丙二醛氧化對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的影響

周麟依，孫玉鳳，吳 非*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

我國(guó)米糠資源豐富，年產(chǎn)量達(dá)1 800萬(wàn) t。米糠中蛋白質(zhì)約占20%。米糠蛋白中可溶性組分約占七成，近似于大豆蛋白。米糠蛋白所含有的必需氨基酸組成相對(duì)完整，接近于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織推薦模式。米糠蛋白中的賴(lài)氨酸含量比大米胚乳、小麥面粉等谷物蛋白的含量相對(duì)要高，并且米糠蛋白的生物效價(jià)接近于乳酪蛋白，消化率高于90%，因此被認(rèn)為是一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物蛋白。

蛋白質(zhì)的氧化是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接誘導(dǎo)或者由氧化應(yīng)激反應(yīng)的次級(jí)副產(chǎn)物間接誘導(dǎo)反應(yīng)。氧化過(guò)程產(chǎn)生的這種結(jié)構(gòu)修飾使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，如主鏈斷裂、分子交聯(lián)、分子解折疊以及構(gòu)象改變。目前，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化的促氧化劑種類(lèi)較多，如分子氧受到光活化轉(zhuǎn)化為激發(fā)單線(xiàn)態(tài)氧（1O2），或減少一個(gè)電子形成超氧陰離子自由基（O2－·）。而脂肪氧化也可促使蛋白質(zhì)氧化，脂肪氧合酶會(huì)催化大豆油、米糠油等植物油氧化，在此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的烷氧自由基以及醛、酮等活性次生氧化產(chǎn)物，這些氧化產(chǎn)物氧化活性較高，進(jìn)一步誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)氧化。米糠含有活性較強(qiáng)的脂肪水解酶及脂肪氧化酶，它們可水解脂質(zhì)產(chǎn)生游離脂肪酸，從而導(dǎo)致米糠酸敗[1]。此過(guò)程中產(chǎn)生的游離脂肪酸容易氧化形成脂質(zhì)自由基和脂質(zhì)活性產(chǎn)物，進(jìn)而誘導(dǎo)米糠蛋白氧化，嚴(yán)重影響了米糠蛋白的功能性[2-4]。

目前，脂質(zhì)過(guò)氧化被定義為多不飽和脂肪酸或脂質(zhì)的氧化變質(zhì)。脂質(zhì)過(guò)氧化是由一個(gè)自由基的復(fù)雜鏈反應(yīng)所引起。多不飽和脂肪酸受自由基的氧化還原奪氫反應(yīng)生成脂質(zhì)烷基自由基，而后通過(guò)分子重排作用形成共軛二烯結(jié)構(gòu)，繼而共軛二烯結(jié)構(gòu)在脂質(zhì)烷基自由基上進(jìn)一步通過(guò)氧化反應(yīng)逐步形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相對(duì)較差的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物[5]。脂質(zhì)氫過(guò)氧化物失穩(wěn)后逐漸轉(zhuǎn)化為活性羰基化合物[6]。對(duì)比于脂質(zhì)自由基及脂質(zhì)氫過(guò)氧化物，活性醛分子具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并可通過(guò)更大的分子擴(kuò)散作用對(duì)蛋白產(chǎn)生更大程度的氧化攻擊[7]。最具代表性且最易造成氧化損傷的脂質(zhì)過(guò)活性產(chǎn)物主要是丙烯醛、4-羥基-2-壬烯醛及丙二醛（malondialdehyde，MDA），并且MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)最易形成的活性醛，盡管MDA的氧化反應(yīng)活性弱于丙烯醛，但由于分子內(nèi)存在兩個(gè)羰基，可通過(guò)與蛋白質(zhì)之間發(fā)生更大程度共價(jià)交聯(lián)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能性[8-9]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和過(guò)氧化脂質(zhì)接觸反應(yīng)時(shí)，過(guò)氧化脂質(zhì)亦可通過(guò)疏水相互作用或氫鍵作用與蛋白復(fù)合生成脂蛋白復(fù)合體[10-12]。在脂質(zhì)氧化反應(yīng)生成的多種活性醛均可與氨基發(fā)生醛醇縮合作用進(jìn)而形成色素物質(zhì)[13-15]，甚至嚴(yán)重影響酶活性及蛋白質(zhì)生物效價(jià)及營(yíng)養(yǎng)健康功能[16-18]。

目前，MDA對(duì)部分植物蛋白結(jié)構(gòu)及功能的影響已有研究，但MDA氧化對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究較少。因此，選MDA代表脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中的活性次生氧化產(chǎn)物，研究脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)以及構(gòu)效關(guān)系的影響。本研究有助于全面深入了解米糠蛋白的氧化機(jī)理，為米糠蛋白產(chǎn)品的合理研發(fā)提供思路，促進(jìn)米糠蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠蛋白由實(shí)驗(yàn)室自制；1,1,3,3-四甲氧基丙烷（1,1,3,3-tetramethoxy propane，TMP）、鹽酸胍 美國(guó)Sigma公司；Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司；二硝基苯肼 天津博迪化工股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜系統(tǒng) 美國(guó)尼高力公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 中國(guó)上海雷磁公司；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白提取

取原料米糠過(guò)60 目篩，按照1∶10（g/mL）加入正己烷，室溫下不斷攪拌脫脂4 h，反復(fù)脫脂2～3 次，在4 000 r/min離心10 min，上清液用蒸餾法回收正己烷，脫脂后將米糠置于通風(fēng)櫥揮發(fā)48 h，再將脫脂米糠過(guò)60 目篩，取10 g放入100 mL蒸餾水中，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH 9.5，在50 ℃條件下攪拌2 h，然后在3 000 r/min離心20 min，將沉淀去除，再用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH 3.8后3 000 r/min離心20 min，將去除上清液，沉淀即為米糠蛋白，將米糠蛋白用蒸餾水洗脫兩次并最終調(diào)節(jié)pH 7.0，并進(jìn)行凍干備用。

1.3.2 MDA氧化米糠蛋白的制備

參考Adams等[9]方法通過(guò)水解TMP制備MDA。將10.0 mL 5.0 mol/L鹽酸加入31.6 mL蒸餾水中充分混勻后加入8.4 mL TMP，快速移入避光水浴鍋中在40 ℃條件下進(jìn)行30 min氧化反應(yīng)，通過(guò)隔時(shí)攪拌處理防止團(tuán)聚物產(chǎn)生，TMP水解處理后迅速用6 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH 7.6，繼而利用0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液定容TMP水解液至1 L。通過(guò)摩爾吸光系數(shù)31 500 L/（mol·cm）精確定量MDA的濃度，為了保證MDA的氧化活性，反應(yīng)儲(chǔ)液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

為制備MDA氧化誘導(dǎo)米糠蛋白，利用0.01 mol/L、pH 7.6的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)配米糠蛋白溶液至質(zhì)量濃度為10 mg/mL，并加入0.5 mg/mL NaN3防止蛋白腐敗變性，別用0.001、0.01、0.1、1 mol/L的MDA溶液作為氧化誘導(dǎo)劑加入的米糠蛋白溶液中，經(jīng)過(guò)隔日避光25 ℃恒溫條件下連續(xù)振蕩進(jìn)行氧化處理，誘導(dǎo)米糠蛋白發(fā)生MDA氧化。氧化誘導(dǎo)后米糠蛋白溶液迅速進(jìn)行4 ℃冷浴處理，之后轉(zhuǎn)移至低溫離心機(jī)中30 min二次離心處理，留存上清液通過(guò)低溫透析處理后濾去未參與反應(yīng)的MDA，剩余蛋白組分經(jīng)過(guò)24 h冷凍干燥后即可制備為MDA誘導(dǎo)氧化米糠蛋白。

1.3.3 米糠蛋白羰基含量測(cè)定

蛋白質(zhì)氧化程度主要利用Huang Youru等[19]羰基含量的測(cè)試分析方法進(jìn)行測(cè)試。1.3.2節(jié)制備的氧化米糠蛋白充分溶解于去離子水中，經(jīng)過(guò)2 h充分?jǐn)嚢韬筮M(jìn)行4 ℃低溫10 000×g離心30 min，通過(guò)Lowery法確定上清液中氧化蛋白質(zhì)量濃度，通過(guò)稀釋調(diào)控上清液中氧化蛋白質(zhì)量濃度為3～6 mg/mL。

將上述0.35 mL的氧化蛋白溶液加入1 mL 2 mol/L HCl溶液中（含有10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼），在室溫條件下水浴處理2 h。另取0.35 mL氧化米糠蛋白溶液加入1 mL不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液中，在相同處理?xiàng)l件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)作為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組離心管中分別加入0.45 mL 40%的三氯乙酸溶液快速充分混合后低溫10 000×g離心20 min，除去上清液，保留沉淀組分利用乙醇與乙酸乙酯的等體積溶液進(jìn)行多次洗滌離心，保留最終沉淀蛋白。將收集蛋白溶解入1.0 mL 0.1 mol/L含6 mol/L鹽酸胍的pH 7.0磷酸鹽緩沖液，通過(guò)37 ℃水浴處理20 min，通過(guò)隔時(shí)快速搖晃防止聚沉現(xiàn)象的發(fā)生。以空白組為參比在367 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行數(shù)值矯正，最終以22 000 L/（mol·cm）的消光系數(shù)計(jì)算蛋白質(zhì)羰基含量。

1.3.4 米糠蛋白游離氨基的測(cè)定

400 mg鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）試劑充分溶解于1 mL甲醇溶液中，而后依次向溶液中加入預(yù)先配制的質(zhì)量濃度為200 g/L十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液2.5 mL及濃度為0.1 mol/L的硼酸溶液25 mL，繼而轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥內(nèi)加入100 μL的β-巰基乙醇，最后將溶液用蒸餾水定容至50 mL，制備成OPA溶液用于后續(xù)檢測(cè)分析，量取OPA試劑4 mL與200 μL氧化米糠蛋白樣品充分混勻后進(jìn)行35 ℃水浴處理2 min，以蒸餾水空白組為對(duì)照在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.5 米糠蛋白游離巰基和二硫鍵含量測(cè)定

利用經(jīng)典的5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB）比色法對(duì)蛋白游離巰基、總巰基及二硫鍵含量進(jìn)行分析測(cè)定。取150 mg氧化米糠蛋白加入10 mL 0.1 mol/L含有l(wèi) mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和1% SDS的pH 8.0的磷酸鹽緩沖液A中，充分混合均勻后8 000 r/min離心30 min，利用Lowery法對(duì)上清液中氧化米糠蛋白含量進(jìn)行定量。為精確測(cè)定游離巰基含量，量取3 mL上述氧化米糠蛋白溶液加入磷酸鹽緩沖液A后，滴入0.1 mL DNTB溶液（39.6 mg DNTB溶解于10 mL磷酸鹽緩沖液A中制備得到），充分振蕩混合后進(jìn)行室溫1 h水浴處理，水浴處理后溶液經(jīng)30 min的低溫高速離心處理取上清液，通過(guò)參比DNTB空白組，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以13 600 L/（mol·cm）消光系數(shù)計(jì)算游離巰基含量。精確測(cè)定氧化米糠蛋白中總巰基基團(tuán)含量，取1 mL氧化米糠蛋白溶液，依次加入0.05 mL β-巰基乙醇及4 mL 0.1 mol/L尿素-鹽酸胍混合溶液（5∶8，V/V），充分混合后進(jìn)行室溫1 h水浴處理后，將10 mL 12 g/100 mL三氯乙酸加入溶液中進(jìn)行室溫水浴處理1 h，再次以4 500 r/min離心10 min獲取沉淀物，重復(fù)上述步驟兩次后，將最終沉淀物溶液于最后將沉淀溶解在10 mL 0.1 mol/L其中含有l(wèi) mmol/L EDTA和1% SDS pH 8.0磷酸鹽緩沖液中，再加入0.08 mL DNTB試劑，劇烈振蕩搖勻溶液后在室溫條件下進(jìn)行水浴處理1 h，再加入10 mL 12 g/100 mL的三氯乙酸，室溫條件下二次水浴處理1 h，將混合溶液中速低溫離心處理10 min。蛋白沉淀物再次分散于20 mL 12%的三氯乙酸溶液中，充分離心棄去β-巰基乙醇組分，重復(fù)3 次上述處理后低溫高速離心30 min。以不加DNTB的空白對(duì)比組進(jìn)行參比，測(cè)定上清液412 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以13 600 L/（mol·cm）消光系數(shù)計(jì)算氧化米糠蛋白中總巰基含量。

1.3.6 米糠蛋白傅里葉紅外光譜分析

為有效消除蛋白質(zhì)熒光背景，利用BRAVO拉曼光譜儀對(duì)大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液進(jìn)行拉曼分析測(cè)試，測(cè)試條件為功率80 mW、激發(fā)光波長(zhǎng)532 nm、曝光時(shí)間60 s，掃描300～3 500 cm－1范圍內(nèi)的波數(shù)譜段，每個(gè)樣品都重復(fù)掃描3 次以上，由計(jì)算機(jī)做信號(hào)累加平均并繪圖輸出，峰位誤差控制在±3 cm－1內(nèi)。

1.3.7 米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜分析

將氧化米糠蛋白分散溶解于中性磷酸鹽緩沖溶液中，調(diào)控氧化米糠蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL。熒光分光光度計(jì)以米糠蛋白所含的色氨酸基團(tuán)為熒光探針，為避免酪氨酸的熒光干擾，設(shè)置熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，熒光發(fā)散光譜的掃描范圍設(shè)置為300～400 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬設(shè)置為7.5 nm[20]。

1.3.8 米糠蛋白表面疏水性測(cè)定

參考Kato等[21]的8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針?lè)y(cè)定氧化米糠蛋白表面疏水性并進(jìn)行適當(dāng)修正。用0.1 mol/L中性磷酸鹽緩沖溶液充分溶解米糠蛋白，10 000×g高速離心處理30 min除去沉淀物，以L(fǎng)owery法分析測(cè)試上清液中蛋白質(zhì)量濃度，通過(guò)磷酸鹽緩沖液的逐步稀釋?zhuān){(diào)控氧化米糠蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.05～0.4 mg/mL，取40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液滴加至不同質(zhì)量濃度的米糠蛋白溶液4 mL，經(jīng)振蕩混勻后靜置3 min，然后進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)試，測(cè)試條件為激發(fā)波長(zhǎng)λex為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem為468 nm，掃描夾縫5 nm，掃描速率10 nm/s。將熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量濃度作線(xiàn)性圖，以初始段的斜率值計(jì)為氧化米糠蛋白的表面疏水性大小。

1.3.9 米糠蛋白凝膠電泳分析

參考Laemmli[22]凝膠電泳測(cè)試方法對(duì)氧化米糠蛋白并作適度調(diào)整。分離膠和濃縮膠分別為12%、 5%。將氧化米糠蛋白樣品與上樣緩沖溶液混合配制蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，上樣緩沖溶液的配制通過(guò)加入100 mg SDS、0.25 mL β-巰基乙醇、2 mg溴酚藍(lán)、2 mL pH 8.0的0.05 mol/L Tris-HCl溶液、2.0 mL甘油，最后定容至10 mL。在95 ℃水浴條件下加熱5 min。蛋白凝膠電泳的上樣量為10 μg。電泳測(cè)試過(guò)程中調(diào)控濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。以甲醇、冰乙酸、0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250配制染色劑侵染蛋白電泳膠，并以甲醇、冰乙酸、水配制為脫色劑用于脫除蛋白電泳膠的底色背景。

1.3.10 米糠蛋白溶解度測(cè)定

參考Shimada等[23]的方法。準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg氧化米糠蛋白樣品充分溶解于10 mL蒸餾水中，在室溫條件下充分?jǐn)嚢? h，高速離心20 min除去沉淀。以L(fǎng)owry法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以上清液質(zhì)量濃度與米糠蛋白質(zhì)量濃度的比例表示米糠蛋白溶解度。

1.3.11 米糠蛋白粒徑分布測(cè)定

利用Mastersizer 2000激光光散射儀對(duì)米糠蛋白的粒徑分布進(jìn)行分析測(cè)定。不同氧化誘導(dǎo)條件處理下的米糠蛋白樣品溶解于去離子水中并配制溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在室溫條件下充分?jǐn)嚢? h，隔夜處理后保證氧化米糠蛋白充分溶解，用激光光散射儀進(jìn)行米糠蛋白的粒徑分布測(cè)試，折射率為1.330[24]。

1.3.12 米糠蛋白濁度測(cè)定

將氧化米糠蛋白用磷酸鹽緩沖液稀釋40 倍，以磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的吸光度，濁度計(jì)算公式為：

式中：A為稀釋乳液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度；V為稀釋倍數(shù)；I為光程差0.01 m。

1.3.13 米糠蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

取1.0 mL植物油和3.0 mL 0.2%米糠蛋白磷酸鹽緩沖溶液，混合振蕩并進(jìn)行高速均質(zhì)處理制備為均一乳液，從底部抽取50 μL樣品，用5 mL 0.1% SDS溶液稀釋?zhuān)?00 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A0。靜置30 min后再此從底部各取50 μL樣品，用5 mL 0.1% SDS溶液稀釋?zhuān)瑴y(cè)吸光度A30，同溶度SDS為空白。按式（2）、（3）計(jì)算米糠蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性：

式中：T為濁度（2.303）；N為稀釋倍數(shù)250；C為乳化液形成前蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；U為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)（0.25）；A0為0 min的吸光度。

1.3.14 米糠蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)量0.2 g米糠蛋白樣品置于已加入0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液20 mL的50 mL燒杯中。使用高速分均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)30 s，連續(xù)3 次約30 min，測(cè)均質(zhì)后體積（V0），靜置30 min后再此讀取液面體積V30。起泡性和泡沫穩(wěn)定性參見(jiàn)公式（4）、（5）：

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，利用SPSS Statistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，用Tukey's HSD法進(jìn)行ANOVA差異性檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 9.1軟件、OMNIC軟件包、PeakFit 4.12軟件分析等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化對(duì)米糠蛋白羰基含量的影響

圖1 MDA氧化誘導(dǎo)對(duì)米糠蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of MDA concentration on carbonyl content of rice bran protein

氨基酸側(cè)鏈上的NH－或NH2－基團(tuán)極易受到羥自由基的攻擊，進(jìn)而氧化生成新的羰基基團(tuán)[25-26]。如圖1所示，氧化米糠蛋白羰基含量隨著MDA濃度增大逐漸增加。這是由于MDA可與蛋白質(zhì)分子中的伯胺以等比例的加成反應(yīng)形成烯胺加合物，從而為蛋白分子引入了新的羰基基團(tuán)。此外，研究發(fā)現(xiàn)MDA可作用于半胱氨酸、組氨酸及賴(lài)氨酸等氨基酸殘基的親核側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)而反應(yīng)生成席夫堿誘導(dǎo)蛋白羰基化[27-28]。另外，由于MDA結(jié)構(gòu)的特殊性，在MDA分子上連接有兩個(gè)羰基，因此MDA分子中的一個(gè)羰基氧化作用連接于蛋白質(zhì)的可同時(shí)引入另外一個(gè)羰基基團(tuán)[9]。Burcham等[29]研究發(fā)現(xiàn)MDA氧化誘導(dǎo)牛血清白蛋白的羰基值隨著MDA氧化誘導(dǎo)濃度的增大及氧化誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。

2.2 MDA氧化對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖2 MDA氧化米糠蛋白的紅外光譜Fig. 2 FTIR spectra of MDA oxidation of rice bran protein

表1 MDA氧化對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of oxidative modification by malondialdehyde on secondary structure contents of rice bran protein%

如圖2和表1所示，隨著MDA氧化誘導(dǎo)濃度的增加，米糠蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊結(jié)構(gòu)以及反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)含量逐漸增加，無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量逐漸下降。α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊結(jié)構(gòu)及反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸增加，這主要是與氧化米糠蛋白分子間疏水作用和靜電作用增大誘導(dǎo)了蛋白分子聚集有關(guān)，此外MDA誘導(dǎo)氧化米糠蛋白的共價(jià)交聯(lián)聚集也是可能原因。Sun Weizheng等[30]研究發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白β-折疊含量隨加工時(shí)間的延長(zhǎng)氧化程度的增大而增加，并且氧化聚集與反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸增加有關(guān)。無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)逐漸降低可能是因?yàn)椴糠譄o(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)。

2.3 MDA氧化對(duì)米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖3 MDA氧化誘導(dǎo)的米糠蛋白內(nèi)源熒光譜圖Fig. 3 Intrinsic fluorescence of rice bran protein oxidized by MDA

如圖3所示，隨著MDA濃度的增加，氧化米糠蛋白內(nèi)源熒光λmax呈現(xiàn)逐漸藍(lán)移的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，MDA氧化會(huì)使兔肌球蛋白、α-晶狀體球蛋白以及牛血清白蛋白的內(nèi)源熒光λmax藍(lán)移的現(xiàn)象[31-33]，并且Traverso等[33]認(rèn)為MDA誘導(dǎo)氧化蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降主要是由于MDA誘導(dǎo)氧化聚集包埋了色氨酸的原因。在酸性條件MDA易與蛋白色氨酸上的吲哚基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而猝滅色氨酸熒光[34]，而由于在本研究中所采用反應(yīng)條件近中性，故而排除了MDA與色氨酸吲哚基團(tuán)反應(yīng)引起的熒光猝滅的可能性，造成米糠蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降應(yīng)當(dāng)主要與氧化米糠蛋白的共價(jià)交聯(lián)聚集有關(guān)。Sun Wenzheng等[35]研究表明熒光強(qiáng)度的變化可用來(lái)表征蛋白質(zhì)氧化情況以及結(jié)構(gòu)變化，乳液熒光強(qiáng)度顯著降低表明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)。葉林[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著氧化濃度的增加，花生蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸下降，表明蛋白質(zhì)色氨酸殘基被轉(zhuǎn)移到更加疏水的非極性環(huán)境中。

2.4 MDA氧化對(duì)米糠蛋白巰基和二硫鍵含量的影響

表2 米糠蛋白樣品游離巰基、總巰基和二硫鍵的含量Table 2 Free sulfhydryl, total sulfhydryl and disulfide bond contents of rice bran protein samples oxidized by MDA

由于巰基對(duì)氧化的極高敏感性，蛋白氧化最早期現(xiàn)象主要為巰基的氧化[36]。如表2所示，隨著MDA濃度的增加，二硫鍵、游離巰基和總巰基含量逐漸降低，這可能是由于自由基活性較高，氧化米糠蛋白二硫鍵逐漸斷裂，內(nèi)部的巰基雖然隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解折疊而暴露，但自由基迅速與其結(jié)合形成亞磺酸和磺酸等氧化產(chǎn)物，使二硫鍵含量，游離巰基和總巰基含量不斷降低。

2.5 MDA氧化對(duì)米糠蛋白游離氨基含量的影響

圖4 MDA氧化對(duì)米糠蛋白游離氨基含量的影響Fig. 4 Effect of MDA oxidation on free amine content of rice bran protein

蛋白側(cè)鏈上帶有的氨基酸均易受到自由基和非自由基ROS攻擊。如圖4所示，MDA氧化誘導(dǎo)使米糠蛋白游離氨基含量隨著氧化濃度的增加逐漸減少，MDA分子中的羰基可直接與米糠蛋白上的氨基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而降低了米糠蛋白的游離氨基含量。

2.6 MDA氧化對(duì)米糠蛋白溶解度的影響

圖5 MDA氧化對(duì)米糠蛋白溶解度的影響Fig. 5 Effect of MDA oxidation on solubility of rice bran protein

如圖5所示，隨著MDA氧化誘導(dǎo)濃度的增加，氧化米糠蛋白溶解度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。這主要是由于氧化米糠蛋白發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)聚集，不可溶性的交聯(lián)聚集體形成降低了米糠蛋白的溶解性。劉晶等[37]研究表明低濃度MDA氧化誘導(dǎo)下大豆蛋白趨于可溶性聚集，而在高濃度MDA氧化誘導(dǎo)下大豆蛋白共價(jià)交聯(lián)聚集體逐漸形成，同時(shí)誘導(dǎo)了可溶性聚集體的再聚集，進(jìn)而形成了不可溶性蛋白聚集物，為大豆蛋白溶解性隨氧化誘導(dǎo)濃度增大逐漸降低的原因。

2.7 MDA氧化對(duì)米糠蛋白電泳結(jié)果的影響

圖6 MDA氧化誘導(dǎo)米糠離蛋白的電泳圖Fig. 6 Electrophoresis profiles of rice bran protein with MDA

米糠蛋白是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成的。盡管現(xiàn)有研究已利用對(duì)不同電泳條帶進(jìn)行了提取和分析，但米糠蛋白中4 種主要蛋白的亞基歸屬尚無(wú)統(tǒng)一定論。Adebiyi等[38]研究指出米糠白蛋白主要亞基的分子質(zhì)量約為31～45 kDa，米糠球蛋白主要亞基的分子質(zhì)量約為33 kDa和53 kDa。Hamada[39]研究表明的米糠白蛋白和球蛋白的分子質(zhì)量分別為10～100 kDa和10～150 kDa。Wang Changyuan等[40]研究發(fā)現(xiàn)米糠白蛋白的主要亞基分布于14～32 kDa分子質(zhì)量區(qū)間，而米糠球蛋白主要亞基的分子質(zhì)量為63、53、49、36、22 kDa，米糠谷蛋白的主要亞基的分子質(zhì)量為54、37、21、13 kDa，而醇溶蛋白的主要亞基分子質(zhì)量為13 kDa和22 kDa。

如圖6所示，對(duì)比已有研究可以認(rèn)定米糠蛋白的主要亞基的分子質(zhì)量分別為62、53、49、36、25、21、18、14 kDa，米糠白蛋白主要亞基的分子質(zhì)量為36 kDa和14 kDa，分子質(zhì)量為62、53、49、36、21 kDa的電泳條帶歸屬于米糠球蛋白亞基，米糠谷蛋白主要亞基的分子質(zhì)量為53、36、21 kDa和14 kDa，醇溶蛋白主要亞基的分子質(zhì)量分別為21 kDa和14 kDa。低氧化誘導(dǎo)濃度下MDA對(duì)米糠蛋白亞基組成無(wú)顯著影響，隨著MDA氧化誘導(dǎo)濃度增加，分子質(zhì)量為53、49、36、21、14 kDa的亞基歸屬條帶均有所變淺，條帶逐漸變窄。MDA分子中含有兩個(gè)羰基，當(dāng)兩個(gè)羰基與不同多肽鏈間的氨基同時(shí)形成席夫堿時(shí)就會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)。由此可知，分子質(zhì)量為53、49、36、21 kDa和14 kDa的亞單位產(chǎn)生了不可溶性交聯(lián)聚集。而隨著氧化誘導(dǎo)濃度的增加，分子質(zhì)量為36、21、14 kDa的亞基逐漸消失，表明蛋白交聯(lián)聚集主要發(fā)生于上述亞基，亞基條帶的消失也是米糠蛋白功能性降低的重要原因。

2.8 MDA氧化對(duì)米糠蛋白表面疏水性的影響

圖7 MDA氧化對(duì)米糠蛋白表面疏水性的影響Fig. 7 Effect of oxidation by MDA on surface hydrophobicity of rice bran protein

如圖7所示，隨著MDA氧化誘導(dǎo)濃度的增加，米糠蛋白表面疏水性逐漸下降。這可能是由于氧化米糠蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出來(lái)的巰基和疏水基團(tuán)不斷發(fā)生氧化性修飾，并通過(guò)共價(jià)交聯(lián)和疏水相互作用等途徑形成氧化聚集體。Boatright等[41]通過(guò)大豆蛋白氧化結(jié)構(gòu)及功能在不同抗氧化劑添加條件下的變化研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白氧化伴隨著表面疏水性的降低。Liang[42]研究發(fā)現(xiàn)即使避光條件下60 ℃的油脂熱氧化也可誘導(dǎo)大豆蛋白氧化進(jìn)而降低了其表面疏水性。黃友如[43]在大豆蛋白的LOX-亞油酸氧化誘導(dǎo)體系下，大豆蛋白的氧化程度隨誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，表面疏水性也隨之逐漸降低。研究發(fā)現(xiàn)，在大米蛋白氧化模擬體系中發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆蛋白氧化程度持續(xù)增加，表面疏水性逐漸下降[44]。吳偉等[45]研究發(fā)現(xiàn)隨著米糠保藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠發(fā)生了氧化酸敗誘導(dǎo)谷蛋白分子結(jié)構(gòu)變化，氧化聚集體逐漸形成進(jìn)而降低了蛋白表面疏水性，印證了本研究的結(jié)論。

2.9 MDA氧化對(duì)米糠蛋白粒徑的影響

圖8 MDA氧化誘導(dǎo)米糠蛋白的粒徑分布Fig. 8 Particle size distribution of MDA-oxidized rice bran protein

表3 米糠蛋白樣品的D43和PDITable 3 D43and PDI of oxidized rice bran protein samples

蛋白質(zhì)氧化誘導(dǎo)的分子交聯(lián)及聚集作用下蛋白質(zhì)分子粒徑趨于變大，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)粒徑分布（圖8）能直觀(guān)地看出蛋白質(zhì)聚集或降解作用。隨著MDA濃度的增加，分子平均粒徑均逐漸增大。通過(guò)粒徑分布圖可知，天然米糠蛋白粒徑主要呈現(xiàn)雙峰分布，其中大蛋白粒徑分布峰歸屬于氧化聚集，而氧化米糠蛋白平均粒徑的增加主要與蛋白聚集體峰的增大有關(guān)。由此可以得知，無(wú)論低濃度或高濃度蛋白氧化條件下米糠蛋白均發(fā)生了氧化聚集效應(yīng)。但氧化聚集與其他氧化作用對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響效應(yīng)相互疊加，是米糠蛋白結(jié)構(gòu)及功能變化的最終原因。而隨著米糠蛋白氧化程度的增加，氧化米糠蛋白粒徑逐漸再聚集形成更大的聚集體。通過(guò)粒徑的變化可知，高濃度MDA氧化誘導(dǎo)條件下米糠蛋白除發(fā)生不可溶性交聯(lián)聚集外，同樣發(fā)生了可溶性分子聚集。

多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）是衡量溶液分布的均勻程度。蛋白質(zhì)PDI值越小說(shuō)明蛋白質(zhì)溶液越均一，PDI值越大說(shuō)明溶液中存在蛋白質(zhì)大小聚集體的分布差距越大。如表3所示，米糠蛋白PDI值隨MDA氧化劑濃度的增加而增大，表明米糠蛋白溶解狀態(tài)下分子粒徑分布均一性變差，這主要是由于氧化聚集體所致。汪建明等[46]認(rèn)為乳蛋白的氧化聚集體分為大粒度聚集體（約1 000 nm）和小粒度聚集體（約100 nm），氧化作用可誘導(dǎo)低粒度聚集體再聚集形成大粒徑聚集體，大粒徑聚集體也解離形成低粒度顆粒，兩種行為同時(shí)存在。Promeyrat等[47]認(rèn)為蛋白質(zhì)粒徑變化主要與蛋白質(zhì)分子交聯(lián)及聚集有關(guān)。黃友如[43]研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解折疊疏水基團(tuán)外露為蛋白聚集提供了疏水聚集作用力，更多有序二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為無(wú)序結(jié)構(gòu)過(guò)程中氫鍵的重組及分子間范德華力也為蛋白聚集提供了聚集作用條件，受多種分子間交互作用力的誘導(dǎo)，氧化蛋白發(fā)生了多重聚集現(xiàn)象，進(jìn)而形成了大粒徑的蛋白聚集體，是粒徑增大的重要誘因。

2.10 氧化對(duì)米糠蛋白質(zhì)濁度的影響

圖9 MDA氧化對(duì)米糠蛋白濁度的影響Fig. 9 Effect of MDA oxidation on turbidity of rice bran protein

蛋白質(zhì)溶液濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度，可用于側(cè)面衡量蛋白質(zhì)相互作用大小及聚集體的相對(duì)尺寸[48-49]。由圖9可知，隨著氧化劑MDA濃度的增加濁度均逐漸增大，這與氧化作用促進(jìn)米糠蛋白的亞基分子聚集有關(guān)，濁度的增加與前述的氧化米糠蛋白粒徑增大相互驗(yàn)證。MDA氧化的米糠蛋白濁度增大與交聯(lián)聚集體及分子聚集體形成有關(guān)。黃友如[43]通過(guò)脂肪氧合酶催化亞油酸誘導(dǎo)大豆蛋白聚集機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，氧化作用誘導(dǎo)了大豆蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)解折疊，暴露出更多的疏水基團(tuán)，并通過(guò)疏水相互作用、靜電作用或氫鍵等構(gòu)建形成較大的聚集體，增加了大豆蛋白的濁度，并伴隨著流體力學(xué)半徑分布范圍的擴(kuò)大。李艷青[50]研究表明羥自由基氧化的鯉魚(yú)蛋由濁度隨氧化程度增大濁度逐漸提高。Cui Xuhai等[51]研究發(fā)現(xiàn)與天然乳清蛋白相比，經(jīng)過(guò)3、5、10 h羥自由基氧化處理的乳清蛋白濁度分別增加16.9%、22.9%和24.3%。牛思思[52]研究發(fā)現(xiàn)，氧化蛋清蛋白的濁度有所增加，并且隨著蛋清蛋白氧化程度的增大，蛋清蛋白的濁度逐漸增加。由此可知，氧化聚集普遍發(fā)生于蛋白氧化過(guò)程中。

2.11 MDA氧化對(duì)米糠蛋白質(zhì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

如圖10所示，隨著MDA濃度的增高，氧化米糠蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著MDA濃度的增大，米糠蛋白表面疏水性逐漸降低，米糠蛋白發(fā)生疏水性聚集，并且由于活性醛會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生Schiff堿反應(yīng)生成交聯(lián)聚集，氧化米糠蛋白形成可溶和不可溶性聚集體均降低了蛋白分子舒張及乳化界面穩(wěn)定作用，故米糠蛋白的乳化能力和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度MDA誘導(dǎo)的大豆蛋白氧化因結(jié)構(gòu)部分解折疊，更多的疏水基團(tuán)外露增加了大豆蛋白的分子結(jié)構(gòu)柔性，提高了大豆蛋白分子油水界面的吸附結(jié)合能力，增加了大豆蛋白的乳化功能，另外大豆蛋白在低濃度丙烯醛氧化誘導(dǎo)下溶解性增加也是乳化性提高的促進(jìn)因素；而高濃度MDA氧化誘導(dǎo)下大豆蛋白團(tuán)聚為不可溶性聚集體降低了分子柔性，減少了界面吸附結(jié)合面積，降低了大豆蛋白的乳化功能[53]。對(duì)比可知，米糠蛋白由于分子交聯(lián)作用強(qiáng)于界面舒張解折疊是其乳化功能降低的重要原因。

圖10 MDA氧化對(duì)米糠蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 10 Effect of MDA oxidation on emulsifying capacity and emulsion stability of rice bran protein

2.12 MDA氧化對(duì)米糠蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

圖11 MDA氧化對(duì)米糠蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響Fig. 11 Effect of MDA oxidation on foaming capacity and foam stability of rice bran protein

由圖11可見(jiàn)，隨MDA氧化誘導(dǎo)濃度的增加，米糠蛋白的起泡性逐漸降低，這主要是由于雖然兩種蛋白氧化作用均部分解開(kāi)了米糠蛋白分子結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)部的疏水殘基更多地暴露于蛋白表面，但此條件下過(guò)強(qiáng)的米糠蛋白疏水作用促進(jìn)了分子間聚集，且由于活性醛會(huì)與蛋白質(zhì)反應(yīng)生成希夫堿則促進(jìn)了不可溶性交聯(lián)聚集體的形成，兩種聚集作用均抑制了米糠蛋白在水氣界面擴(kuò)展和吸附，降低了米糠蛋白起泡性。目前尚難以解釋MDA氧化誘導(dǎo)米糠蛋白泡沫穩(wěn)定性隨氧化誘導(dǎo)濃度增大而增強(qiáng)的原因，劉晶等[37]認(rèn)為部分暴露的疏水性基團(tuán)可相互吸引，是MDA氧化誘導(dǎo)蛋白泡沫穩(wěn)定性增強(qiáng)的主要原因。

3 結(jié) 論

MDA是食品中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生最多的活性醛類(lèi)，由于MDA含有兩個(gè)羰基，在一定條件下MDA也可使得蛋白質(zhì)形成共價(jià)交聯(lián)[8-9]，使蛋白質(zhì)的功能特性降低。本研究中，米糠蛋白羰基含量均隨MDA氧化誘導(dǎo)濃度的增加而增大，這主要是由于MDA主要與蛋白質(zhì)分子中的伯胺加成反應(yīng)形成烯胺加合物，從而為蛋白質(zhì)引入羰基基團(tuán)。MDA分子含有兩個(gè)羰基，當(dāng)其中一個(gè)羰基與蛋白質(zhì)反應(yīng)時(shí)，也會(huì)同時(shí)為蛋白質(zhì)引入另一個(gè)新的羰基。米糠蛋白α-螺旋和β-折疊含量隨MDA氧化誘導(dǎo)濃度增加逐漸增大，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)隨之呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢(shì)，表明氧化使米糠蛋白無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行蚪Y(jié)構(gòu)，這應(yīng)與氧化誘導(dǎo)的聚集作用有關(guān)。隨著MDA氧化誘導(dǎo)濃度的增加，米糠蛋白表面疏水性逐漸下降，熒光λmax發(fā)生藍(lán)移，表明MDA氧化誘導(dǎo)促進(jìn)了米糠蛋白氧化聚集，并隨著氧化誘導(dǎo)濃度的增大氧化聚集程度逐漸增加。低氧化誘導(dǎo)濃度下MDA對(duì)米糠蛋白亞基組成無(wú)顯著影響，隨著MDA氧化誘導(dǎo)濃度增加，分子質(zhì)量為53、49、36、21、14 kDa的亞基歸屬條帶均有所變淺，條帶逐漸變窄。而隨著氧化誘導(dǎo)濃度的增加，分子質(zhì)量為36、21、14 kDa的亞基逐漸消失，亞基條帶消失可能與大聚集體的形成及重組有關(guān)。通過(guò)隨氧化誘導(dǎo)濃度增大氧化米糠蛋白溶解性的逐漸降低及粒徑分布范圍的增大可知，MDA誘導(dǎo)的米糠蛋白氧化聚集并存了可溶性及不可溶性聚集形式，氧化蛋白的自聚集及交聯(lián)聚集分別形成可溶性及不可溶性蛋白聚集體，并可以通過(guò)熒光分析及表面疏水性分析判斷，氧化聚集是MDA誘導(dǎo)米糠蛋白氧化的主導(dǎo)行為。

結(jié)合考慮隨MDA氧化誘導(dǎo)濃度增大米糠蛋白溶解性降低、粒徑增大、濁度增大的變化規(guī)律可知，MDA誘導(dǎo)的氧化米糠蛋白可溶性聚集體及不可溶性聚集體含量均隨著氧化濃度的增大而增加，可溶性聚集的粒徑逐漸增加可能是由于蛋白亞基更大程度的聚集所致或新的氧化聚集形成，而不可溶性氧化聚集的增加也可能是由于可溶性聚集體再聚集所致。在本研究中由于氧化交聯(lián)形成的不可溶聚集體降低了米糠蛋白的界面延展性，使乳化性、穩(wěn)定性均有所降低。