短命植物小擬南芥光周期調(diào)控基因CONSTANS的克隆與表達(dá)特征分析

劉芳，肖衡，金玉環(huán)，孫琦，黃薇，康凱程，黃先忠

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/特色植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003)

在植物生命周期中，光是影響植物從營(yíng)養(yǎng)階段向生殖階段過(guò)渡的重要的環(huán)境因素之一。植物可以感知外部環(huán)境刺激(光信號(hào))以預(yù)測(cè)環(huán)境的變化，并在適當(dāng)條件下精確地調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。研究表明，CONSTANS(CO)是光周期途徑中控制開(kāi)花的關(guān)鍵基因[2-3]，CO蛋白受生物鐘和光信號(hào)的嚴(yán)格控制[4-6]，是位于生物鐘和開(kāi)花時(shí)間基因之間監(jiān)測(cè)日照時(shí)間長(zhǎng)度的必要元件，通過(guò)整合光和生物鐘信號(hào)然后激活下游基因表達(dá)從而誘導(dǎo)植物開(kāi)花[7]。

CO蛋白屬于一類鋅指轉(zhuǎn)錄因子，主要包括3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：一個(gè)與核定位有關(guān)的CCT (CO、CO-Like和TOC1)結(jié)構(gòu)域，另外兩個(gè)擁有特殊結(jié)構(gòu)CX2CX16CX2C(X代表任意氨基酸)并參與調(diào)節(jié)蛋白互作的B-box結(jié)構(gòu)域[8-10]。CO基因功能研究備受關(guān)注，發(fā)現(xiàn)在已研究不同物種中存在很多CO同源基因，擬南芥中有17個(gè)CO同源基因[10]，水稻(Oryzasativa)中有16個(gè)[11]，油菜(Brassicanapus)中有4個(gè)[12]，大麥(Hordeumvulgare)中有9個(gè)[11]，小麥(Triticumaestivum)中存在3個(gè)CO基因[13]，小立碗蘚(Physcomitrellapatens)中有3個(gè)CO基因[14]，大豆(Glycinemax)中有26個(gè)CO基因[15]，陸地棉(Gossypiumhirsutum)中鑒定出42個(gè)CO基因[16]。

研究表明，CO基因家族在植物中調(diào)控多方面的生物學(xué)過(guò)程：陸地棉GhCOL1能夠參與植物開(kāi)花調(diào)控[16]，葡萄(Vitisvinifera)VvCOL1與植物種子休眠有關(guān)[17]，美洲黑楊(Populusdeltoides)CO1和CO2能夠參與植物的形態(tài)發(fā)育[18]，擬南芥AtCOL1、歐洲云杉(Piceaabies)PaCOL1和牽?；?Pharbitisnil)PnCOL1能夠調(diào)節(jié)植物晝夜節(jié)律[19-21]，香蕉(Musanana)MaCOL1能夠響應(yīng)非生物和生物脅迫[22]。

小擬南芥(Arabidopsispumila)屬于十字花科早春短命植物，主要分布在新疆北疆，適應(yīng)新疆特殊氣候條件，具有一定的耐逆性[23-24]。小擬南芥是擬南芥的近緣種，但是它比擬南芥更能適應(yīng)外界的各種環(huán)境脅迫[23,25]，因此具有良好的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。前期我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功克隆了一些抗逆基因[26-32]；構(gòu)建了小擬南芥表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)[26]；利用二代和三代測(cè)序技術(shù)完成了對(duì)小擬南芥響應(yīng)鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，獲得59, 328個(gè)unigenes，包含8075個(gè)差異表達(dá)基因[24]。雖然COL1基因在很多物種中已被廣泛研究，但是迄今為止對(duì)于小擬南芥COL1的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。CO家族基因在小擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中是否與其他物種一樣參與光周期調(diào)控開(kāi)花等功能尚不清楚。因此，本研究基于小擬南芥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)克隆了小擬南芥ApCOL1基因，利用生物信息學(xué)分析其結(jié)構(gòu)特征，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)研究了基因的晝夜節(jié)律性表達(dá)、組織特異性表達(dá)和響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)特征。本研究為今后深入分析小擬南芥CO基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用到的植物小擬南芥(A.pumila)種子為本實(shí)驗(yàn)保存。小擬南芥種子滅菌和植株室內(nèi)的培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[26]中的方法。

1.2 方 法

1.2.1 材料處理

脅迫處理：250 mmol/L NaCl脅迫處理方法參照文獻(xiàn)[24]中的方法。生長(zhǎng)15 d的小擬南芥幼苗分別放入4 ℃培養(yǎng)箱、40 ℃培養(yǎng)箱和含有20% PEG-6000的1/2 MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行低溫、高溫和干旱處理。脅迫處理0 h、12 h、24 h和48 h后分別收集不同處理的幼苗。

晝夜節(jié)律樣品：小擬南芥幼苗分別在長(zhǎng)日照(LD，16 h光照/8 h黑暗)和短日照(SD，8 h光照/16 h黑暗)條件下生長(zhǎng)25 d，生長(zhǎng)溫度22 ℃，光照條件200 μmol photons/m2/s。光照4 h開(kāi)始第一次取樣，每隔4 h取1次，各取12個(gè)時(shí)間點(diǎn)(共48 h)。

不同組織材料樣品：LD條件下生長(zhǎng)20 d小擬南芥取下胚軸和根組織；在抽苔期(種植后30 d)取葉和莖；在開(kāi)花當(dāng)天取花，在果莢期取長(zhǎng)角果。將以上所有樣品立即在液氮中冷凍后儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小擬南芥總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

用TRIZOL試劑(Invitrogen，CA，USA)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取小擬南芥的總RNA。經(jīng)1.0% (w/v)凝膠電泳和ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA)檢測(cè)總RNA質(zhì)量和濃度，根據(jù)Fermentas公司RevertAlidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA模板制備。

1.2.3 小擬南芥ApCOL1克隆與測(cè)序

我們實(shí)驗(yàn)室前期完成的小擬南芥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[24]，搜索到有1條unigene與擬南芥CO-like家族AtCOL1序列相似性非常高。該基因的ORF設(shè)計(jì)基因特異性引物ApCOL1-1F和ApCOL1-1R (表1)，以小擬南芥的葉cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR體系參照Ex Taq (TaKaRa)說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用凝膠回收試劑盒回收目的基因，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將鑒定正確的菌液送往北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究中所使用的引物Tab.1 PCR primers used in this study

1.2.4ApCOL1基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov) BLASTX對(duì)ApCOL1蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)軟件對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；Phyre2 Server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)軟件進(jìn)行蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用ExPASy網(wǎng)站在線工具ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和疏水性等理化性質(zhì)的分析。利用Clustal X 2.0程序軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建與分析，其中用Neighbor-Joining進(jìn)行1000次Boot-strap分析[33]。

1.2.5 小擬南芥ApCOL1的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析基因晝夜節(jié)律表達(dá)、組織表達(dá)及脅迫表達(dá)特征。基因特異引物為qApCOL1-F和qApCOL1-R，內(nèi)參引物為GAPDH-F和GAPDH-R (表1)。qRT-PCR采用Fast SYBR Master Mixture試劑盒(康為世紀(jì))，美國(guó)ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technologies, Foster City, CA, USA)進(jìn)行擴(kuò)增。10 μL的反應(yīng)體系中，包括cDNA模板2 μL，F(xiàn)ast SYBR Green Master Mixture 5 μL，ROX 0.2 μL，上下游引物各0.2 μL，RNase-Free Water補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，60 ℃讀取熒光值。檢測(cè)每份樣品的目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，每份樣品3次PCR重復(fù)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析[34]，利用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 小擬南芥CO同源基因的克隆

基于小擬南芥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基因功能注釋，篩選了一個(gè)CO同源基因并命名為ApCOL1。為了獲得小擬南芥ApCOL1基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列，以小擬南芥的葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增獲得目的片段，PCR產(chǎn)物大小約為1000 bp (圖1)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與測(cè)序結(jié)果(圖1，圖2)，表明該序列全長(zhǎng)為1320 bp，ORF大小為1071 bp，推測(cè)編碼氨基酸356個(gè)(圖2)。

M：分子量maker，DL2000；1：陰性對(duì)照； 2：以小擬南芥葉片cDNA為模板的PCR產(chǎn)物；圖1 ApCOL1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of ApCOL1 gene

紅色橫線表示起始密碼子；* 表示終止密碼子圖2 ApCOL1核苷酸序列及推測(cè)氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of ApCOL1 and the putative amino acid sequence

2.2 生物信息學(xué)分析

保守結(jié)構(gòu)域分析表明ApCOL1具有CO-like家族典型特征(圖3)。ApCOL1蛋白的氨基末端有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域B-box 1 (C-X2-C-X8-C-X2-D-X-A-X-L-C-X2-C-D-X3-H-X8-H)和B-box 2 (C-X2-C-X3-P-X4-C-X2-D-X3-L-C-X2-C-D-X3-H-X8-H)，以及在羧基末端存在一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域大約由43個(gè)氨基酸組成(圖4 A)。ApCOL1與擬南芥AtCOL1的氨基酸序列相似性為86.8%，B-box和CCT結(jié)構(gòu)的殘基相似性分別為93.8%和92.9%。選取17種不同物種包括擬南芥、琴葉擬南芥、亞麻芥(Camelinasativa)、甜菜(Betavulgaris)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)、大麥、芥菜(Brassicajuncea)、黑芥菜(Brassicanigra)、向日葵(Helianthusannuus)、美洲黑楊、小立碗蘚、歐洲云杉、蘿卜(RaphanussativusL)、蘋(píng)果(Malusdomestica)、水稻、大豆和丹參(Eutremasalsugineum)的COL1同源蛋白比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)不同物種COL1蛋白都具有其高度保守的B-box和CCT結(jié)構(gòu)域(圖4 B)。蛋白理化性質(zhì)分析表明ApCOL1蛋白的分子量39.712 kDa，等電點(diǎn)為5.77，屬于不穩(wěn)定蛋白，平均親水性系數(shù)為-0.713，親水性系數(shù)為負(fù)值屬親水性蛋白，正值為疏水性蛋白。因此，小擬南芥ApCOL1是親水性蛋白。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示ApCOL1蛋白中含有105個(gè)α螺旋，占總數(shù)的29.49%，無(wú)規(guī)則卷曲有208處，占58.42%，還包含10.11%的延伸鏈和2.52%的β轉(zhuǎn)角(圖5)。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模表明ApCOL1蛋白與AtCOL1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性為97.8% (圖6)，以α螺旋為主。

圖3 ApCOL1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析Fig.3 The conserved domain of ApCOL1 protein

A：ApCOL1與AtCO、AtCOL1氨基酸比對(duì)；B：ApCOL1與不同物種間COL1蛋白比對(duì)分析圖4 小擬南芥ApCOL1與不同物種COL1蛋白氨基酸序列多重比對(duì)分析Fig.4 Multiple alignment of amino acid sequences among ApCOL1 and other COL1 proteins from selected plant species

圖5 ApCOL1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of ApCOL1

A：擬南芥AtCOL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；B：小擬南芥ApCOL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，紅色代表N端，藍(lán)色代表C端圖6 ApCOL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Tertiary structure prediction of ApCOL1 protein

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究ApCOL1在不同物種中進(jìn)化關(guān)系，我們利用18種不同物種間的COL1蛋白構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖7A)。結(jié)果表明ApCOL1與AtCOL1、AlCOL1的親緣關(guān)系最近，與亞麻芥COL1和薺菜COL1的親緣關(guān)系較近。擬南芥CO-like家族成員被分為主要的三大亞組：AtCO-AtCOL5含有兩個(gè)B-box和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域?qū)儆诘谝粊喗M；AtCOL6-AtCOL8和AtCOL16包括一個(gè)B-box和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域?qū)儆诘诙喗M；AtCOL9-AtCOL15含有一個(gè)B-box，一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域?qū)儆诘谌齺喗M[11]。小擬南芥ApCOL1屬于哪個(gè)亞組尚不清楚，進(jìn)行了與擬南芥CO及16個(gè)CO基因同源性比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明ApCOL1與AtCOL1歸為一個(gè)亞組，且與擬南芥AtCOL1的親緣關(guān)系最近(圖7B)，保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明ApCOL1在N端含有兩個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域，在C端含有一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域(圖3，圖7 C)。我們的研究表明ApCOL1屬于第一亞組。

A：不同物種間COL1蛋白的親緣關(guān)系；B：ApCOL1蛋白與擬南芥CO-like家族蛋白的親緣關(guān)系，注：圖中◆代表本研究克隆的ApCOL1蛋白； 分支點(diǎn)的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比；標(biāo)尺代表每一位點(diǎn)氨基酸替換率。Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ屬于CO-like基因 家族中的不同分組；C：保守結(jié)構(gòu)域模式圖，綠色和橙色盒分別代表不同的N端B-box鋅指結(jié)構(gòu)，紫色盒代表C端CCT結(jié)構(gòu)域圖7 植物CO-like蛋白進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of plant CO-like proteins

2.4 ApCOL1基因的表達(dá)特征分析

擬南芥AtCOL1、歐洲云杉COL1和COL2在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律方面起關(guān)鍵作用，大麥HvCOL1和香蕉MaCOL3參與植物開(kāi)花過(guò)程[21,35-38]。本研究首先分析ApCOL1基因分別在LD或SD條件下的節(jié)律表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果表明ApCOL1在LD和SD兩種光照條件下具有相似的晝夜表達(dá)特征(圖8)。在LD條件下，ApCOL1光照4-16 h后其表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，進(jìn)入黑暗條件4 h后ApCOL1的表達(dá)水平下降到最低，隨后開(kāi)始迅速積累并在第二天黎明時(shí)升至最高(圖8 A)。在SD條件下，ApCOL1的表達(dá)變化與長(zhǎng)日照條件下的情況類似，在有光條件下其表達(dá)量逐漸降低，進(jìn)入黑暗條件8 h后ApCOL1的表達(dá)水平降至最低，隨后快速積累并到第二天黎明出現(xiàn)表達(dá)峰值(圖8B)。

A：ApCOL1基因在長(zhǎng)日照(16 h光照/8 h黑暗)下的表達(dá)分析；B：ApCOL1基因在短日照(8 h光照/16 h黑暗)下的表達(dá)分析；白色代表白天，灰色代表黑夜；ZT：不同時(shí)間圖8 ApCOL1基因在長(zhǎng)、短光照條件下的節(jié)律表達(dá)分析Fig.8 Diurnal expression patterns of ApCOL1 in LD and SD condition

組織表達(dá)分析表明ApCOL1基因在小擬南芥的下胚軸、根、莖、葉、花和果莢中均表達(dá)，但在果莢表達(dá)量最高，推測(cè)該基因參與小擬南芥果實(shí)的發(fā)育或種子的形成(圖9)。我們進(jìn)一步分析了ApCOL1基因響應(yīng)不同脅迫處理的表達(dá)模式(圖10)。結(jié)果表明250 mM NaCl脅迫明顯下調(diào)ApCOL1基因的表達(dá), 脅迫處理12 h，24 h和48 h表達(dá)量與0 h相比均顯著降低，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(圖10A)。20% PEG-6000模擬干旱脅迫也能明顯抑制ApCOL1基因的表達(dá)，且與鹽脅迫處理下ApCOL1基因表達(dá)特征類似(圖10B)。在高溫(40 ℃)脅迫12 h，ApCOL1基因下調(diào)表達(dá)，24 h上調(diào)表達(dá)，48 h下降到對(duì)照水平(圖10 C)。然而在低溫(4 ℃)脅迫12 h和24 h，基因表達(dá)變化不明顯，48 h表達(dá)水平顯著下降(圖10 D)。研究結(jié)果表明鹽、干旱、高溫和低溫能夠影響ApCOL1基因的表達(dá)。

圖9 小擬南芥ApCOL1組織表達(dá)分析Fig.9 Expression patterns of ApCOL1 in different tissues of A. pumila

A：250 mmol/L NaCl脅迫處理ApCOL1表達(dá)情況；B：20% PEG-6000處理下ApCOL1表達(dá)情況；C：40 ℃高溫脅迫處理下ApCOL1表達(dá)情況； D：4 ℃低溫脅迫處理下ApCOL1表達(dá)情況。每個(gè)數(shù)據(jù)均是三次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)以平均值±樣本值標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示(P<0.05)圖10 不同脅迫處理下小擬南芥ApCOL1的表達(dá)分析Fig.10 Expression patterns of ApCOL1 under different stresses in A. pumila

3 討 論

不同物種CO-like家族成員中的許多重要生物學(xué)功能已經(jīng)被廣泛報(bào)道，但是目前對(duì)于小擬南芥CO及CO-like的分子機(jī)制及功能還不清楚，因此分析其分子機(jī)制及功能有著十分重要的意義。本研究以短命植物新疆小擬南芥ApCOL1為研究對(duì)象，利用其三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從小擬南芥中克隆了ApCOL1基因完整的ORF。

ApCOL1蛋白保守域分析表明，ApCOL1在N端有兩個(gè)保守的B-box，C端存在一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域，屬于CO-like家族。擬南芥CO-like家族主要被分為三大亞組，第I亞組包含兩個(gè)B-box和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域[11]。此外，根據(jù)B-box和CCT域之間的次級(jí)保守域，第I組還可以進(jìn)一步分為Ia，Ib，Ic，Id和Ie[11]；第II亞組僅僅包含一個(gè)B-box和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域；第III亞組是由一個(gè)B-box、一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域組成[37,39]。本研究通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域(圖3)、氨基酸序列的多重比對(duì)(圖4)和蛋白結(jié)構(gòu)分析(圖6)表明ApCOL1與AtCOL1保守區(qū)域氨基酸組成相似，保守性強(qiáng)且保守結(jié)構(gòu)類似。由此推測(cè)，小擬南芥ApCOL1蛋白的功能可能與ACOL1蛋白功能類似。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示ApCOL1與擬南芥CO-like基因家族中的AtCOL1親緣關(guān)系最近(圖7 B)。所以，我們推測(cè)小擬南芥ApCOL1屬于第I亞組成員。

擬南芥中有關(guān)CO基因的研究表明，CO基因在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及不同組織中廣泛表達(dá)，其中在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段葉片的維管組織中表達(dá)量最高[40]。本研究ApCOL1基因在各組織中均表達(dá)，尤其在果莢中呈優(yōu)勢(shì)表達(dá)(圖9)，推測(cè)該基因在小擬南芥種子形成和發(fā)育過(guò)程中可能起著重要作用。

植物CO-like基因表達(dá)受生物鐘的調(diào)控，但不同的基因具有自己獨(dú)特的晝節(jié)律表達(dá)特征[41]。小擬南芥ApCOL1基因在LD和SD兩種光照條件下具有相似的節(jié)律表達(dá)特征：在剛進(jìn)入黑暗條件時(shí)表達(dá)量下降，隨后表達(dá)量由最低開(kāi)始逐漸累積并在第二天黎明時(shí)達(dá)到表達(dá)峰值(圖8)。說(shuō)明ApCOL1基因與AtCOL1基因具有類似的晝夜節(jié)律表達(dá)模式[19]，推測(cè)ApCOL1基因能夠調(diào)節(jié)植物的晝夜節(jié)律。

目前，對(duì)CO-like基因家族的研究主要集中在植物光周期和晝夜節(jié)律調(diào)控方面，但是關(guān)于響應(yīng)非生物脅迫的研究較少。已有的研究表明擬南芥AtCOL4能夠響應(yīng)ABA和鹽脅迫[42]，水稻OsCOL9通過(guò)施加外源水楊酸和乙烯能夠與支架蛋白OsRACK1互作從而增強(qiáng)水稻的抗性[43]，楊樹(shù)COL2基因的表達(dá)水平受高溫脅迫抑制[18]，病原體脅迫和冷脅迫能夠增強(qiáng)香蕉MaCOL1基因的表達(dá)[22]。因此，我們分析了不同脅迫處理對(duì)ApCOL1基因表達(dá)的影響(圖10)，結(jié)果表明250 mmol/L NaCl脅迫和20% PEG-6000模擬干旱脅迫12 h明顯抑制ApCOL1基因的表達(dá)，并且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)ApCOL1表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。高溫(40 ℃)脅迫不能完全抑制ApCOL1基因的表達(dá)，ApCOL1基因的表達(dá)在24 h內(nèi)先下降后上升并達(dá)到最高，48 h又下降到對(duì)照水平。低溫(4 ℃)脅迫24 h之前，ApCOL1基因的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，但處理48 h表達(dá)水平顯著下降。說(shuō)明ApCOL1基因在小擬南芥應(yīng)對(duì)非生物脅迫中起著重要作用。本研究結(jié)果為深入分析小擬南芥ApCOL1基因在逆境脅迫中的功能，探索短命植物適應(yīng)環(huán)境的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。