對氯苯丙氨酸在動(dòng)物失眠模型中的應(yīng)用概述

郭海波，王 慧

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550002)

中樞神經(jīng)機(jī)制的研究離不開動(dòng)物模型，睡眠-覺醒的研究更是如此。失眠模型的建立和復(fù)制，能否成功尤為關(guān)鍵。利用藥物建立失眠動(dòng)物模型，因效果確切、操作方便受到諸多學(xué)者的青睞，而對氯苯丙氨酸是建立失眠動(dòng)物模型中最常用的藥物之一。對氯苯丙氨酸，又稱芬克洛寧，英文名稱：4-Chloro-DL-phenylalanine, Fenclonine，簡稱PCPA，CAS編號：7424-00-2，其它化學(xué)或英文名稱還有：para-chlorophenylalanine， Fencloninum， DL-4-chlorophenylalanine， 2-amino-3-(4-chlorophenyl)propanoic acid， P-chlorophenylalanine 等。它是5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)生物合成中的起始酶和限速酶—色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase, TPH)的選擇性和不可逆抑制劑[1]。色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶生成5-羥色氨酸(5-hydroxytryptamine, 5-HTA)，5-HTA脫羧生成5-HT。PCPA通過抑制色氨酸羥基化而阻斷5-HT的合成，可顯著降低腦內(nèi)和外周血中的5-HT濃度，達(dá)到排空5-HT的目的，在睡眠-覺醒、鎮(zhèn)痛和行為學(xué)等多種中樞機(jī)制研究中具有廣泛應(yīng)用。

PCPA分子式C9H10ClNO2(見圖1)，分子量199.634 g/mol，密度1.336 g/cm3，熔點(diǎn)238℃～240℃，沸點(diǎn)339.5℃；在25℃的水中可溶性為961 mg/L[2]，屬于微溶物質(zhì)。在平均體重7.5 kg的猴子實(shí)驗(yàn)中觀察到的血漿半衰期約為10.5 h[3]。大量口服可導(dǎo)致急性中毒，皮膚接觸可能會(huì)出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

最早在1953年，就已經(jīng)有文獻(xiàn)觀察了PCPA對金黃色葡萄球菌中摻入苯丙氨酸的抑制作用，并以此來研究細(xì)菌對氨基酸的同化影響。在1966年P(guān)CPA被明確為“一種新的、腦血清素(5-HT)的特定消耗劑”[4]，發(fā)現(xiàn)它可以“抑制睡眠”[5]，并能改變5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA水平和基因產(chǎn)物的表達(dá)[6]。有文獻(xiàn)[7]還報(bào)道了PCPA的首次人體試驗(yàn)：“在6名正常的監(jiān)獄囚犯志愿者中，每天給予PCPA 3000 mg，可使血清中5-HT下降至治療前水平的60%～70%，尿中5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)排泄至10%～50%”，并從藥理學(xué)角度對PCPA進(jìn)行了詮釋。還有學(xué)者利用PCPA研究了腦內(nèi)5-HT合成、儲(chǔ)存和釋放之間的關(guān)系[8]。之后越來越多的學(xué)者利用PCPA抑制TPH的作用對睡眠和呼吸[9]、晝夜節(jié)律[10]、認(rèn)知和情感[11]、學(xué)習(xí)[12]、行為[13]、記憶、食欲[14]、飲酒和生殖[15]、性行為[16]和殺戮[17]等多種中樞神經(jīng)機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究。PCPA還曾被作為5-HT拮抗劑而被用于實(shí)驗(yàn)性治療類癌綜合征導(dǎo)致的腹瀉、腹痛和潮紅等[18]，但骨髓抑制[19]、過敏反應(yīng)和精神障礙[20]阻礙了它在臨床中的使用。此后，它被更多的用于和5-HT相關(guān)的病理或生理機(jī)制研究中。

在我國，PCPA的應(yīng)用較為局限，大多用于動(dòng)物失眠模型的建立，其中應(yīng)用最多的是大鼠失眠模型的復(fù)制，并被認(rèn)為是經(jīng)典的動(dòng)物失眠模型[21]。有研究顯示，在一次性腹腔注射PCPA后，24 h內(nèi)大鼠活動(dòng)和攝食開始減少，之后是持續(xù)1～2 d的失眠階段，大鼠晝夜節(jié)律消失，白天活動(dòng)增加，這是5-HT水平降低的結(jié)果[22]。還有研究顯示在給予PCPA后，5-HT能神經(jīng)元末梢中的TPH活性降低至對照組的10%，使用免疫組化方法甚至檢測不到5-HT[23]。

1 PCPA懸浮液的配制及使用

1.1 PCPA懸浮液的配制

PCPA懸浮液的制備在不同的文獻(xiàn)中有所區(qū)別，但限于PCPA在水中溶解度不高，直接溶于生理鹽水中使用容易堵塞注射器針頭，阻礙造模進(jìn)展。有部分學(xué)者加用增溶劑、表面活化劑，如阿拉伯膠、甲基纖維素、聚山梨酯80等來促溶；還有學(xué)者利用PCPA在弱堿性環(huán)境中溶解度更高的特點(diǎn)，在PCPA懸浮液中加入少量氫氧化鈉(NaOH)以促進(jìn)溶解。本文統(tǒng)計(jì)了在不同文獻(xiàn)中使用PCPA的各種方法(見表1)。

但遺憾的是各文獻(xiàn)未給出使用促溶劑或表面活化劑的具體劑量以及與PCPA的詳細(xì)比例。依據(jù)本課題組制作失眠模型的經(jīng)驗(yàn)，以聚山梨酯80為例，認(rèn)為1.0 g PCPA加入聚山梨酯80溶液10～20 μL較為合適。有學(xué)者[25]對比了單次腹腔注射相同劑量(450 mg/kg)使用1.0%阿拉伯樹膠促溶的PCPA和使用0.1%聚山梨酯80促溶的PCPA在實(shí)驗(yàn)中的作用，結(jié)果顯示，5-HT水平下降的幅度二者類似。但含有阿拉伯樹膠的PCPA治療組中，觀察到貓的情緒防御反應(yīng)增加；含有聚山梨酯80治療組中去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)水平顯著降低，而含有阿拉伯樹膠PCPA治療組中的NE水平?jīng)]有任何變化。認(rèn)為聚山梨酯80對生化和行為過程都能發(fā)揮作用，在研究大腦機(jī)制中使用脫水山梨糖醇是不可取的[25]，因?yàn)榫凵嚼骢?0是由山梨糖醇及其脫水物單油酸酯與環(huán)氧乙烷共聚所得。但本課題組未查到更多的文獻(xiàn)支持聚山梨酯80在大腦機(jī)制研究中具有影響作用，而用來促溶的量又極少。但犬類對聚山梨酯80十分敏感，可產(chǎn)生明顯的組胺反應(yīng)，如果選擇犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可能不適合用聚山梨酯80來對PCPA促溶。

1.2 PCPA在動(dòng)物中的應(yīng)用及使用方法

已有文獻(xiàn)報(bào)道PCPA對多種實(shí)驗(yàn)性哺乳動(dòng)物，

表1 文獻(xiàn)中使用的PCPA溶解方法Table 1 PCPA dissolution methods reported in the literature

注：生理鹽水pH值5.5～6.5，弱堿性生理鹽水pH值7.4。

Note. Normal saline pH 5.5～6.5, weak alkaline saline pH 7.4.

如：小鼠[5]、大鼠[30]、貓[31]、綿羊[32]、豬[11]、豚鼠[33]和猴子[3，34]等腦內(nèi)的5-HT可產(chǎn)生有效和選擇性抑制。直到現(xiàn)在，這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在睡眠-覺醒機(jī)制研究中仍是不可或缺的。其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還有果蠅[35]、蝸牛[36]等。需要明確的是，應(yīng)用PCPA，不完全是建立失眠動(dòng)物模型，它還可以在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生一系列代謝失衡，如模擬人類苯丙酮尿癥[37]，但這種模型與人體病理并不完全相同，應(yīng)用較少。

1.2.1 給藥濃度

在不同實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的差別選擇的PCPA濃度也不同，但總體來說，濃度范圍較為寬泛，例如：選擇貓作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口服PCPA濃度從75 mg/kg到800 mg/kg不等[38]；選擇大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射PCAP的濃度從50 mg/kg到500 mg/kg不等[24，39-40]；選擇豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PCPA的腹腔注射濃度從50～100 mg/kg不等[11，41]。而大鼠腦內(nèi)(腦室或中縫核)給藥從2.5 μg /μL、10 μg/μL到0.6 mg/μL不等[42-44]。連續(xù)給予小劑量和單次給予大劑量有沒有差別呢？在行為學(xué)研究中以大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)3 d口服較小劑量(200 mg/kg或400 mg/kg)與單次口服更高劑量(1600 mg/kg或3200 mg/kg)顯示出相當(dāng)?shù)男Ч鸞45]，但文章未探討不同劑量PCPA的血藥濃度和代謝情況，筆者在Pubmed和中國知網(wǎng)上查閱了大量文獻(xiàn)，未看到有國內(nèi)外文獻(xiàn)研究PCPA在實(shí)驗(yàn)中的劑量和血藥濃度之間的變化關(guān)系，大多文獻(xiàn)通過檢測腦內(nèi)5-HT、TPH、5-HTA、5-HIAA的濃度和尿中的色氨酸、5-HIAA的排泄來觀察和確定PCPA的效果。

1.2.2 給藥方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同決定了給藥途徑也不同，有口服[40，46]、皮下注射[27]、腹腔注射[47]、側(cè)腦室或中縫核微量注射[43-44]等。其中腹腔注射和口服給藥是文獻(xiàn)中使用最多的方法。有研究顯示口服和腹腔注射PCPA對大鼠腦內(nèi)5-HT和 5-HIAA含量的影響沒有顯著差異[48]。

1.2.3 給藥時(shí)間

給藥時(shí)間從一次性給藥到連續(xù)性給藥5～7 d不等，最長的達(dá)到了37 d[49]。有研究顯示腹腔注射PCPA后，大鼠腦內(nèi)5-HT含量逐漸降低，在第3天效果達(dá)到最大化，至少在一周內(nèi)保持較低水平[14]。如 PCPA 400 mg/(kg·2 mL)，腹腔注射3 d后，與治療前對比大鼠中腦的5-HT濃度降低了74%[50]。根據(jù)相關(guān)研究[51]以及在實(shí)驗(yàn)中所積累的數(shù)據(jù)，以成年大鼠為例，每日1次腹腔注射PCPA 300～350 mg/kg，給藥3 d，可出現(xiàn)白天活動(dòng)增加、晝夜節(jié)律消失、毛發(fā)無光澤、脫毛增加、攻擊性增加相互撕咬等，這預(yù)示著失眠模型的建模成功，與以往的文獻(xiàn)研究基本一致[52]。其他動(dòng)物給藥方法可參考相關(guān)文獻(xiàn)或依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來決定給藥量。

2 與造模無關(guān)的不良反應(yīng)以及造模失敗的處理

PCPA在人類中用于類癌綜合征時(shí)統(tǒng)計(jì)到的副作用有頭暈、頭痛、骨髓抑制等[20]，接觸皮膚可能會(huì)出現(xiàn)過敏反應(yīng)(見表2)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，以大鼠為例，使用PCPA后，出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失、攻擊性增加等表現(xiàn)(見表2)，這些癥狀大多學(xué)者認(rèn)為是失眠造模成功所致。有學(xué)者認(rèn)為5-HT的單獨(dú)消耗在未成熟的大鼠中引起的損傷很少或沒有損傷[24]。但也有研究顯示：PCPA可使斷奶大鼠的前后晶狀體發(fā)生特征性改變，而其中大約有35%發(fā)展成白內(nèi)障，但以同樣劑量處理的猴子中卻未發(fā)現(xiàn)任何眼部毒性，顯示只對大鼠具有特異性[53]。還有研究顯示PCPA可誘導(dǎo)雄性大鼠的性沖動(dòng)[16]。使用PCPA后的大鼠表現(xiàn)，與失眠模型聯(lián)系較少的除了性興奮和晶狀體改變，尚未看到有文獻(xiàn)記錄與失眠模型有關(guān)的其他不良反應(yīng)，也未看到有實(shí)驗(yàn)使用PCPA造模失敗的記錄。另外，造模成功與否與劑量和濃度密切相關(guān)，如果濃度過低、劑量過小，可能會(huì)使5-HT的消耗緩慢，從而延遲失眠的出現(xiàn)。

表2 使用PCPA后出現(xiàn)的癥狀和病理狀態(tài)Table 2 Symptoms and pathology after using PCPA

3 結(jié)語

PCPA作為TPH抑制劑，最早在1966年就有文獻(xiàn)從臨床藥理學(xué)的角度對PCPA進(jìn)行了評價(jià)[6]，并用志愿者進(jìn)行了人體實(shí)驗(yàn)，到70年代開始試用于類癌綜合征的治療[54]。但因其副作用的影響阻礙了其臨床使用，文獻(xiàn)中報(bào)道的臨床案例也較少，到90年代已經(jīng)看不到PCPA在人體上使用的報(bào)道。與此相反的是，PCPA在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用的文獻(xiàn)越來越多的被報(bào)道，特別是在失眠模型的建立以及與5-HT相關(guān)的中樞神經(jīng)機(jī)制研究中。

PCPA可阻礙5-HT的合成，而5-HT作為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在慢波睡眠(SWS)的誘導(dǎo)和維持中具有重要作用[55]。利用PCPA制作失眠動(dòng)物模型，可進(jìn)一步探索SWS形成的機(jī)制、5-HT在睡眠穩(wěn)態(tài)中的作用，以及與此相關(guān)的多種中樞神經(jīng)機(jī)制。但有研究發(fā)現(xiàn)，PCPA不僅影響5-HT合成，還可使中縫背核和尾狀殼核NA和多巴胺(dopamine, DA)水平下降，但對紋狀體的NA含量無影響[50]。還有研究顯示：PCPA使前后下丘腦、中腦和杏仁核中的5-HT和5-HIAA的水平下降、杏仁核和后下丘腦的DA水平增加、下丘腦前部和中腦也有增加的傾向[56]，顯示PCPA導(dǎo)致失眠的機(jī)制可能不僅僅是阻斷5-HT合成這一條途徑。利用PCPA建立失眠動(dòng)物模型，因其在水中溶解度較低在注射時(shí)極易出現(xiàn)針頭堵塞，這容易阻礙造模工作的進(jìn)展，因此，改良制備方法和尋找更合適的TPH或5-HT抑制劑作為替代藥物具有積極意義。對乙炔基苯丙氨酸(p-ethynylphenylalanine, PEPA)是一種比PCPA更有效、特異性更強(qiáng)的TPH抑制劑[57]，研究顯示PEPA體外抑制TPH活性達(dá)40%～65%，而PCPA在體外抑制TPH活性為30%～50%[58]。這些證據(jù)表明，與經(jīng)典使用的TPH抑制劑PCPA相比，化合物PEPA在體外是更有效的TPH抑制劑。而在注射PEPA后，在5-HT神經(jīng)元投射區(qū)域，海馬、紋狀體和額葉皮質(zhì)中細(xì)胞外5-HT水平分別在90、40和30 min迅速下降[59]。與PCPA對照相比，僅為PCPA濃度的十分之一，就降低了5-HT和5-HIAA水平的85%，抑制TPH活性高達(dá)97%，顯示PEPA能夠有力、迅速和不可逆地降低5-HT水平。這些結(jié)果表明PEPA與PCPA相比是一種更為有效的藥理工具，有望取代PCPA在動(dòng)物失眠模型中得到更廣泛的使用。