高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法與高效液相色譜法同步測定白玉菇麥角固醇和VD2方法比較

徐明芳，沈林燕，楊云舒，傅利軍，孫 勇,*，王洋洋，彭 璐，黃曉晶，李 彥

（1.暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣東 廣州 510632；2.北京食品科學研究院，北京 100068）

白玉菇又稱白玉蕈、白色真姬菇（white Hypsizigus marmoreus），是真姬菇（H. marmoreus）的一個白色變種，隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaicales），白蘑科（Tricholomataceae），玉蕈屬（Hypsizigus），菇體潔白清亮，質(zhì)地緊密脆嫩，口感滑膩鮮美，是一種深受全世界消費者喜愛的上乘山珍，享有食用菌中的“金枝玉葉”的美稱[1]。麥角固醇（又稱麥角甾醇）是白玉菇中重要的生物活性物質(zhì)，其化學名稱為24β-甲基膽固醇-5,7烯-3β-羥基（圖1A），具有與膜結(jié)合酶的活性，對確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、流動性、細胞活力、物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?，還是一種重要的化工原料，可用于“可的松”、“黃體酮”等藥物的生產(chǎn)[2]。

研究[3-5]發(fā)現(xiàn)麥角固醇對腫瘤細胞的生長具有顯著的抑制作用，可作為有效的抗癌物質(zhì)。此外，麥角固醇還是VD2的前體化合物，在受到紫外光照射時，分子中一個碳環(huán)發(fā)生斷裂，轉(zhuǎn)化為VD2[6-8]。VD2又稱麥角鈣化甾醇，化學名稱為9,10-開環(huán)麥角甾-5,7,10(19),22-四烯-3β-醇，化學結(jié)構(gòu)式如圖1B所示，是麥角固醇的同分異構(gòu)體，能調(diào)控鈣、磷代謝和骨穩(wěn)態(tài)，促進孕婦和老年人對鈣磷的吸收[9-11]，影響細胞的增殖分化[12-13]，對調(diào)節(jié)生命代謝功能有重要作用。

圖1 麥角固醇（A）和VD2（B）結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of ergosterol (A) and VD2 (B)

麥角固醇的檢測方法主要有紫外分光光度法法[14-16]、薄層色譜掃描法[17-18]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[19-21]法和氣相色譜法[22-23]等，VD2常采用HPLC法[24-26]。文獻報道的方法均為麥角固醇或VD2單一組分的測定，如研究者[27-29]分別用HPLC和氣相色譜法分析栽培蘑菇中VD2和麥角固醇的含量，發(fā)現(xiàn)栽培蘑菇中都含有豐富的麥角固醇，卻幾乎沒有VD2。麥角固醇和VD2之間特殊的光轉(zhuǎn)化關(guān)系導致食用菌中兩者的含量存在動態(tài)變化，建立同步定量檢測麥角固醇和VD2的分析方法對白玉菇中有效成分的質(zhì)量控制及食用菌相關(guān)新產(chǎn)品的研發(fā)具有重要的意義。基于HPLC-MS/MS高效分離能力、高分辨率和高靈敏度技術(shù)優(yōu)勢[30-31]，本研究通過兩種方法中檢測條件的優(yōu)化與方法學評價，旨在建立HPLC-MS/MS法快速準確同步檢測白玉菇中麥角固醇與VD2的檢測方法，為食用菌新產(chǎn)品研發(fā)與質(zhì)量標準完善提供理論依據(jù)與技術(shù)方法，對于開展同分異構(gòu)體的同步檢測具有重要現(xiàn)實意義與理論價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮白玉菇（市售），經(jīng)干燥、研磨成粉末狀后備用；麥角固醇、VD2標準品（純度＞98%） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚（均為分析純）廣州化學試劑廠；甲醇（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水（18.2 MΩ/cm） 美國Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI4000 Q TRAP型HPLC-MS/MS聯(lián)用儀 美國應用生物系統(tǒng)公司；1100 HPLC儀（配二極管陣列檢測器及數(shù)據(jù)分析平臺） 美國Agilent公司；超純水儀 美國Thermo Scientific公司；烘箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；CP224C電子天平 奧豪斯儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 兩種方法檢測條件

HPLC-MS/MS聯(lián)用法：電噴霧離子源正離子檢測方式下采用多反應選擇離子監(jiān)測（multi-reaction monitoring，MRM）模式進行二級質(zhì)譜分析。色譜柱：Agilent SB-C8Rapid Res長柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent SB-C8Rapid Res短柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）；流速：500 μL/min（50 mm C8）、250 μL/min（100 mm C8）；流動相：100%甲醇；柱溫：22 ℃；進樣量：5 μL/min；離子源參數(shù)：霧化氣壓力310.3 kPa，輔助氣壓力413.7 kPa；氣簾氣壓力137.9 kPa；離子源溫度500 ℃，離子源噴霧流速5 L/min。

HPLC法：COSMOSIL Column 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相100%甲醇；流速1 mL/min；檢測波長270 nm；進樣量10 μL；運行時間15 min。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取麥角固醇標準品30.00 mg，VD2標準品10.00 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解并定容、搖勻，即得麥角固醇質(zhì)量濃度為3 mg/mL、VD2質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準品儲備母液。將母液用無水乙醇依次稀釋配制成HPLC-MS/MS聯(lián)用法和HPLC法所需質(zhì)量濃度的混合標準溶液。以麥角固醇及VD2標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 供試品溶液的制備

取市售鮮白玉菇子實體適量，烘干，研碎，取1 g干粉置于磨口燒瓶，加40 g/L的NaOH溶液25 mL，再加入50 mL無水乙醇，在85 ℃水浴中皂化回流90 min。皂化完畢，濾紙過濾皂化液，冷卻至室溫，加25 mL石油醚，充分振蕩15 min，靜置分層。上層無色萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃時蒸去石油醚，蒸干后樣品用無水乙醇定容到10 mL容量瓶，供試品溶液測定前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3.4 樣品中麥角固醇、VD2含量的計算

式中：C1、C2分別為麥角固醇、VD2質(zhì)量濃度；V1、V2分別為麥角固醇、VD2的定容體積；N1、N2分別為麥角固醇、VD2的稀釋倍數(shù)；W1、W2分別為麥角固醇、VD2萃取時樣品的干質(zhì)量。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Excel軟件進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS/MS聯(lián)用法檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

不同色譜柱柱長可能會影響混合物組分的分離效果和分離時間[32]，研究Agilent SB-C8Rapid Res長柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent SB-C8Rapid Res短柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）對白玉菇樣品中麥角固醇和VD2的分離情況，結(jié)果如圖2、3所示。比較樣品MRM色譜圖發(fā)現(xiàn)，C8短柱與C8長柱均能獲得良好的分離度和色譜峰形，色譜峰窄且尖銳，C8短柱的響應信號較C8長柱稍弱，但與長柱相比，僅需4.5 min左右即可實現(xiàn)對兩種組分的快速分離，基于此，后續(xù)實驗選用50 mm C8柱進行同步檢測。

圖2 100 mm C8柱中麥角固醇（A）和VD2（B）的分離MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of ergosterol (A) and VD2 (B) on 100 mm long C8 column

圖3 50 mm C8柱中麥角固醇（A）和VD2（B）的分離MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of ergosterol (A) and VD2 (B) on 50 mm long C8 column

2.1.2 質(zhì)譜分析參數(shù)優(yōu)化

采用電噴霧離子源正離子模式對麥角固醇和VD2標準品進行全波掃描，確定麥角固醇和VD2母離子參數(shù)，調(diào)整氣簾氣電壓、霧化氣流速、輔助氣壓力、離子源溫度等參數(shù)，降低噪音，提高母離子穩(wěn)定性和響應信號，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞電壓、攝入電壓及碰撞室射出電壓等參數(shù)（表1），MRM模式下進行質(zhì)譜分析。

表1 麥角固醇及VD2的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of ergosterol and VD2

在一級質(zhì)譜圖中從特征母離子中選擇適宜的子離子，根據(jù)MRM模式下進行二級質(zhì)譜分析，使母離子的響應信號降低，子離子的響應信號增強，結(jié)果如圖4、5所示。

圖4 麥角固醇的一級（A）、二級（B）質(zhì)譜子離子掃描圖Fig. 4 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of ergosterol

圖5 VD2的一級（A）、二級（B）質(zhì)譜子離子掃描圖Fig. 5 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of VD2

2.1.3 定量離子對的選擇

圖6 不同離子對VD2和麥角固醇的分離MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of VD2 and ergosterol with different ion pairs

麥角固醇與VD分子結(jié)構(gòu)中多為烷烴和烯烴的組合（圖1），轟擊產(chǎn)生的離子碎片較多，且難發(fā)現(xiàn)明顯的特征離子對。麥角固醇與VD2在MS1＋掃描中主要生成[M＋H－H2O]＋準分子離子峰m/z 379.3（圖4A）與397.3（圖5A），對兩者進行MS2＋掃描，生成信號較高的主要碎片離子，如麥角固醇二級特征離子m/z為125.3、253.3（圖4B）、VD2的二級特征離子m/z 125.3、271.3（圖5B）。實驗表明，如果選用m/z 69.2、107.2等低質(zhì)量端的離子容易產(chǎn)生干擾，通常選擇豐度較高且干擾小的離子作為特征離子，兩種物質(zhì)二級質(zhì)譜圖中含有相同的特征離子m/z 125.3，推測為同一烯烴碎片離子C9H17＋，可作為同步檢測麥角固醇與VD2定性定量依據(jù)。

從圖6可知，選用不同離子對計算出來的麥角固醇與VD2含量并無顯著差異，選用m/z 397.3/271.3離子對定量VD2時MRM色譜圖的雜峰比選用m/z 397.3/125.3多，導致基線極不平穩(wěn)，選擇m/z 397.3/125.3作為VD2定量離子對，m/z 379.3/125.3作為麥角固醇定量離子對，通過組內(nèi)、組間方差分析，研究結(jié)果并無顯著差異（表2、3）。

表2 離子對的選擇對VD2和麥角固醇測定結(jié)果的影響Table 2 Effect of different ion pairs on VD2and ergosterol contents

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance

2.2 HPLC法檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相流速選擇

柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，不同的流速可得到不同的柱效。對于特定的色譜柱，要獲得最佳柱效需采用最佳流速。流動相流速研究結(jié)果如表4、5所示。

表4 麥角固醇/VD2混合標準品在不同流動相配比下的保留時間、響應信號和峰面積Table 4 Retention time, response signal and peak area of ergosterol/VD2mixed standard solution at different mobile phase compositions

由表4可知，隨著甲醇比例的增加，保留時間隨之縮短，信號響應值隨之增加，峰面積基本接近，選用100%甲醇作為流動相，保留時間短，響應信號值高，分離效果較好。

表5 麥角固醇/VD2混合標準品在不同流速下的保留時間、響應信號和峰面積Table 5 Retention time, response signal and peak area of the ergosterol/VD2mixed standard solution at different flow rates

由表5可知，流速為0.8 mL/min時，保留時間較長；流速為1.2 mL/min時，標準品的峰面積相對較低，流動相流速選取為1 mL/min時，標準品的保留時間和峰面積適中。

2.2.2 柱溫的選擇

表6 麥角固醇/VD2混合標準品在不同柱溫下的保留時間、響應信號和峰面積Table 6 Retention time, response signal and peak area of the ergosterol/VD2mixed standard solution at different column temperatures

從表6可知，隨著柱溫的升高，麥角固醇和VD2的保留時間與響應信號略有變化，柱溫選擇30 ℃時麥角固醇和VD2的峰面積較高。

HPLC條件優(yōu)化為波長270 nm、100%甲醇、柱溫30 ℃、流速1 mL/min、進樣量10 μL時，麥角固醇和VD2單標與混標保留時間都如圖7所示，色圖譜基線平穩(wěn)，峰形尖銳對稱，主峰與其他色譜峰實現(xiàn)較好分離，所有樣品在15 min內(nèi)檢測完畢。

圖7 麥角固醇、VD2單標（A）和混合標準溶液（B）HPLC譜圖Fig. 7 HPLC chromatograms of VD2, ergosterol standards (A) and mixed standard (B)

2.3 兩種同步檢測方法學的評價

2.3.1 線性方程、檢出限與定量限

一定范圍濃度的麥角固醇和VD2標準溶液采用優(yōu)化檢測條件下建立的HPLC-MS/MS聯(lián)用法及HPLC法進行測定，并進行線性回歸，按3 倍信噪比和10 倍信噪比計算方法分別確定檢出限和定量限，參數(shù)與結(jié)果見表7。

表7 HPLC-MS/MS及HPLC方法的線性回歸參數(shù)Table 7 Overview of the linearity data obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

如表7所示，HPLC-MS/MS聯(lián)用法中，在質(zhì)量濃度0.15～6 mg/L與0.01～1 mg/L范圍內(nèi)，標準品麥角固醇與VD2濃度均與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；HPLC法中，標準品麥角固醇質(zhì)量濃度在15～750 mg/L與VD2質(zhì)量濃度在0.5～50 mg/L范圍內(nèi)，均與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。與HPLC法相比，HPLC-MS/MS聯(lián)用法檢出限、定量限與檢測時間均低于HPLC法。

2.3.2 重復性評價

同一混標樣品取3 份精密稱定1 g，制備樣品溶液。用兩種檢測方法分別測定VD2和麥角固醇含量，記錄峰面積積分值，按照各自的標準方程計算含量及其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值，結(jié)果如表8所示，數(shù)據(jù)表明兩種檢測方法具有良好的重復性，但對于低濃度的VD2檢測，HPLC法缺乏有效性。

表8 HPLC-MS/MS及HPLC方法的重復性實驗結(jié)果Table 8 Results of repeatability obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

2.3.3 加標回收率與儀器精密度

分別精確稱定1 g已知VD2和麥角固醇含量的樣品3 份準確加入一定量的VD2和麥角固醇標準品，按照樣品處理方法制備樣品溶液。用兩種檢測方法分別測定VD2和麥角固醇含量，按外標法以峰面積計算含量，結(jié)果如表9所示。兩種檢測方法RSD低于均低于6%。

表9 HPLC-MS/MS的VD2回收率實驗結(jié)果（n=3）Table 9 Recovery of VD2by HPLC-MS/MS (n= 3)

2.3.4 日內(nèi)和日間精密度實驗結(jié)果

配制高中低麥角固醇和VD2標準品溶液，每天進樣3 次連續(xù)測定3 d，記錄麥角固醇和VD2的峰面積積分值，計算各自峰面積的RSD計算日間和日內(nèi)差異，結(jié)果如表10所示。

表10 HPLC-MS/MS及HPLC方法的日內(nèi)和日間精密度實驗結(jié)果Table 10 Results of intra-day and inter-day precision obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

由表10可見，較高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HPLC法日內(nèi)和日間精密度較高，RSD均低于1%，低質(zhì)量濃度的檢測HPLC-MS/MS聯(lián)用法更具優(yōu)勢，低、中、高3 個水平的麥角固醇和VD2標準品日內(nèi)和日間精密度實驗結(jié)果的RSD均低于7%，表明兩種方法精密度良好。

2.4 樣品檢測與系統(tǒng)適應性

圖8 白玉菇樣品中VD2和麥角固醇HPLC色譜圖Fig. 8 Chromatograms of VD2 and ergosterol in white H. marmoreus sample

從圖8可知，麥角固醇與VD2分別在12.701 min與9.828 min出峰，峰后有少量雜峰但不影響麥角固醇與VD2的定性與定量分析。

白玉菇樣品中麥角固醇和VD2MRM色譜圖如圖9所示，供試品溶液中雖有微量的雜質(zhì)峰干擾，但對樣品測定無影響，建立的兩種檢測方法專屬特異性強系統(tǒng)適應性好。

圖9 白玉菇樣品中麥角固醇（A）和VD2（B）MRM色譜圖Fig. 9 MRM chromatogram of ergosterol (A) and VD2 (B) in white H. marmoreus sample

市售3 種不同廠家的白玉菇樣品采用上述兩種方法測定，白玉菇中麥角固醇和VD2的含量結(jié)果見表11。

表11 不同廠家市售白玉菇中麥角固醇和VD2兩種檢測方法測定結(jié)果比較（n=3）Table 11 Comparison of results obtained for determination of ergosterol and VD2by HPLC-MS/MS and HPLC in commercially available white H. marmoreus from different manufacturers (n= 3)

市售白玉菇樣品檢測結(jié)果（表11）可知：HPLC-MS/MS法可以有效檢測麥角固醇與微量的VD2；HPLC法僅能測定麥角固醇含量，含量高于HPLC-MS/MS法，且無法檢測出白玉菇樣品中微量的VD2含量，兩種方法的檢測結(jié)果存在一定的差異性，從測定原理看，HPLC-MS/MS是采用HPLC系統(tǒng)將物質(zhì)分開后，經(jīng)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，使各組分電離成不同m/z的離子，通過分析離子化樣品的m/z實現(xiàn)對被測化合物定性定量分析；HPLC是一種以液體為流動相的色譜系統(tǒng)，待測樣品隨流動相進入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)利用液-液分配或吸附作用實現(xiàn)待測組分的分離進入二極管陣列檢測器檢測，以標準物質(zhì)的HPLC色譜和保留時間定性，峰面積定量。研究結(jié)果與測定效率表明，HPLC-MS/MS高分辨率與高靈敏度和定性定量能力，與HPLC法相比，具有更低的檢出限，更短的檢測時間。

3 結(jié) 論

本實驗建立HPLC-MS/MS與HPLC兩種同步檢測白玉菇樣品中麥角固醇和VD2含量方法與方法學評價，通過對市售白玉菇樣品中麥角固醇和VD2含量進行檢測與系統(tǒng)適應性分析，對比兩種方法檢測的差異性。HPLC-MS/MS方法則具有更高分離和定性定量的能力，在檢測過程中可以鎖定目標離子，排除存在雜質(zhì)的離子干擾，靈敏度和準確度更高。兩種方法都可用于麥角固醇和VD2的同步定量測定，在相應的線性濃度范圍內(nèi)，與HPLC法相比，HPLC-MS/MS法檢測麥角固醇和VD2的線性范圍、檢出限和定量限更低，分析時間更短靈敏更高，適用于痕量物質(zhì)的測定和同分異構(gòu)體樣品分析，為食用菌新產(chǎn)品研發(fā)與質(zhì)量標準完善提供理論依據(jù)與技術(shù)方法具有重要現(xiàn)實意義。