猴頭菇β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)表征及其稀溶液性質(zhì)

張三豐，王一非，馮 濤,*，莊海寧，宋詩清，姚凌云，孫 敏，徐志民

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海 201403）

猴頭菇（Hericium erinaceus）又名猴頭菌、刺猬菌等，是一種大型真菌，屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭屬[1]，是珍貴的藥食兩用菌，含有多糖、寡糖、甾醇類、萜類和酚類等多種活性物質(zhì)，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血脂等多種生理功能。多糖是猴頭菇中重要的活性物質(zhì)，具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤、加速傷口的愈合等[2]功效。

不同多糖具有不同的分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及在水中的溶解度和分子鏈構(gòu)象，這些都明顯影響其生物活性。β-葡聚糖作為多糖研究領(lǐng)域中的一個重要分支，主要由β-1,3、β-1,4、β-1,6等葡聚糖組成[3]，廣泛分布于真菌、酵母和谷物中[4]。香菇β-葡聚糖[5]、燕麥β-葡聚糖[6]和青稞β-葡聚糖[7]由于其分子質(zhì)量、糖苷鍵類型、分子鏈構(gòu)象的不同，導(dǎo)致其在生物功能上差異很大。因此高效地提取和純化多糖，并研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子鏈構(gòu)象是必要的。猴頭菇β-葡聚糖（H. erinaceus β-glucan，HEBG）是猴頭菇多糖中重要的活性成分，具有多種生物活性，特別是在抑制淀粉消化方面有顯著功效[8]。但是目前對于HEBG的結(jié)構(gòu)表征及其在溶液中的分子鏈構(gòu)象的研究鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過水提醇沉法提取得到HEBG，采用多種方法對HEBG的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，用掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡觀察并分析溶液性質(zhì)，對HEBG的分子鏈構(gòu)象進(jìn)行深入的研究。為進(jìn)一步研究HEBG生物活性以及構(gòu)效關(guān)系給出基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為β-葡聚糖應(yīng)用到食品和化妝品中提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇子實(shí)體 上海百信生物科技有限公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 北京拜爾迪生物公司；葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；氫氧化鈉、高碘酸鈉、碘酸鈉、乙二醇、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、硼氫化鈉、乙醇、乙二醇、鹽酸、乙酸、剛果紅、濃硫酸、三氟乙酸、乙酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油、赤蘚醇、NaBH4（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG系列電熱鼓風(fēng)干燥箱、DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16M臺式離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；UV2350紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；高效液相排阻色譜-多角度激光散射儀-示差折光儀聯(lián)用系統(tǒng)（highperformance sizeexclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering-refractive index，HPSECMALLS-RI）（Waters 2414示差檢測器、Waters 2695高效液相色譜泵、Waters 717 plus自動進(jìn)樣器和八角度激光光散射檢測器組成） 美國Wyatt公司；VERTEX-70傅里葉紅外光譜分析儀 德國Bruker公司；6820氣相色譜、GC6890-5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；S-3400N掃描式電子顯微鏡 日立高新那珂事業(yè)所；Nano Scope IIIa原子力顯微鏡 美國Digital Instruments公司；AVANCE III 500 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 HEBG的制備

稱取一定量猴頭菇，按料液比1∶15（g/mL）加入蒸餾水，100 ℃提取2 h，提取2 次，過濾，合并濾液，濾液按濃縮比（子實(shí)體質(zhì)量∶粗提液體積（g/mL））1∶3濃縮，25 ℃、12 840×g離心15 min，取離心后的上清液至4 ℃冰箱冷藏12 h，然后4 ℃、12 840×g離心15 min得到部分沉淀，沉淀用20%乙醇溶液反復(fù)醇洗，蒸餾水溶解后用3 500 Da透析袋透析3 d，透析液冷凍干燥即獲得HEBG[9]。

1.3.2 HEBG的分子質(zhì)量測定

1.3.2.1 色譜條件

TSK PWXL 3000和TSK PWXL 4000色譜柱；緩沖液流速0.5 mL/min，柱溫（35±0.1）℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2.2 分子質(zhì)量測定

精確稱取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，溶于1 mL緩沖液中，緩沖液為0.05 mol/L的NaH2PO4·2H2O和0.15 mol/L的NaNO3混合溶液，配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL的溶液，12 840×g離心20 min后取上清液進(jìn)行分析，進(jìn)樣體積20 μL。

1.3.3 HEBG單糖組成分析

1.3.3.1 色譜條件

CarboPac PA20陰離子交換分析柱（150 mm×3 mm）；ED50A電化學(xué)檢測器（金電極）、LC30柱溫箱（30 ℃）；淋洗程序：淋洗液2 mmol/L，流速0.45 mL/min，120 min。流動相：A為去離子水；B為0.25 mol/L氫氧化鈉；C為1 mol/L NaAc。流速0.45 mL/min，上樣量25 μL。

1.3.3.2 HEBG單糖組成分析

按照陳忠秋等[10]的方法，將HEBG進(jìn)行酸水解后加入甲醇氮?dú)獯蹈?，然后超純水溶解?5 μL用高效陰離子色譜檢測。標(biāo)準(zhǔn)單糖為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖混合標(biāo)樣。

1.3.4 HEBG一級結(jié)構(gòu)的測定

1.3.4.1 傅里葉變換紅外光譜測定

采用溴化鉀壓片法[11]，將研磨好的多糖樣品跟KBr混合均勻后壓片，然后在400～4 000 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描，鑒定主要官能團(tuán)。

1.3.4.2 高碘酸氧化實(shí)驗(yàn)

高碘酸鈉消耗量標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]繪制方法：將0.15 mo1/L的高碘酸鈉和碘酸鈉溶液以不同比例混合，取混合溶液0.2 mL，稀釋到50 mL在223 nm波長處測吸光度，以混合后溶液中的高碘酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得高碘酸鈉消耗量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精確稱取多糖樣品，加入0.015 mol/L的高碘酸鈉溶液，置4 ℃反應(yīng)，間或振蕩，每隔24 h取樣品0.1 mL，稀釋至25 mL，以蒸餾水作空白，在223 nm波長處測定其吸光度，直至吸光度恒定，氧化反應(yīng)結(jié)束，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HEBG的高碘酸鈉消耗量；另取5 mL高碘酸氧化溶液，加乙二醇終止反應(yīng)，以酚酞為指示試劑，用標(biāo)定好氫氧化鈉滴定甲酸的生成量。

1.3.4.3 Smith降解

將乙二醇處理后的透析液透析48 h，加入NaBH4暗處放置24 h；用50%的醋酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至6～7，透析除去過量的NaBH4，冷凍干燥得到多糖醇產(chǎn)物[12]。將多糖醇產(chǎn)物采用糖腈乙?；姆椒ㄌ幚砗筮M(jìn)行氣相色譜分析。稱取葡萄糖、赤蘚醇、甘油作為標(biāo)準(zhǔn)品，同樣糖腈乙酰化處理后進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.4.4 甲基化反應(yīng)

HEBG的甲基化反應(yīng)按3 步[5]進(jìn)行：第1步，取5 mg HEBG完全溶解于無水二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），與氫氧化鈉和碘甲烷的混合溶液反應(yīng)，反應(yīng)液以蒸餾水萃取，流經(jīng)Na2SO4柱，濾液用氮?dú)獯蹈?；?步，將已經(jīng)甲基化的HEBG以4 mol/L三氟乙酸水解，再以硼氘化鈉還原3 h；第3步，加入0.5 mL乙酸酐于100 ℃進(jìn)行衍生化反應(yīng)，衍生物即為甲基化的多糖。甲基化的多糖以傅里葉紅外光譜進(jìn)行鑒定。羥基峰缺失可以證明多糖已完全甲基化。甲基化反應(yīng)產(chǎn)物使用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析。

1.3.4.513C NMR分析

參照文獻(xiàn)[5]的方法，樣品NMR通過質(zhì)子去偶模式下25 ℃時測得，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷，溶劑為DMSO-D6。

1.3.5 特性黏度的測定

采用烏氏毛細(xì)管黏度計(jì)（內(nèi)徑0.6～0.7 mm），測定多糖樣品HEBG在蒸餾水中的特性黏度[η]，溫度控制在（25±0.1）℃。相對黏度（ηr）保持在1.2～2.2之內(nèi)，使其所測黏度在牛頓流體范圍內(nèi)。特性黏度由Huggins和Kraemer方程求得[13]：

式中：K’為Huggins系數(shù)；K”為Kraemer常數(shù)；C為HEBG質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ηr為相對黏度/（dL/g）；ηsp為增比黏度（ηr－1）/（dL/g）；特性黏度[η]為在無限稀釋時的外推值/（dL/g）。以ηsp/C和lnηr/C分別為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)作圖，得到兩條直線，分別外推至C為0處，其截距就是特性黏度。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察

HEBG的固態(tài)表觀形貌觀察方法：取冷凍干燥好的大小厚度適合樣品室要求的樣品粘附于樣品臺上，置于離子濺射儀中鍍一層導(dǎo)電金膜后，使用掃描電子顯微鏡于20 kV條件下觀察[14]，得到不同放大倍數(shù)下多糖的電鏡照片。

1.3.7 原子力顯微鏡觀察

參照文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行HEBG分析。將適量HEBG樣品于蒸餾水中溶解，離心15 min，取上清液進(jìn)行梯度稀釋，配制成1 μg/mL的HEBG溶液。取樣品溶液3.0 μL滴在新鮮解離的云母薄片上，室溫下風(fēng)干。采用Nano Scope IIIa原子力顯微鏡以輕敲模式室溫下進(jìn)行觀察，接觸作用力控制在3～4 nN之間，共振頻率為2.0 kHz。

1.3.8 剛果紅實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[16]的方法，將HEBG和剛果紅試劑配制成不同濃度氫氧化鈉溶液混合，紫外分光光譜掃描，測量HEBG樣品溶液的最大吸收波長。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016和Origin 8.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制；采用MestReNova軟件對NMR圖譜進(jìn)行分析和處理；采用Nano Scope Analysis軟件對原子力顯微鏡圖譜進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEBG分子質(zhì)量

圖1 HEBG高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of HEBG

由圖1可知，高效液相圖譜顯示HEBG呈單一對稱峰，HEBG的重均分子質(zhì)量mw為7.504×105Da，數(shù)均分子質(zhì)量mn為6.927×105Da，多分散系數(shù)mw/mn為1.083，表明分子質(zhì)量分布均一且較為集中，說明水提醇沉法提取得到的HEBG為大分子質(zhì)量且組分相對均一的多糖組分。

2.2 HEBG的單糖組成

圖2 HEBG的離子色譜圖Fig. 2 Ion chromatogram of HEBG

將混合單糖標(biāo)樣和水解后HEBG的產(chǎn)物經(jīng)離子色譜分析，如圖2所示，結(jié)果表明：HEBG完全由葡萄糖組成，是均一性葡聚糖。HEBG與黑木耳剛性鏈葡聚糖[17]和金錢菇β-葡聚糖[18]相同，完全酸水解后進(jìn)行單糖檢測，色譜圖中只有葡萄糖吸收峰，為均一性葡聚糖。

2.3 HEBG傅里葉變換紅外光譜

圖3 HEBG傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform infrared spectrum of HEBG

由圖3可知，3 336.57 cm－1處的強(qiáng)吸收峰可歸屬為—OH的伸縮振動峰，說明HEBG存在分子間的氫鍵，而吡喃環(huán)內(nèi)CH2對稱伸縮振動峰以及—OH面內(nèi)變形振動峰（1 424.31 cm－1）、CH2剪切振動峰（1 370.62 cm－1）、C—H變形振動峰和C—O鍵的伸縮振動峰（1 000～1 200 cm－1）的出現(xiàn)，表現(xiàn)出典型的吡喃糖傅里葉變換紅外光譜圖的吸收峰；出現(xiàn)在891.09 cm－1處的吸收峰為β構(gòu)型多糖的異頭碳伸縮振動峰，而且1 650～1 700 cm－1處沒有羰基特征吸收峰，表明HEBG為中性吡喃糖。HEBG與桑黃[19]和黃傘菌多糖[20]紅外圖譜有很多相同之處，在890 cm－1左右均具有特征峰，說明含有β-吡喃糖苷鍵，且在1 400～1 200 cm－1附近都有吸收峰，說明其物質(zhì)為糖類化合物，進(jìn)一步表明HEBG為中性β-吡喃糖。

2.4 高碘酸氧化實(shí)驗(yàn)

將高碘酸鈉和碘酸鈉以不同比例混合后，在223 nm波長處測吸光度，得到高碘酸消耗量標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=44.107x＋0.283 7，R2=0.997 7。

將猴頭菇多糖HEBG溶解于0.015 mol/L的高碘酸鈉溶液中，從第1天開始測定吸光度，直至吸光度趨于穩(wěn)定，反應(yīng)達(dá)到平衡為止，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算高碘酸的消耗量。結(jié)果表明：250 mg的HEBG樣品反應(yīng)10 d后測得高碘酸消耗量為437 mmol，生成甲酸的量為37.062 mmol。高碘酸氧化反應(yīng)生成了少量的甲酸，說明結(jié)構(gòu)中存在1→6位糖苷鍵，且高碘酸的消耗量遠(yuǎn)大于甲酸的生成量，表明結(jié)構(gòu)中主要存在1→3位糖苷鍵。該結(jié)果與香菇β-葡聚糖[5]檢測結(jié)果相同，都含有1→3位糖苷鍵和1→6位糖苷鍵；與杏鮑菇β-葡聚糖[12]主要含有1→4、1→6位糖苷鍵不同，原因可能是菌菇品種、提取方法的不同導(dǎo)致的。

2.5 Smith降解反應(yīng)

圖4 HEBG Smith反應(yīng)氣相色譜圖Fig. 4 GC chromatogram of the Smith reaction products of HEBG

經(jīng)過高碘酸氧化后生成不同的產(chǎn)物，將氧化產(chǎn)物用硼氫化合物還原成穩(wěn)定的多羥基化合物，再經(jīng)過水解和乙?；?jīng)氣相色譜分析產(chǎn)物結(jié)果如圖4所示，出現(xiàn)在9.247、13.409 min和22.912 min的3 個峰分別為甘油、赤蘚醇和葡萄糖。結(jié)果表明：HEBG組分氣相色譜圖中含有甘油峰和赤蘚醇峰，說明結(jié)構(gòu)中存在1→2或者1→4，1→6糖苷鍵，而高碘酸氧化實(shí)驗(yàn)中有甲酸生成，表明多糖中含有1→6糖苷鍵，因此HEBG結(jié)構(gòu)中存在1→6位鍵合的糖基。產(chǎn)物中還檢測到大量的葡萄糖，說明主要存在以1→3位鍵合的糖基，因此可以推斷出HEBG主鏈由1,3-葡萄糖殘基（1,3-Glu）組成，支鏈?zhǔn)怯?,6-Glu組成。與HEBG結(jié)構(gòu)不同，Peng Yanfei等[21]從黃芪中提取出一種水溶性β-葡聚糖GTM5，其主鏈由1,6-Glu組成，支鏈則是由1,3-Glu組成。

2.6 甲基化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 甲基化反應(yīng)后HEBG的氣相色譜-質(zhì)譜圖Fig. 5 GC-MS chromatogram of methylated HEBG

表1 HEBG的甲基化分析結(jié)果Table 1 Analysis of methylated HEBG

甲基化的HEBG樣品經(jīng)酸水解、還原、乙?；庀嗌V-質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖5所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。甲基化產(chǎn)物主要由4 部分組成，分別對應(yīng)與1-Glu、1,3-Glu、1,6-Glu和1,3,6-Glu。其中1-Glu為端基單元，1,3-Glu為主鏈線性連接單元，1,6-Glu為支化單元。而且1,3-Glu與1,6-Glu的含量比例約為1∶1，結(jié)合高碘酸氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可推斷HEBG組成為β-1,3-葡聚糖，并含β-1,6-Glu支鏈結(jié)構(gòu)，約為每5 個β-1,3-Glu帶有5 個β-1,6-Glu，即其物質(zhì)的量比為1∶1。李盛等[5]對香菇β-葡聚糖進(jìn)行甲基化研究，其結(jié)果表明每5 個β-1,3-Glu帶有2 個β-1,6-Glu[22]；Oliveira等[23]從真菌中分離出一種β-1,3-1,6-葡聚糖PEPS，每5 個β-1,3-Glu帶有5 個β-1,6-Glu；甲基化分析結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)都有很大相似之處，不過葡聚糖支鏈連接位點(diǎn)及糖苷鍵數(shù)目有不同之處。

2.7 NMR波譜分析

圖6為HEBG的13C NMR譜，存在10 個強(qiáng)的位移峰，δ 103.43處的位移峰為異頭碳（C-1）峰，通常β異頭碳連接的多糖C-1峰高于δ 100而α異頭碳連接的多糖C-1峰低于δ 100，表明HEBG不含α型多糖。HEBG在低場范圍（δ 160～200）未出現(xiàn)位移峰，表明不存在羰基峰，進(jìn)一步證明HEBG為中性多糖，這與傅里葉紅外光譜分析結(jié)果相吻合。

圖6 HEBG的13C NMR譜圖Fig. 6 13C NMR spectrum of HEBG

圖7 HEBG的HMQC譜圖Fig. 7 HMQC spectrum of HEBG in DMSO-d6

HEBG的1H-13C異核多量子相關(guān)（heteronuclear multiple quantum correlation，HMQC）光譜包含6 個交叉峰，表明HEBG是一種線性葡聚糖；HEBG在δ 103.1存在低場位異構(gòu)碳，表明HEBG由β-吡喃葡萄糖單元組成，證明HEBG是線性葡聚糖組成的多糖，這與傅里葉變換紅外光譜結(jié)果一致。如圖7所示，在δ 103.1、86.3、76.6、73.1、68.6、61.1有6個交叉峰，這些C的位置分別為C-1、C-3、C-5、C-2、C-4和C-6，也說明HEBG是一種線性1→3為主鍵連接的β-葡聚糖；HMQC譜圖中C-1對應(yīng)的H1位移峰位置為δ 4.19，是β異頭碳上的H原子，證明HEBG為β型葡聚糖；出現(xiàn)在61.1（C-6）的兩個交叉峰是由于β-D-Glu單元攜帶6-O取代產(chǎn)生的化學(xué)位移導(dǎo)致的，說明HEBG中存在1→6位糖苷鍵，與高碘酸和Smith實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。綜合以上分析結(jié)果可以看出HEBG主鏈由1,3-Glu組成，支鏈?zhǔn)怯搔?1,6-D-Glu組成。Kagimura[24]、Nitschke[25]等分別從真菌和食用菌中分離出均不含α型多糖[26]的β-1,6-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖，并通過NMR儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，對葡聚糖中碳和氫峰位置進(jìn)行歸屬，其結(jié)果與HEBG有很多共同之處。

綜上所述，HEBG的主鏈重復(fù)單元可能為：

2.8 HEBG剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖8 氫氧化鈉濃度對HEBG與剛果紅絡(luò)合物最大吸光度波長的影響Fig. 8 Effect of NaOH concentration on maximum absorption wavelength of Congo red-BCP complex

剛果紅溶液可以與具有三螺旋構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物，絡(luò)合物的最大吸收波長發(fā)生紅移，即在低濃度氫氧化鈉范圍內(nèi)出現(xiàn)亞穩(wěn)區(qū)，多糖-剛果紅絡(luò)合物的最大吸收波長較剛果紅明顯增大，根據(jù)這種變化可以判斷多糖是否存在螺旋結(jié)構(gòu)。HEBG在不同濃度氫氧化鈉溶液條件下與剛果紅試劑反應(yīng)，最大吸收波長的變化如圖8所示。HEBG在氫氧化鈉濃度為0～0.3 mol/L范圍內(nèi)產(chǎn)生紅移，說明HEBG與剛果紅形成了絡(luò)合物，證明HEBG中存在三螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明酵母β-葡聚糖[16]、香菇β-葡聚糖[5]在溶液中呈三股螺旋結(jié)構(gòu)，并且在剛果紅溶液中都發(fā)生特征性紅移，本實(shí)驗(yàn)中HEBG也發(fā)生了紅移，也表明HEBG在溶液中存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.9 特性黏度的測定結(jié)果

圖9 HEBG在水溶液中的Huggins和Kraemer直線Fig. 9 Typical Huggins and Kraemer plots of HEBG in aqueous solution

由圖9可知，Huggins和Kraemer方程外推到零濃度，即可得到多糖組分HEBG在水溶液中的特性黏度3.02 dL/g。Huggins常數(shù)K′反映了在溶液中多糖分子之間的相互作用，通常認(rèn)為，聚合物在良溶劑內(nèi)，K’在0.3～0.4范圍內(nèi)，當(dāng)K’大于0.8，大分子聚合物很可能產(chǎn)生聚集[27]。在本實(shí)驗(yàn)中，HEBG在蒸餾水溶液中的Huggins常數(shù)為1.54，遠(yuǎn)大于0.8，因此葡聚糖分子間發(fā)生了聚集。與香菇葡聚糖[5]、燕麥葡聚糖[6]在水溶液中均以無規(guī)線團(tuán)狀存在相比較，HEBG在水溶液中的特性黏度與香菇和燕麥葡聚糖相差不大，因此HEBG分子在水溶液也是以無規(guī)則線團(tuán)纏繞的構(gòu)象存在[28]。

2.10 顯微結(jié)構(gòu)分析

2.10.1 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖10 HEBG的掃描電子顯微鏡圖Fig. 10 SEM image of HEBG

由圖10可看出，HEBG呈卷曲、折疊形狀，并伴隨絲狀結(jié)構(gòu)以及無規(guī)線團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)致密，形成了不規(guī)則聚合體，并且會形成薄膜狀結(jié)構(gòu)。從圖10可以觀察到線性的多糖鏈以及多條鏈的聚集體，鏈聚集體的直徑約為2 μm，遠(yuǎn)大于單鏈直徑的理論值0.1～1.0 nm，說明葡聚糖分子間存在較強(qiáng)的相互作用，在固體狀態(tài)下多以較大的聚集纏繞態(tài)存在。該結(jié)果與燕麥β-葡聚糖在高倍鏡下形成的具有一定規(guī)整性的細(xì)微網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[14]不同，造成這種差異的原因可能是分子質(zhì)量的不同以及分子鏈間作用力[29]的強(qiáng)弱不同。

2.10.2 原子力顯微鏡觀察結(jié)果

從圖11可以觀察到大小不均一并且形狀不同的多糖聚合體，且HEBG均勻的分布在云母片上，其組分寬度大概在1.9 nm，分子鏈直徑為（0.55±0.11）nm，與理論上多糖單鏈直徑理論值0.1～1.0 nm相符。并且HEBG呈現(xiàn)出明顯的鏈狀、網(wǎng)狀，且具有分支結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象可能是由于多糖分子間氫鍵的相互作用使得多糖鏈之間呈聚集狀態(tài)。HEBG分子鏈尺寸與燕麥β-葡聚糖寬5～10 nm，高2～3 nm[14]相差很大，造成這種差異的原因可能是多次乙醇醇洗沉淀使得多糖聚合體把卷曲的鏈打開，一些小分子的多糖被釋放出來，從而在水中的溶解性、分散性較好。

圖11 HEBG的原子力顯微鏡圖像Fig. 11 AFM image of HEBG

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜對猴頭菇多糖HEBG分子質(zhì)量進(jìn)行測定，結(jié)果表明HEBG重均相對分子質(zhì)量為7.504×105，單糖分析和傅里葉變換紅外光譜分析表明HEBG完全由β-D-葡萄糖組成。高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)以及NMR波譜分析表明：HEBG的化學(xué)結(jié)構(gòu)為β-1,3-D-葡聚糖，并含有β-1,6-D-Glu的支鏈，且1,3-Glu與1,6-Glu的物質(zhì)的量比為1∶1。HEBG的特性黏度和剛果紅實(shí)驗(yàn)表明HEBG分子在水溶液中以三股螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)兩種構(gòu)象存在。通過掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡觀察，直觀地觀察到多糖在固態(tài)下無規(guī)線團(tuán)聚集形態(tài)和極稀溶液下的鏈狀分支結(jié)構(gòu)。通過對HEBG的結(jié)構(gòu)和分子鏈構(gòu)象的研究，為進(jìn)一步研究HEBG生物活性以及構(gòu)效關(guān)系提供參考基礎(chǔ)，同時也為HEBG應(yīng)用到食品和化妝品中提供理論依據(jù)。