陸地棉GhBFT1基因的克隆、表達及亞細胞定位分析

李研，劉慧，黃先忠

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，特色植物基因組學(xué)實驗室，新疆 石河子832003)

植物的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding proteins,PEBP)基因家族，主要起著促進或抑制開花和控制株型的作用。PEBP家族包含MOTHEROFFTANDTFL1(MFT)，F(xiàn)LOWERINGLOCUST(FT)，TERMINALFLOWER1(TFL1)3個亞家族[1-3]，其中，F(xiàn)T和TFL1兩個亞家族都是起源于MFT，BROTHEROFFTANDTFL1(BFT)屬于TFL1亞家族，大多數(shù)植物PEBP家族蛋白含有保守的真核生物特異性區(qū)域[4]。目前的研究[5]認為，PEBP蛋白在細胞核中能與一個堿性亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白互作，從而抑制花分生組織基因的表達，起著維持無限生長、抑制開花轉(zhuǎn)變的作用。在動物中PEBP蛋白主要是Raf激酶抑制劑的作用。在很多植物中也發(fā)現(xiàn)了PEBP蛋白，例如擬南芥、金魚草、葡萄、白楊樹、豆科植物、大麥、番茄、水稻、玉米。

植物中的TFL1亞家族基因成員大多具有相似的基因結(jié)構(gòu)，均由4個外顯子和3個內(nèi)含子構(gòu)成[6]，這說明該基因家族在進化中基因結(jié)構(gòu)較為保守。保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)域是FT/TFL1基因家族成員編碼的蛋白所共有，因可在體外結(jié)合磷脂酰乙醇胺而得名，在動植物體內(nèi)廣泛存在[7-9]。開花是一個復(fù)雜的生理過程，受植物內(nèi)部遺傳基因和外部環(huán)境因素的共同誘導(dǎo)和調(diào)控，其中與開花有關(guān)的基因成為調(diào)控成花轉(zhuǎn)變的重要遺傳因子。在PEBP家族基因中FT亞家族基因和BFT1所在的TFL1亞家族基因共同調(diào)控開花轉(zhuǎn)變，目前很多研究顯示FT促進開花，TFL1抑制開花。植物在受到逆境脅迫后通常會提前開花，進入生殖生長階段，因此逆境下調(diào)控開花轉(zhuǎn)變十分重要。BFT能夠在擬南芥中調(diào)控開花就是一條非常重要的途徑，有研究[10]表明擬南芥在正常的條件下進入開花轉(zhuǎn)變階段時，F(xiàn)T就會與FD相互作用來促進AP1的轉(zhuǎn)錄，而受到外源高鹽脅迫時，BFT就會與FT相互競爭FD來抑制AP1的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控擬南芥的開花時間，這一過程需要更多的BFT蛋白，并且在這種高鹽脅迫下，BFT基因介導(dǎo)的FT-FD模型，就可以提供合適的保護機制適應(yīng)光周期途徑并促使植物開花[11]。本研究克隆了GhBFT1基因并對其進行生物信息學(xué)分析以及亞細胞定位和表達模式的分析，以期為該基因后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本氏煙草(N.benthamiana)，棉花新陸早33號品種的不同組織材料：棉花生長1個月的幼苗時期取根部、莖稈、真葉組織，開花時取花瓣、萼片、雄蕊。胚珠材料的取樣時間：開花前3天(-3)、開花當(dāng)天(0)、和花后1、3、5、8、12、16、20天。

1.2 方法

1.2.1 棉花DNA和RNA的提取

選取陸地棉品種新陸早33成熟葉片為材料，液氮速凍后采用CTAB法進行基因組DNA的提取，使用植物RNA提取試劑盒提取棉花總RNA[12]。

1.2.2 陸地棉GhBFT1基因的克隆

根據(jù)全基因組分析獲得陸地棉BFT1基因的開放讀碼框(Open reading frame,ORF)，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計好擴增引物(表1)。ORF擴增引物分別為：KpnI-GhBFT1F和BamH I-GhBFT1R，由華大基因公司合成。以提取棉花的DNA為模板，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，將大小正確的啟動子DNA 片段以快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收并克隆到中間載體pMD18-T上，之后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒然后經(jīng)過酶切鑒定。

1.2.3 陸地棉BFT1基因的生物信息學(xué)分析

棉花BFT1基因的查找與分析參照魏艷玲等[13]的方法，用MegAlign程序比對分析，得到基因結(jié)構(gòu)完整的CDS序列，并找到最大ORF。測序結(jié)果使用DNAstar軟件分析，使用Clustal W和GeneDoc等軟件對所獲得的蛋白氨基酸序列進行比對分析。利用SWISS-MODEL網(wǎng)站對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。利用NCBI網(wǎng)站中的blastn工具，以擬南芥的BFT/TFL1家族基因成員的氨基酸序列，搜索其他物種基因組上的BFT/TFL1家族基因成員，下載序列后，利用MEGA5.1軟件對各物種中的BFT/TFL1家族基因編碼的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，用Neighbor-Joining法構(gòu)建進化樹，1000次重復(fù)。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析陸地棉GhBFT1基因的表達情況

根據(jù)GhBFT1的ORF序列設(shè)計基因表達分析的特異引物GhBFT1-RT-F和GhBFT1-RT-R，內(nèi)參基因使用棉花的Ubiquitin7(GenBanK登錄號為DQ116441)基因，引物名稱UBQ7-F和UBQ7-R(表1)。參照鄭麗潔等[14]采用qRT-PCR來分析基因表達，分析溶解曲線，檢測每份樣品的目的基因和UBQ7內(nèi)參基因的Ct值，每種樣品進行3次PCR重復(fù)，采用2-ΔCt法分析試驗數(shù)據(jù)，先分別計算出每組的ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，再根據(jù)ΔCt值求出2-ΔCt以及標準誤，使用t測驗進行差異性檢驗分析，采用Excel2010軟件分析數(shù)據(jù)和作圖。

表1 本研究設(shè)計引物名稱及信息Tab.1 Primers designed and used in this experiment

1.2.5 植物融合表達載體的構(gòu)建及煙草的轉(zhuǎn)化

以測序正確的pMD18-T∶GhBFT1質(zhì)粒為模板，PCR擴增去除終止密碼子TGA的GhBFT1基因片段，反應(yīng)體系和程序參照上面的方法。酶切鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)測序分析有無發(fā)生堿基的改變，將測序正確質(zhì)粒經(jīng)KpnI和BamH I雙酶切，回收片段，同時用同樣的雙酶切帶有GFP的pCAMBIA2300載體，回收質(zhì)粒大片段。將以上回收產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。將構(gòu)建好的GFP融合表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中。

本氏煙草(N.benthamiana)的瞬時轉(zhuǎn)化，選取生長狀態(tài)良好的煙草進行農(nóng)桿菌侵染，轉(zhuǎn)化前澆透水，活化帶有基因載體的農(nóng)桿菌，離心收集菌體。配制好懸濁液，室溫靜置3 h。侵染時注射器吸取菌液在煙草葉片下表面將菌液注射，3～5 d后切取注射部位在激光共聚焦顯微鏡下觀察。同時以35S∶GFP做為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhBFT1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

GhBFT1基因cDNA的ORF長約500 bp左右(圖1)，經(jīng)克隆測序，分析得出GhBFT1的ORF長度為525 bp，包含起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，比對分析和陸地棉基因組中注釋的來自A亞基因組的基因GhBFT1-A，來自D亞基因組的基因GhBFT1-D分別有99.2%和99.6%的相似性(圖2)。推測ORF編碼174個氨基酸，氨基酸比對分析表明GhBFT1蛋白具有PEBP家族中保守氨基酸位點His88/Asp144 (圖3)。使用SWISS-MODEL網(wǎng)站同源建模法構(gòu)建GhBFT1蛋白三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與TFL1家族蛋白的結(jié)構(gòu)很類似(圖4)，GhBFT1蛋白含有4個反向平行的肽鏈形成一個中心β折疊片，還有其他一些無規(guī)則卷曲的線性骨架。將GhBFT1的氨基酸序列與其它植物BFT蛋白家族進行比對分析，并將棉花BFT基因與其他物種BFT同源基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5),可看出，擬南芥、亞麻薺、油菜的BFT基因進化親緣關(guān)系最為接近，而棉花BFT基因與番木瓜(Caricapapaya)、榴蓮(Duriozibethinus)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)、可可(Theobromacacao)等的基因進化親緣關(guān)系比較接近。BFT基因所處的TFL1亞家族基因在進化上表現(xiàn)出分支相互交錯的現(xiàn)象，沒有根據(jù)親緣系各自聚類，且部分單子葉植物和雙子葉植物的BFT與TFL1同源基因的進化分支雖各自聚成一類，但沒有明顯分界線，說明TFL1亞家族基因的進化相對較快、分化更大，這對基因功能進化的多樣性具有重要意義。

M:DNA分子量marker DL2000圖1 GhBFT1基因的PCR擴增Fig.1 The PCR product of GhBFT1 gene

2.2 陸地棉GhBFT1基因的組織表達分析

qRT-PCR實驗表明，GhBFT1基因在陸地棉中根、莖、真葉、花瓣、花萼和雄蕊中均有表達(圖6A)，但不同組織中的相對表達量水平顯示出明顯差異：GhBFT1基因在花蕊中表達量最高，其次是根，這2個組織中的表達量明顯高于其他組織；在葉和花萼中表達量中等；在莖和花瓣中表達量較少，并且表達量差異不顯著，說明表達水平相當(dāng)。組織表達分析表明GhBFT1基因可能在棉花根的發(fā)育和花蕊的形成過程中起著更為重要的作用。

雖然GhBFT1基因在棉花根及花蕊中的相對表達水平最為突出，但GhBFT1基因在胚珠和纖維的發(fā)育時期也有表達。分析GhBFT1基因在胚珠發(fā)育不同時期的表達發(fā)現(xiàn)，在開花前3天(-3)以及開花3天(3)后，GhBFT1都處于比較低的表達水平，而在開花當(dāng)天(0)、花后1天(1)表達水平都相對較高，開花后基因表達逐漸降低(圖6B)，說明GhBFT1基因可能在根和雄蕊發(fā)育過程中具有重要作用，同時參與了棉花纖維發(fā)育及胚珠發(fā)育。

圖3 GhBFT1基因編碼的氨基酸的序列比對分析Fig.3 The amino acids alignment of GhBFT1 gene

圖4 GhBFT1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Three-dimensional structure prediction of GhBFT1 protein

2.3 亞細胞定位分析

2.3.135S∶GhBFT1-GFP融合表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

載體含有卡那霉素抗性基因nptII和花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(圖7A)。將構(gòu)建好的載體酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物除載體片段外，另有一約500 bp的條帶(圖7B)，是GhBFT1基因去除終止子的片段，說明35S∶GhBFT1-GFP質(zhì)粒構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)化35S∶GhBFT1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)菌落PCR擴增，產(chǎn)物電泳顯示也擴增出了預(yù)期大小的條帶(圖7C)，說明35S∶Gh-BFT1-GFP載體轉(zhuǎn)化成功，可以用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化和亞細胞定位研究。

圖5 不同植物基因組中的BFT基因編碼的氨基酸序列進化分析Fig.5 Evolutionary analysis of BFT genes coding amino acids in various plant genomes

A：組織表達分析；B：纖維不同發(fā)育時期的表達分析；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著，數(shù)字代表開花天數(shù)圖6 GhBFT1基因的表達分析Fig.6 Gene expression analysis of GhBFT1

A:35S∶GhBFT1-GFP酶切鑒定；B:菌液PCR驗證；C:融合表達載體的模式圖圖7 35S∶GhBFT1-GFP植物融合載體構(gòu)建Fig.7 Plant fusion vector construction of 35S∶GhBFT1-GFP

2.3.2 GhBFT1蛋白的亞細胞定位

將35S∶GhBFT1-GFP使用瞬時轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至本氏煙草葉片中，使其基因在煙草的葉表皮細胞中表達，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葉表皮細胞的細胞質(zhì)和細胞核中有綠色熒光信號，與GFP空白對照結(jié)果一致(圖8)。GFP蛋白在植物細胞的細胞質(zhì)和細胞核中表達，說明GhBFT1蛋白是細胞質(zhì)和細胞核定位的蛋白。

圖8 GhBFT1-GFP融合蛋白在本氏煙草葉表皮細胞中的亞細胞定位分析Fig.8 Subcellular location of GhBFT1-GFP fusionprotein in leaf epidermal cells in N.benthamiana

3 討論

本研究從陸地棉新陸早33中克隆的GhBFT1基因，比對分析表明屬于D亞基因組，氨基酸分析表明二者都具有PEBP家族中區(qū)分FT和TFL1蛋白家族的保守氨基酸His88/Asp144。GhBFT1基因具有PEBP家族中的保守結(jié)構(gòu)，同樣具有保守的蛋白序列。GhBFT基因與一些物種中的CEN基因進化距離接近，說明了棉花TFL1旁系同源基因進化中的多樣性。進化分析表明很多物種中含有多個FT/TFL1旁系同源基因，如大豆的FT/TFL1基因家族，并且FT亞家族基本聚成一類，而TFL1會聚類成多個分支，說明TFL1-like進化上更為自由。結(jié)合實驗室的前期研究表明，棉花TFL1-like亞家族基因具有更豐富的進化潛力。

蛋白亞細胞定位分析表明GhBFT1同其它植物的PEBP蛋白一樣位于細胞核和細胞質(zhì)中。很多植物的PEBP同源蛋白都定位于細胞核和細胞質(zhì)中，如擬南芥的FT[15]、煙草的4個FT蛋白[16]、菊花CsTFL1[17]。很多研究表明，F(xiàn)T/TFL1都能與轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白互作，促進或抑制下游控制花分生組織活性基因的表達，從而促進或抑制成花轉(zhuǎn)變。

基因表達分析發(fā)現(xiàn)陸地棉GhBFT1基因在根、雄蕊中的表達量較高，在葉、花萼中表達量中等，在莖、花瓣中表達量較少，表明基因可能在不同組織中的表達模式不同。此外基因在胚珠和纖維發(fā)育的不同發(fā)育時期的表達分析表明，開花前3天基因開始表達，在開花當(dāng)天和花后第1天的胚珠中表達水平最高，且呈現(xiàn)開花后逐步降低的水平表現(xiàn)，而在開花3天后都處于較低的表達水平，說明基因可能在根和雄蕊的發(fā)育、胚珠發(fā)育的起始階段具有重要作用。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的BFT基因在地上部分的分生組織如蓮座葉、莖生葉及花中表達較高，在地下部分如根和再生頂端中表達較低。BFT基因所在的PEBP家族基因可以調(diào)控開花轉(zhuǎn)變，能促進開花或抑制開花，推測GhBFT1也可以參與調(diào)控開花相關(guān)的代謝通路。此外，GhBFT1基因是否具有晝夜節(jié)律表達、是否參與調(diào)控纖維的發(fā)育、其詳細的功能及生物機理等方面都需要進一步深入研究。