大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子區(qū)克隆、鑒定及生物信息學(xué)分析

李瓊瓊，王立民，徐夢(mèng)思，萬(wàn)科幸，黃瑾，王成坦，毛福秀，高蕊*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002； 2 新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

以色列科學(xué)家Nedivi于1993年首次在大鼠海馬齒狀腦回cDNA 文庫(kù)中克隆出Neuritin基因[1]。隨后，其又發(fā)現(xiàn)光刺激可誘導(dǎo)大鼠視覺皮質(zhì)中可塑性相關(guān)候選基因15的表達(dá)[2]。時(shí)隔四年，Naeve等人再次從人類大腦皮質(zhì)cDNA 文庫(kù)中篩選并鑒定出該基因，發(fā)現(xiàn)其純化蛋白具有促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長(zhǎng)和加速分支形成的作用，因此將其正式命名為Neuritin[3]。Neuritin基因富集表達(dá)于腦組織，在不同發(fā)育階段，Neuritin的表達(dá)區(qū)域亦有所變化：發(fā)育過程中，Neuritin主要表達(dá)于皮質(zhì)、海馬、大腦的感覺區(qū)；在成年期，則主要表達(dá)在與可塑性相關(guān)的神經(jīng)區(qū)域，如海馬、嗅球、蒲肯野氏細(xì)胞中[3-5]。大量研究表明，Neuritin不僅能促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)及其分支的形成，促進(jìn)突觸的發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形成，還能促進(jìn)神經(jīng)元的遷移，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，維持神經(jīng)元的存活[4, 6-9]。

啟動(dòng)子區(qū)域是參與真核生物的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的重要區(qū)域，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10]。由于第四版大鼠基因組Neuritin基因啟動(dòng)區(qū)域組裝有誤(RGSC 6.0/rn6)，迄今為止仍未見大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子序列與啟動(dòng)Neuritin轉(zhuǎn)錄活性的文獻(xiàn)報(bào)道。相關(guān)Neuritin基因表達(dá)調(diào)控的研究主要集中在在誘導(dǎo)表達(dá)上，研究發(fā)現(xiàn)Neuritin的表達(dá)調(diào)控在胚胎發(fā)育期是非活動(dòng)依賴的，而在出生后至成年期，Neuritin的激活區(qū)域與神經(jīng)活動(dòng)依賴的可塑性相關(guān)區(qū)域相重疊[11-13]，除了KA[3]、光線刺激[1]、突觸活動(dòng)[14]、BDNF[15]、NGF[16]、GDNF[17]可誘導(dǎo)Neuritin基因表達(dá)外，雄激素[18]和神經(jīng)興奮劑[19]也可誘導(dǎo)Neuritin基因的表達(dá)；而在脊髓損傷[20]、缺氧[21]、腦外傷[22]、電驚厥治療[23]、抗抑郁藥[24-25]作用后Neuritin的表達(dá)也出現(xiàn)了上調(diào)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)全腦短暫性缺血再灌注模型大鼠Neuritin基因表達(dá)顯著升高，且其表達(dá)水平的變化趨勢(shì)恰好與機(jī)體的修復(fù)程度呈正相關(guān)[26-28]。

基于以上研究背景。本研究根據(jù)物種的同源性設(shè)計(jì)引物克隆大鼠Neuritin啟動(dòng)子區(qū)域序列，并采用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)其序列進(jìn)行鑒定，利用生物信息學(xué)方法分析其序列特征，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子主要調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究其表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

成年健康Sprague-Dawley大鼠購(gòu)買于新疆疾病預(yù)防與控制中心，體重約200 g，取0.5 cm鼠尾剪碎，用于提取組織總DNA。

1.2 試驗(yàn)試劑

Tris堿、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、氯化鈉(NaCl)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、濃鹽酸、Tris平衡酚、氯仿(三氯甲烷)以及瓊脂糖為實(shí)驗(yàn)室留存試劑。青霉素、鏈霉素購(gòu)自于Invitrogen公司。高保真酶購(gòu)自天根生化(北京)有限公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小抽提試劑盒、高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)于OMEGA公司；pMDTM19-T載體、LA酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取

采用苯酚-氯仿抽提法提取大鼠鼠尾組織基因組DNA，75%的乙醇洗滌2次，ddH2O溶解基因組至終濃度為200 ng/μL，OD260/280比值為1.8-2.0，基因組DNA于-20 ℃。

1.3.2 大鼠Neuritin基因5’調(diào)控區(qū)引物設(shè)計(jì)

以小鼠Neuritin基因CDS區(qū)上游3000 bp的堿基序列為參考序列，采用比較基因組學(xué)的方法同第四版大鼠基因組Neuritin基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行比較，采用oligo 6.0軟件針對(duì)涵蓋大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子的上、下游保守序列設(shè)計(jì)引物，由Invitrogen公司合成，引物信息如下：

PFnrn1∶5’-CCGCTCGAGGTCAAACCATTTGCGACCGCAGACC-3’。

PRnrn1∶5’- CTAGCTAGCGAAGGGGAAAGCATCCTTTACCCCT-3’。

1.3.3 大鼠Neuritin基因5’調(diào)控區(qū)PCR擴(kuò)增和測(cè)序

以大鼠基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL：LA酶和高保真酶各0.5 μL，LA Buffer 5 μL，dNTP 8 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 33 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 10 s，68 ℃ 3min共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。將回收產(chǎn)物克隆入pMDTM19-T Vector載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送新疆昆泰銳生物公司測(cè)序。

1.3.4 大鼠Neuritin基因5′ 調(diào)控區(qū)生物信息學(xué)分析

利用啟動(dòng)子生物信息學(xué)軟件EMBOSS Cpgplot(http://www.e bi.ac.uk/Tool s/seqstats/e mboss_cpgplot/)和Promoter Scan(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan)對(duì)大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，初步確定啟動(dòng)子核心調(diào)控區(qū)域。

1.3.5 大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子主要調(diào)控區(qū)域生物信息學(xué)分析

利用Promoter scan，AliBaba2.0，TRBIND，Match 1.0 Public及TFSEARCH(表1)等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子主要調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

表1 啟動(dòng)子在線分析軟件Tab.1 Online softwares for promoter analyzing

2 結(jié)果

2.1 大鼠Neuritin基因5′ 調(diào)控區(qū)擴(kuò)增及序列的測(cè)序

以大鼠鼠尾組織基因組DNA為模板，對(duì)預(yù)設(shè)的大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增得到一條大小約為3400 bp的特異性條帶(圖1)。Neuritin擴(kuò)增片段純化后連接至 T 載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、涂板、挑取單一菌落，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用XhoⅠ和NheⅠ限制性核酸內(nèi)切酶初步鑒定出陽(yáng)性克隆(圖2)。陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與大鼠

Neuritin基因完全一致，鑒定為大鼠Neuritin基因5′ 調(diào)控區(qū)序列(圖3)。

M：1 kb Marker；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis chart of 5′ regulatory region of Rat Neuritin

M： 1 kb Marker； 1：重組質(zhì)粒pMD19-Nrn1-promoter； 2： XhoⅠ單酶切(6140 bp)；3： NhoⅠ單酶切(6140 bp)； 4：雙酶切(2693 bp；3447 bp)圖2 Neuritin啟動(dòng)子區(qū)域重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant vectors of Neuritin promoter region by restriction enzymes

圖3 大鼠Neuritin啟動(dòng)子區(qū)域陽(yáng)性質(zhì)粒部分序列測(cè)序圖譜Fig.3 Sequencing of partial sequences of positive plasmid of rat Neuritin promoter region

2.2 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列分析

對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序后的堿基組成進(jìn)行分析，大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列中A、T、G、C堿基含量分別為21.4%、24.9%、26.1%和27.6%，其中A+T含量為46.3%，G+C含量為53.7%。同源性分析發(fā)現(xiàn)，大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列與人和小鼠的一致性分別為92.9%和91.1%。

利用Promoter Scan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列CDS區(qū)上游224 bp處有一個(gè)TATA 盒，并預(yù)測(cè)了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用EMBOSS Cpgplot在線工具檢索了所克隆的約3447 bp啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)距大鼠NeuritinCDS區(qū)上游740～1012 bp位置處有一個(gè)CpG島(圖4、圖5)。據(jù)此初步證實(shí)Neuritin基因核心啟動(dòng)子位于Neuritin基因起始位點(diǎn)前1100 bp的上游片段。

下劃線為為CpG島，加粗字體灰色為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，加粗灰色斜體為TATA-Box圖4 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)核苷酸序列Fig.4 Sequences of 5′regulatory region in Rat Neuritin

圖5 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Prediction of CpG islands in 5′ regulatory region of Rat Neuritin

2.3 大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子主要調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)生物信息學(xué)分析

依據(jù)上述以上的分析結(jié)果，進(jìn)一步利用五款轉(zhuǎn)錄因子分析軟件(Promoter scan，AliBaba2.0，TRBIND，Match 1.0 Public和TFSEARCH)對(duì)大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)1100 bp的核心啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)生物信息學(xué)分析，我們采用嚴(yán)苛的求五種預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集的方法，最終篩選出與Neuritin基因啟動(dòng)相結(jié)合的候選轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)于預(yù)測(cè)得出交集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步將這些位點(diǎn)序列與小鼠和人的序列進(jìn)行比較，將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)同源性高的轉(zhuǎn)錄因子作為最終候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示共篩選出CREB，AP-1，GATA-1，AP-2，AP-4，RAP1，MCM1和Pit八個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(表2)。

表2 五款轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果(交集)Tab.2 Prediction results of five transcription factor prediction softwares (intersection)

3 討論

有關(guān)Neuritin表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究十分有限，現(xiàn)有的研究表明Neuritin基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制存在3種不同的途徑：(1)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的誘導(dǎo)途徑，當(dāng)外源性BDNF作用于神經(jīng)元時(shí)，可通過TrkB 受體途徑激活Neuritin的表達(dá)，但阻斷TrkB 受體后只阻斷BDNF對(duì)Neuritin的激活，而不影響KCL誘導(dǎo)Neuritin表達(dá)的作用[3]。(2)神經(jīng)活動(dòng)的獨(dú)立誘導(dǎo)途徑，神經(jīng)活動(dòng)可激活N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA) 受體，通過開放電壓門控的L型鈣通道，引發(fā)胞外鈣離子內(nèi)流，促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增加，激活鈣調(diào)蛋白結(jié)合的靶標(biāo)蛋白鈣調(diào)蛋白激酶(CaM kinases)和細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 通路，獨(dú)立誘導(dǎo)Neuritin的表達(dá)[33]。該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可被鈣調(diào)蛋白激酶抑制劑制 KN-62 所阻斷，但卻不能阻斷BDNF對(duì)Neuritin基因的激活作用[13]。(3)對(duì)Neuritin基因轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)調(diào)控途徑的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元特異性的RNA結(jié)合蛋白Hud蛋白與Neuritin的表達(dá)存在一定相關(guān)性，Hud蛋白能夠結(jié)合到Neuritin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’非翻譯區(qū)的AU富集區(qū)，從而參與Neuritin基因的表達(dá)[29]。Akten等[30]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存(survival motor neuron, SMN)蛋白可與Hud蛋白形成復(fù)合體，通過調(diào)控Neuritin基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，參與挽救脊髓性肌萎縮癥中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的缺失。在表觀調(diào)控機(jī)制方面，本課題組利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)全腦短暫性缺血再灌注和正常對(duì)照的大鼠腦組織小RNA進(jìn)行測(cè)序[28]，篩選出差異表達(dá)的miRNA，并應(yīng)用雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)及細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了miR-204在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)Neuritin基因具有負(fù)向調(diào)控作用[31]。

啟動(dòng)子是基因的重要組成部分，是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的順式作用元件，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)豐度[10]。因此，了解啟動(dòng)子的功能活性對(duì)于研究基因的表達(dá)調(diào)控十分重要。由于UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)上大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子存在拼接錯(cuò)誤，本研究根據(jù)比較基因組設(shè)計(jì)在小鼠和大鼠基因組上均高度保守的上、下游引物擴(kuò)增大鼠Neuritin基因CDS區(qū)上游3447 bp的堿基序列，大鼠Neuritin基因啟動(dòng)子所克隆的序列與小鼠的同源性高達(dá)91.1%，與人的Neuritin基因啟動(dòng)子序列的同源性高達(dá)93%，其序列的同源性與人更為接近。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列CDS區(qū)上游224 bp處存在典型的TATA-Box。TATA-Box是存在于真核生物啟動(dòng)子中很常見的一種順式作用元件，它存在于由RNA聚合酶Ⅱ所轉(zhuǎn)錄的大多數(shù)真核生物基因的近端啟動(dòng)子中，TATA-Box可以與其他啟動(dòng)子元件聯(lián)合起作用，一起調(diào)控啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[32]。本研究還發(fā)現(xiàn)距大鼠NeuritinCDS區(qū)上游1100-850 bp位置處有一個(gè)CpG島，CpG島含有豐富的CG堿基，易于發(fā)生DNA甲基化，提示大鼠Neuritin基因的表達(dá)調(diào)控可能還涉及到表觀遺傳修飾，如甲基化修飾的調(diào)節(jié)。本研究還對(duì)Neuritin基因CDS區(qū)上游1100 bp的核心啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，篩選出CREB，AP-1，GATA-1，AP-2，AP-4，RAP1，MCM1和Pit 8等八個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。物種同源性比對(duì)性結(jié)果顯示CREB和AP-1的結(jié)合位點(diǎn)序列與人和小鼠Neuritin啟動(dòng)子序列同源性較高。大量研究表明轉(zhuǎn)錄因子CREB在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、抑郁、成癮性、生理周期中，特別是在長(zhǎng)時(shí)程記憶過程中具有重要作用[33]，其可能在Neuritin基因的表達(dá)調(diào)控中扮演重要角色。

本研究鑒定了大鼠Neuritin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，這不僅對(duì)于深入闡Neuritin基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，而且也有助于進(jìn)一步解釋Neuritin基因在神經(jīng)受損后的再生中過程中行駛的生物學(xué)功能。