同一進(jìn)化分支，這與小擬南芥是擬南芥的野生近緣種的關(guān)系相符合，可推斷出ApNHX2屬于液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖5)。

基因表達(dá)模式的分析對(duì)于功能研究必不可少，組織表達(dá)分析表明ApNHX2在小擬南芥各組織中均有表達(dá)，但在花中表達(dá)量最高且明顯高于其他組織，說明ApNHX2很可能參與到小擬南芥花器官發(fā)育的過程(圖6)。已有研究[15]表明洋芋(Helianthustuberosus) Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HtNHX2的表達(dá)提高了水稻對(duì)鹽度的耐受性。在K+有限的鹽脅迫條件下或一般營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，HtNHX2的表達(dá)增加了水稻籽粒產(chǎn)量，收獲指數(shù)以及總養(yǎng)分吸收[15]。小麥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNHX2的表達(dá)也表現(xiàn)為能提高苜蓿(MedicagoSativa)[45]和大豆(Glycinemax)[46]的耐鹽性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，隨著高鹽脅迫時(shí)間的增加，ApNHX2基因的表達(dá)量逐漸升高且在處理12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，之后表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但ApNHX2基因在6個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均高于對(duì)照條件下(0 h)的表達(dá)量(圖2D)，暗示該基因在小擬南芥耐鹽反應(yīng)中起著重要作用。本研究構(gòu)建了植物過量表達(dá)載體35S∶ApNHX2，并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，我們將進(jìn)一步驗(yàn)證ApNHX2基因功能，為今后深入研究小擬南芥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在耐鹽性方面的作用提供理論依據(jù)。