發(fā)酵對(duì)酸肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

常 榮，韋 誠，段珍珍，周才瓊*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

肉制品在加工保藏中普遍發(fā)生蛋白質(zhì)的氧化降解，促進(jìn)肽鍵的斷裂及疏水性氨基酸的暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，增加風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，從而影響加工肉制品風(fēng)味品質(zhì)[1]。通常情況下，適度氧化水解有利于促進(jìn)風(fēng)味發(fā)展，而劇烈的降解會(huì)導(dǎo)致不良風(fēng)味產(chǎn)生，嚴(yán)重的蛋白氧化聚集會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降[2]。

酸肉是一種以新鮮豬肉為原料，添加適量米粉發(fā)酵產(chǎn)酸后制成的一類流行于西南地區(qū)的地方特色美食。傳統(tǒng)酸肉一般在發(fā)酵約20 d開始食用，并采用發(fā)酵方式保藏直至食用完畢，周期約半年。有關(guān)酸肉的研究多集中在湖南侗族酸肉發(fā)酵條件[3]、微生物區(qū)系[4]及風(fēng)味形成[5]等；本團(tuán)隊(duì)在對(duì)渝黔地區(qū)酸肉發(fā)酵中微生物區(qū)系、風(fēng)味品質(zhì)等研究中，認(rèn)為合適發(fā)酵時(shí)間在20～40 d[6-8]；考慮酸肉以發(fā)酵方式保藏，微生物及產(chǎn)酸等持續(xù)作用，使酸肉成為一個(gè)動(dòng)態(tài)體系，其中的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生持續(xù)的氧化降解，這些變化可能影響酸肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酸肉品質(zhì)。因此，研究酸肉蛋白質(zhì)在長時(shí)間發(fā)酵中的結(jié)構(gòu)變化可提供酸肉發(fā)酵保藏中蛋白質(zhì)營養(yǎng)和風(fēng)味變化可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌、湖北大米、食鹽購自重慶北碚天生麗街永輝超市。大米炒至微黃，粉碎過20 目篩，備用。

尿素、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、氯化鉀、溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB）、β-巰基乙醇（均為分析純） 重慶駿偉生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 重慶市鈦新化工有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股有限公司；5810 R型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；F-2500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；DXR2拉曼光譜儀器美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 酸肉制備

豬肉洗凈瀝干，切成約3 cm×5 cm×0.5 cm薄片，豬肉、米粉和食鹽按質(zhì)量比85∶10∶5混勻，裝壇，水密封，20～25 ℃發(fā)酵。于不同發(fā)酵時(shí)間（0、20、50、80、110、140、180 d）取樣置－80 ℃貯藏，并在4 ℃解凍4 h后用于分析。

1.3.2 蛋白質(zhì)的提取

1.3.2.1 肌漿蛋白的提取[9]

5 g絞碎樣品，加入20 mL冰冷50 mmol/L Tris-HCl提取液（pH 8.3，含10 mmol/L EDTA）高速勻漿1 min，勻漿液在4 ℃、2 000×g離心10 min后紗布過濾，取上清液，用雙縮脲法調(diào)整蛋白濃度后待分析。

1.3.2.2 肌原纖維蛋白的提取[10]

取5 g絞碎樣品，加入25 mL緩沖液A（pH 7.0、20 mmol/L PBS，150 mmol/L NaCl，25 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，4 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF），高速均質(zhì)1 min（冰浴中進(jìn)行），使用紗布過濾勻漿液除去結(jié)締組織等雜質(zhì)，濾過液4 ℃、4 000×g冷凍離心15 min，棄上清液，沉淀部分先用0.1 mol/L的NaCl洗滌2 次后，再用25 mL PBS（20 mmol/L，pH 6.0）洗滌2 次。最后將沉淀懸浮于含有0.6 mol/L NaCl的PBS（20 mmol/L，pH 6.0）中，離心，上清液為肌原纖維蛋白，采用雙縮脲法測定蛋白含量。

1.3.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性分析

1.3.3.1 肌漿蛋白表面疏水性測定

參考Cardamone等[11]的方法。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作圖，曲線初始斜率為蛋白的表面疏水性。

1.3.3.2 肌原纖維蛋白表面疏水性測定

參考Traore等[12]的方法。肌原纖維蛋白表面疏水性以其對(duì)BPB結(jié)合量表示，計(jì)算公式如下：

1.3.3.3 蛋白質(zhì)分子間相互作用力測定[13]

溶液包括：0.6 mol/L KCl（S1）；20 mmol/L Tris，pH 8.0（S2）；20 mmol/L Tris，pH 8.0，包含1 g/100 mL SDS（S3）；20 mmol/L Tris，pH 8.0，包含1 g/100 mL SDS和8 mol/L尿素（S4）；20 mmol/L Tris，pH 8.0，包含1 g/100 mLSDS，8 mol/L尿素和2%（V/V）β-巰基乙醇（S5）；0.5 mol/L NaOH（S6）。取2 g絞碎肉樣（去除可見脂肪和筋膜），分別加入20 mL上述溶液，室溫下磁力攪拌4 h，其中S5攪拌前先100 ℃水浴2 min。樣品12 100×g離心30 min，吸取4 mL上清液至離心管中并加入1 mL 50%三氯乙酸溶液，3 ℃放置過夜，之后4 000×g離心20 min，沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液溶解，采用雙縮脲法測定溶解液蛋白含量。結(jié)果以各部分蛋白含量占S6蛋白含量的百分比表示。

1.3.3.4 內(nèi)源熒光測定

參考Lobo等[14]的方法。激發(fā)波長283 nm或295 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度1 500 nm/min，獲取300～400 nm波長之間的發(fā)射光譜。

1.3.3.5 紫外吸收測定

參考任麗娜[15]方法并適當(dāng)修改。將樣品液用0.6 mol/L KCl溶液稀釋至0.5 mg/L，以0.6 mol/L KCl溶液作為空白，波長掃描范圍為220～320 nm，測定樣品的紫外吸收及二階導(dǎo)圖譜，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.3.6 拉曼光譜測定

參考Zaj?c等[16]的方法。采用OMNIC軟件對(duì)圖譜進(jìn)行基線校正、平滑等處理，Peakfit 4.12軟件進(jìn)行分峰擬合。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Origin 8.6軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸肉發(fā)酵中蛋白分子間相互作用力變化

表1 蛋白質(zhì)分子相互作用力在酸肉發(fā)酵中的變化Table 1 Changes in protein-protein interactions during sour pork fermentation

本實(shí)驗(yàn)采用5 種不同的溶劑規(guī)避不同的蛋白質(zhì)相互作用力，其中KCl、SDS、尿素分別能夠規(guī)避靜電作用力、氫鍵、疏水作用力，而巰基乙醇則能夠打破二硫鍵，因此蛋白質(zhì)在S1、S3、S4、S5中的溶解量分別表示靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)，結(jié)果見表1。發(fā)酵0 d時(shí)，S3＞S4＞S5＞S1＞S2，說明豬肉蛋白天然結(jié)構(gòu)由氫鍵、疏水相互作用力、靜電相互作用力及二硫鍵共同維系；從量的角度看，主要是氫鍵和疏水相互作用。發(fā)酵后這幾種作用力對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)發(fā)生了改變。隨發(fā)酵時(shí)間延長，蛋白質(zhì)在S1和S2中的溶解度逐漸下降，180 d時(shí)，蛋白溶解度分別為發(fā)酵0 d時(shí)的24.96%和26.57%，可能是發(fā)酵產(chǎn)酸等誘發(fā)蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致其發(fā)生變性聚集，進(jìn)而引起蛋白鹽溶性下降。S3在發(fā)酵中逐漸增加，50 d后保持穩(wěn)定略降，推測蛋白分子間氫鍵在發(fā)酵中不斷破壞又重新合成。S4和S5在發(fā)酵20 d快速增加后波動(dòng)變化，均明顯高于0 d的溶解度，說明經(jīng)發(fā)酵后蛋白疏水相互作用明顯增強(qiáng)，從而引起蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變和蛋白聚集，此時(shí)，酸誘導(dǎo)蛋白的變性利于蛋白分子展開，使埋藏在分子內(nèi)部的巰基外露被氧化成二硫鍵。另外，發(fā)酵20～80 d時(shí)S4＞S5＞S3，之后變?yōu)镾5＞S4＞S3，表明二硫鍵在發(fā)酵80 d后的酸肉蛋白三維結(jié)構(gòu)中起主導(dǎo)作用。S3～S5未呈規(guī)律性較強(qiáng)的變化，可能與發(fā)酵后形成非二硫共價(jià)鍵或參與了蛋白三維結(jié)構(gòu)等有關(guān)[17]。這些改變對(duì)酸肉蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響，可影響酸肉感官品質(zhì)和營養(yǎng)特性。

2.2 酸肉發(fā)酵中蛋白表面疏水性的變化

隨發(fā)酵時(shí)間延長，肌漿蛋白表面疏水性略增后快速下降（峰值為發(fā)酵20 d），這可能與發(fā)酵初始時(shí)（20 d）肌漿蛋白分子逐漸舒展，構(gòu)象變得疏松和不穩(wěn)定，使埋藏于非極性環(huán)境的蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)外露到極性環(huán)境中有關(guān)。隨發(fā)酵時(shí)間延長，疏水性氨基酸殘基大量外露，引起蛋白分子間疏水作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)發(fā)生疏水聚集，使其表面疏水性下降。肌原纖維蛋白表面疏水性隨發(fā)酵進(jìn)行快速下降后保持波動(dòng)變化（圖1），說明酸肉的肌原纖維蛋白分子大部分疏水性氨基酸殘基主要被包埋在分子內(nèi)部。谷值出現(xiàn)在發(fā)酵50 d時(shí)，這可能與發(fā)酵中pH值變化及蛋白質(zhì)在酶作用下的降解有關(guān)[18]。

圖1 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白表面疏水性在發(fā)酵中的變化Fig. 1 Changes in surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins and myofibrillar proteins

2.3 酸肉發(fā)酵中蛋白紫外吸收的變化

圖2 酸肉蛋白質(zhì)的紫外吸收及其二階導(dǎo)光譜圖的變化Fig. 2 Changes in zero-order and the second-derivative UV spectra of sour pork proteins

發(fā)酵20 d后肌原纖維蛋白的紫外吸收圖譜相對(duì)于發(fā)酵0 d差異明顯（圖2A1），說明發(fā)酵改變了酸肉蛋白的結(jié)構(gòu)，特征峰出現(xiàn)波動(dòng)變化主要與肌原纖維蛋白暴露的色氨酸等氨基酸殘基總量有關(guān)。經(jīng)對(duì)紫外吸收光譜進(jìn)行二階導(dǎo)運(yùn)算，得肌原纖維蛋白紫外二階導(dǎo)圖譜（圖2A2），顯示發(fā)酵0 d時(shí)，284.5 nm和292 nm處有兩個(gè)負(fù)吸收峰，其中284.5 nm處吸收峰歸屬酪氨酸和色氨酸的共同作用；發(fā)酵20 d時(shí)紫外二階導(dǎo)光譜未發(fā)生紅移或藍(lán)移，發(fā)酵50 d后發(fā)生了小幅度紅移并保持穩(wěn)定，說明芳香族氨基酸殘基向更加疏水的環(huán)境移動(dòng)，平均疏水性增強(qiáng)。

不同發(fā)酵階段肌漿蛋白紫外吸收譜圖變化較大（圖2B1），說明肌漿蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)變化較劇烈。發(fā)酵0 d時(shí)，肌漿蛋白紫外二階導(dǎo)圖譜（圖2B2）中285 nm和293 nm處有負(fù)吸收峰，發(fā)酵20 d后相對(duì)0 d時(shí)發(fā)生了約1～2.5 nm的藍(lán)移，表明酪氨酸和色氨酸的微環(huán)境極性增加。

2.4 酸肉發(fā)酵中蛋白內(nèi)源熒光光譜變化

圖3 酸肉蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度變化Fig. 3 Changes in intrinsic fluorescence intensity of sour pork proteins

如圖3A所示，發(fā)酵20 d時(shí)酸肉的色氨酸熒光損失顯著，隨發(fā)酵時(shí)間延長色氨酸熒光強(qiáng)度略增后逐漸減弱，180 d時(shí)的熒光強(qiáng)度約為發(fā)酵0 d時(shí)的65.7%，說明在發(fā)酵過程中酸肉蛋白暴露的色氨酸殘基逐漸減少；可能與蛋白變性舒展，暴露出更多疏水基團(tuán)，蛋白質(zhì)分子間相互作用力增強(qiáng)而發(fā)生疏水聚集，從而將更多色氨酸殘基包埋于蛋白分子內(nèi)部疏水性更強(qiáng)的環(huán)境中有關(guān)。色氨酸熒光損失被認(rèn)為是氧化改變?nèi)忸惖鞍椎某跫?jí)表達(dá)和引起蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值損失[19]。另外，發(fā)酵0 d蛋白的最大發(fā)射波長為341 nm，發(fā)酵50 d紅移至345 nm，表明發(fā)酵中酸肉蛋白結(jié)構(gòu)逐漸舒展，蛋白分子內(nèi)部的色氨酸向極性更強(qiáng)的微環(huán)境暴露，這與通過UV測得的肌原纖維蛋白疏水性變化趨勢不一致，原因與UV所測結(jié)果為色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基的平均疏水性有關(guān)。有報(bào)道[20]指出當(dāng)激發(fā)波長為290 nm以上時(shí)，可避免如酪氨酸等氨基酸殘基對(duì)色氨酸熒光的干擾。為此，考察激發(fā)波長295 nm時(shí)酸肉蛋白內(nèi)源性熒光的變化（圖3B），在此激發(fā)波長下的色氨酸熒光強(qiáng)度變化趨勢與激發(fā)波長283 nm類似。但295 nm激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較弱一些。

2.5 酸肉發(fā)酵中蛋白拉曼光譜變化

本實(shí)驗(yàn)采用拉曼光譜對(duì)酸肉進(jìn)行原位檢測，并結(jié)合報(bào)道的蛋白質(zhì)拉曼光譜[16]進(jìn)行比對(duì)，對(duì)酸肉蛋白肽鍵骨架和氨基酸側(cè)鏈的拉曼譜帶進(jìn)行指認(rèn)，結(jié)果見圖4和表2。

圖4 酸肉蛋白質(zhì)拉曼光譜圖（400～2 000 cm－1）Fig. 4 Raman spectra of sour pork proteins (400-2 000 cm-1)

表2 酸肉蛋白質(zhì)的拉曼特征峰歸屬及指認(rèn)Table 2 Assignment of some bands in the Raman spectra of sour pork proteins

2.5.1 S—S伸縮振動(dòng)變化

圖5 酸肉蛋白質(zhì)拉曼光譜圖（400～2 000 cm-1）Fig. 5 Raman spectra of sour pork proteins (400-2 000 cm-1)

二硫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力，其構(gòu)象在拉曼光譜中的吸收譜帶為510～550 cm－1，其中515 cm－1附近特征峰為扭式-扭式-扭式構(gòu)象，525 cm－1附近特征峰為扭式-扭式-反式構(gòu)象，540 cm－1附近特征峰為反式-扭式-反式構(gòu)象[21]。不同發(fā)酵時(shí)段酸肉均存在這三種構(gòu)象（圖5）。隨發(fā)酵進(jìn)行，各構(gòu)象吸收峰均發(fā)生小幅波動(dòng)變化，說明發(fā)酵在一定程度影響了蛋白質(zhì)二硫鍵。發(fā)酵80 d后，525 cm－1附近的特征峰減弱甚至消失，而在529 cm－1或534 cm－1出現(xiàn)一個(gè)條帶更寬的特征峰，說明原本的二硫鍵發(fā)生損失或扭式-扭式-反式構(gòu)象的二硫鍵可能向反式-扭式-反式構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

2.5.2 色氨酸殘基微環(huán)境變化

757 cm－1附近譜帶的伸縮振動(dòng)可表征芳香族氨基酸中色氨酸殘基的微環(huán)境變化，當(dāng)?shù)鞍追肿又猩彼嵯驑O性溶劑暴露時(shí)，相對(duì)峰強(qiáng)度會(huì)減弱。發(fā)酵20 d時(shí)757 cm－1處歸一化強(qiáng)度由0 d的1.48下降至0.47并保持穩(wěn)定（表3），說明經(jīng)發(fā)酵后的酸肉蛋白大部分色氨酸殘基在疏水相互作用下暴露到極性更強(qiáng)的環(huán)境中，并在一定時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)；發(fā)酵110 d時(shí)峰強(qiáng)小幅回升，隨后逐漸減弱，該變化趨勢與蛋白熒光光譜檢測趨勢相似。

2.5.3 酪氨酸殘基微環(huán)境變化

特征峰處于850 cm－1和830 cm－1處或鄰近譜帶可監(jiān)測色氨酸殘基周圍的微環(huán)境及判斷色氨酸殘基被包埋程度[22]。由表3可知，發(fā)酵0 d時(shí)850 cm－1/830 cm－1峰強(qiáng)比為0.95，說明原料蛋白色氨酸殘基主要為被包埋狀態(tài)，有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合[23]。隨發(fā)酵時(shí)間延長逐漸增加后在1.08～1.55間波動(dòng)，表明色氨酸殘基暴露于水溶液或極性環(huán)境中，或作為中到弱度氫鍵的接受體和供體。與Liu Ru等[21]報(bào)道魚和豬肉在加工鹽腌階段，850 cm－1/830 cm－1峰強(qiáng)比呈增加趨勢吻合。有報(bào)道單獨(dú)酸化的肌原纖維蛋白色氨酸殘基趨向于埋藏在肌球蛋白分子內(nèi)部，而添加內(nèi)源蛋白酶后色氨酸殘基重新暴露到蛋白分子表面，并認(rèn)為發(fā)酵中蛋白質(zhì)先發(fā)生變性聚集，后發(fā)生內(nèi)源性蛋白酶水解[24]。酸肉在發(fā)酵中可能也發(fā)生了類似變化。

2.5.4 CH3和CH2彎曲振動(dòng)

1 450 cm－1附近的拉曼譜帶由CH3和CH2的彎曲振動(dòng)引起，可表征脂肪族氨基酸微環(huán)境變化，對(duì)疏水相互作用敏感[25]。由表3可知，1 450 cm－1峰強(qiáng)逐漸下降并波動(dòng)變化，表明不同發(fā)酵時(shí)段脂肪族氨基酸疏水環(huán)境狀態(tài)存在一定差異。

2.5.5 C—C鍵伸縮振動(dòng)

890～1 060 cm－1拉曼譜帶可表征C—C鍵伸縮振動(dòng)變化，也可獲取蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋信息。如表3所示，940 cm－1處的歸一化峰強(qiáng)度總體呈逐漸下降趨勢，表明α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，但發(fā)酵110 d時(shí)峰強(qiáng)度相對(duì)其他發(fā)酵時(shí)段有所增強(qiáng)，可能是蛋白質(zhì)進(jìn)一步降解引起多肽骨架變化導(dǎo)致。940 cm－1處峰強(qiáng)度變化與曲線擬合計(jì)算α-螺旋含量變化趨勢基本一致，也印證了發(fā)酵110 d時(shí)蛋白質(zhì)可能發(fā)生了重組，與曹錦軒等[26]報(bào)道吻合。

2.5.6 脂肪族C—H的振動(dòng)

2 800～3 000 cm－1拉曼光譜可反映脂肪族C—H的伸縮振動(dòng)變化。如圖6所示，發(fā)酵0 d酸肉在2 854 cm－1和2 931 cm－1處有兩個(gè)明顯強(qiáng)峰，前者由?；虲H2對(duì)稱性伸縮振動(dòng)引起，后者由CH2和CH3不對(duì)稱性伸縮振動(dòng)引起。發(fā)酵20 d后這兩個(gè)峰均向高波數(shù)偏移，分別移至2 880 cm－1和2 935 cm－1附近譜帶，這可能與脂肪族氨基酸的暴露程度有關(guān)[27]。另外，2 935 cm－1處的歸一化峰明顯強(qiáng)于2 880 cm－1處，說明酸肉脂肪族氨基酸主要以CH2不對(duì)稱性振動(dòng)為主。總體上，2 935 cm－1處峰強(qiáng)逐漸減弱后逐漸增強(qiáng)，但各發(fā)酵時(shí)段峰強(qiáng)均低于發(fā)酵0 d時(shí)，這可能與發(fā)酵后蛋白疏水性增強(qiáng)有關(guān)[28]。

2.5.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

蛋白質(zhì)酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）常用于研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[29]。肉類蛋白用于表征蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)酰胺I帶的拉曼圖譜通常集中在1 645～1 685 cm－1，包括α-螺旋、無規(guī)卷曲、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，歸屬的拉曼譜帶分別為1 650～1 658 cm－1、1 660～1 665 cm－1、1 665～1 680 cm－1和1 680 cm－1[30]。采用Peakfit 4.12軟件對(duì)酸肉蛋白酰胺I帶進(jìn)行傅里葉去卷積結(jié)合曲線擬合以獲取蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)信息變化，得酸肉蛋白在不同發(fā)酵時(shí)段酰胺I帶去卷積后的圖譜（圖7）。發(fā)酵0 d時(shí)主導(dǎo)峰位于1 655 cm－1處；20 d時(shí)1 654 cm－1主導(dǎo)峰的優(yōu)勢明顯減弱；50 d時(shí)主導(dǎo)峰偏移至1 662 cm－1，說明α-螺旋逐漸展開；80 d時(shí)出現(xiàn)雙主導(dǎo)峰（1 655 cm－1和1 662 cm－1），110 d后主導(dǎo)峰又重回1 655 cm－1，說明發(fā)酵80～110 d時(shí)段α-螺旋有可能重新生成；繼續(xù)發(fā)酵，主導(dǎo)峰逐漸向高波長處移動(dòng)，180 d時(shí)，1 663 cm－1和1 669 cm－1成了新的主導(dǎo)峰，說明無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)或β-折疊有所增加。

圖7 發(fā)酵過程中酸肉蛋白質(zhì)酰胺I帶去卷積變化圖譜Fig. 7 Deconvolved and curve fitted bands of amide I of sour pork proteins during fermentation

表4 發(fā)酵過程中酸肉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化Table 4 Changes in the relative amounts of protein secondary structures in sour pork during fermentation

由表4可知，發(fā)酵0 d蛋白α-螺旋相對(duì)含量最高，無規(guī)卷曲最低。隨發(fā)酵進(jìn)行，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量逐漸下降；β-折疊呈上升趨勢，發(fā)酵140 d時(shí)超過α-螺旋成為二級(jí)結(jié)構(gòu)中主體元素；無規(guī)卷曲變化趨勢與α-螺旋變化基本相反。這可能是發(fā)酵使α-螺旋解旋生成β-折疊或無規(guī)卷曲以及β-轉(zhuǎn)角和β-折疊相互轉(zhuǎn)化，使α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量逐漸下降，β-折疊和無規(guī)卷曲相對(duì)含量上升。有報(bào)道[31]指出pH值從7.0降至5.0時(shí)，α-螺旋減少、β-折疊增多；NaCl添加量增加，豬肉糜蛋白α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角降低，而β-折疊和無規(guī)卷曲上升[32]，這與本研究變化趨勢相似。表明酸肉發(fā)酵中添加的食鹽及發(fā)酵產(chǎn)酸均導(dǎo)致了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。其中，發(fā)酵80～110 d時(shí)α-螺旋相對(duì)含量略有上升，可能在此時(shí)發(fā)生了結(jié)構(gòu)重組，曲線擬合結(jié)果與去卷積結(jié)果基本吻合。引發(fā)重組的原因可能與蛋白降解或蛋白經(jīng)一定程度酶解引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白等電點(diǎn)和疏水性改變有關(guān)[33]。

3 結(jié) 論

酸肉發(fā)酵中優(yōu)勢微生物為乳酸菌，優(yōu)勢菌群主要是片球菌屬（Pediococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）[6]。有報(bào)道指出乳酸菌可分泌胞外蛋白酶[34]，加上乳酸菌產(chǎn)酸及發(fā)酵中添加鹽的脅迫作用，酸肉蛋白質(zhì)在長時(shí)間發(fā)酵中發(fā)生了一系列變化，進(jìn)而影響酸肉的品質(zhì)。

對(duì)酸肉蛋白進(jìn)行相關(guān)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，酸肉肌原纖維蛋白表面疏水性快速下降后呈較小幅度的下降趨勢，且其色氨酸殘基發(fā)生了熒光損失現(xiàn)象，說明經(jīng)發(fā)酵后肌原纖維蛋白可能發(fā)生了疏水聚集。蛋白二級(jí)測定結(jié)果顯示，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角含量基本呈現(xiàn)下降趨勢，β-折疊和無規(guī)卷曲的含量則基本上呈上升趨勢，其中發(fā)酵110 d時(shí)酸肉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了重排現(xiàn)象。蛋白分子間相互作用力結(jié)果顯示，蛋白分子間相互作用力在發(fā)酵中變化顯著，靜電相互作用力逐漸減弱，而疏水作用力和二硫鍵明顯增強(qiáng)并呈波動(dòng)變化，是維持酸肉蛋白穩(wěn)定性的主要作用力。這些結(jié)果表明，發(fā)酵后，可能在酸和鹽的誘導(dǎo)蛋白變性作用下，酸肉蛋白疏水相互作用力顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白發(fā)生疏水聚集，將更多的疏水性包埋于蛋白分子內(nèi)部，引起表明疏水性下降和蛋白熒光強(qiáng)度發(fā)生下降，而疏水作用力增強(qiáng)和二硫鍵的增加引起的蛋白聚集和交聯(lián)，以及氫鍵作用力增強(qiáng)可能是引起α-螺旋相對(duì)含量減少，β-折疊相對(duì)含量增多的主要原因。

綜上，采用發(fā)酵的方式保藏酸肉，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化，這些變化可從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)水平解釋發(fā)酵對(duì)酸肉品質(zhì)的影響。