三種麻醉藥對(duì) C57BL/6 雄性小鼠體表心電圖的影響

彭薪元，劉 燕，夏天嬌，丁 潔，徐力致

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

由于哺乳動(dòng)物的基本生命過程具有的共性特征使得醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中探索生命過程的反應(yīng)可以部分利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來替代。然而，不同種屬的動(dòng)物又存在各自的生理特點(diǎn)，其對(duì)藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、毒性等各項(xiàng)反應(yīng)存在差異，因此只有熟悉并掌握動(dòng)物的這些差異，才能獲得真實(shí)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]，并將其有效的運(yùn)用于人類疾病的替代研究中。

心電圖描記在生物及醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中是一種常用的方法。然而由于動(dòng)物大多數(shù)無法配合檢測(cè)，強(qiáng)制性束縛又會(huì)導(dǎo)致心電觀察不準(zhǔn)，因此多數(shù)情況下動(dòng)物是在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行心電觀測(cè)[2]。這就需要考慮不同麻醉藥由于其作用機(jī)制不同，動(dòng)物對(duì)其反應(yīng)性所產(chǎn)生的差別[3]，以防止由于麻醉藥物的本底影響而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)偏差甚至錯(cuò)誤。

本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)研究中關(guān)注到，部分麻醉藥作用的小鼠心電波形與麻醉時(shí)長(zhǎng)存在一定的相關(guān)性。因此設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，以C57BL/6雄性成年小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，探討了三種常見動(dòng)物麻醉藥對(duì)小鼠心電圖的影響，探尋對(duì)小鼠心電干擾因素較低的麻醉藥及恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)采集時(shí)間，以期為環(huán)境安全、生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究中涉及小鼠心電圖的初步觀察提供一定的參考依據(jù)，降低因麻醉藥使用或觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)的選取不當(dāng)造成的實(shí)驗(yàn)失敗。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性成年小鼠24只，10～12周齡，體重25～32 g，小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所[SCXK(蘇)2015-0001]，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程飼養(yǎng)于清潔級(jí)ICV動(dòng)物房中[SYXK(蘇)2014-0052]， 自然光照、恒溫20℃ ～ 22℃、恒濕60% ～ 70%，自由飲用無菌去離子水，喂養(yǎng)SPF級(jí)小鼠維持型飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.2 主要試劑與儀器

RM6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，銀針型電極，氨基甲酸乙酯(化學(xué)純，批號(hào)：20150123)，水合氯醛(分析純，批號(hào)：20170309)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，戊巴比妥鈉(分析純，批號(hào)：3G223G27)購(gòu)自生興生物技術(shù)有限公司。藥品均使用上海百特醫(yī)療用品有限公司購(gòu)買的0.9%氯化鈉溶液(批號(hào)：S1610052)進(jìn)行配置。氨基甲酸乙酯與0.9%氯化鈉溶液比例為0.2 g/mL配置成20%的氨基甲酸乙酯溶液；水合氯醛與0.9%氯化鈉溶液比例為0.025 g/mL配置成2.5%的水合氯醛溶液；戊巴比妥鈉與0.9%氯化鈉溶液比例為0.01 g/mL配置成1%的戊巴比妥鈉溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

所有小鼠隨機(jī)分配為三組，每組8只，分別為： 20%氨基甲酸乙酯組、2.5%水合氯醛組、1%戊巴比妥鈉組。

1.3.2 麻醉

所有小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。麻醉方式采用腹腔注射麻醉。20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉，劑量為7 mL/kg； 2.5%水合氯醛溶液麻醉，劑量為3 mL/kg； 1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，劑量為10 mL/kg。等待小鼠出現(xiàn)四肢無力，對(duì)皮膚疼痛反應(yīng)消失，判斷小鼠已經(jīng)麻醉完全。

1.3.3 小鼠心電圖描記

在干凈、光線柔和、無噪音的實(shí)驗(yàn)室中，打開 RM6240E多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)。

將小鼠以仰臥位置于38℃(小鼠正常體溫)保溫實(shí)驗(yàn)臺(tái)上將3 根銀針電極分別插入小鼠腳踝皮下，注意針頭與電極的連接須十分緊, 針頭切勿插入肌肉(以防出現(xiàn)肌電波)。選擇II導(dǎo)聯(lián)(按照右上肢綠色，左下肢紅色，右下肢黑色的順序，連入 RM6240E多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，參數(shù)設(shè)定：掃描速度為40 ms/div，靈敏度為500 μV，連續(xù)記1 h的心電圖數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

RM6240E多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)連續(xù)記錄心電波形，從初始記錄開始，每隔 5 min 讀取心率一次，每次記錄時(shí)間為 10 s；每隔 10 min讀取一次 PR間期，QRS群寬度，P波振幅，選擇每個(gè)時(shí)間段中基線平穩(wěn)的連續(xù)5個(gè)心搏，分別取其平均值為該時(shí)段相應(yīng)參數(shù)測(cè)量值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Prism統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行處理，組間比較用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同麻醉藥作用小鼠心電圖波形表現(xiàn)

三種不同麻醉藥作用于小鼠連續(xù)觀察1 h，比較初始心電圖波形與40 min后波形改變情況，由表1可發(fā)現(xiàn)，水合氯醛組心電圖波形變化主要表現(xiàn)為間期隨時(shí)間延長(zhǎng)；戊巴比妥鈉組呈現(xiàn)出兩種主要波形，4只表現(xiàn)為S波較深型，4只變現(xiàn)為S波較淺型，且兩種波形均表現(xiàn)為間期隨時(shí)間延長(zhǎng)；氨基甲酸乙酯組在初始時(shí)的心電圖與40 min時(shí)的心電圖波形基本一致，無明顯變化。

表1 三種麻醉藥作用下心電圖波形變化情況Table 1 Changes in ECG of C57BL/6 mice by three anesthetics

表2 不同麻醉藥對(duì)小鼠心率的影響Table 2 Effect of different anesthetics on heart rate in the C57BL/6 mice

注：與麻醉初始比較(0 min)，aP<0.05,bP<0.01。

Note. Compared with 0 min，aP<0.05,bP<0.01.

2.2 不同麻醉藥對(duì)小鼠心率的影響

表2顯示，氨基甲酸乙酯組的平均心率明顯高于水合氯醛組和戊巴比妥鈉組(P<0.01)，并且維持在這一高水平。水合氯醛組和戊巴比妥鈉組小鼠的心率隨時(shí)間延長(zhǎng)均表現(xiàn)為受到抑制。與初始值(0 min)相比，戊巴比妥鈉組在10 min～20 min存在心率明顯降低(P<0.01),其后逐漸趨于穩(wěn)定；水合氯醛組在15 min左右心率明顯降低(P<0.01)，隨后心率逐漸趨于平穩(wěn)。

2.3 不同麻醉藥對(duì)心電圖PR間期的影響

氨基甲酸乙酯組在實(shí)驗(yàn)全程PR間期基本不變，水合氯醛組以及戊巴比妥鈉組PR間期延長(zhǎng)(圖1)。

注：與麻醉初始比較(0 min)，aP<0.05,b P <0.01。圖1 不同麻醉劑對(duì)小鼠PR間期的影響Note. Compared with 0 min， a P <0.05,b P <0.01.Figure 1 Effect of different anesthetics on the PR interval in the EGG of C57BL/6 mice

2.4 不同麻醉劑對(duì)小鼠QRS群寬度的影響

戊巴比妥鈉組QRS寬度明顯增長(zhǎng)，水合氯醛組和氨基甲酸乙酯組QRS群寬度無明顯變化(P>0.05)(圖2)。

圖2 不同麻醉劑對(duì)小鼠QRS群寬度的影響Figure 2 Effect of different anesthetics on QRS duration in the EGG of C57BL/6 mice

2.5 不同麻醉劑對(duì)心電圖P波振幅的影響

水合氯醛組P波振幅無明顯變化，戊巴比妥鈉組10 min時(shí)有抬高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。氨基甲酸乙酯組振幅不隨時(shí)間有明顯變化。(圖3)

圖3 不同麻醉劑對(duì)小鼠P波振幅的影響Figure 3 Effect of different anesthetics on the P-wave amplitude in C57BL/6 mice

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)在現(xiàn)代生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中起著重要作用，伴隨著人類文明的進(jìn)步，人們也同樣關(guān)注動(dòng)物生存福利?？茖W(xué)研究者們依循 “減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(refinement)”的“3R”原則，除了在動(dòng)物進(jìn)行有創(chuàng)實(shí)驗(yàn)前必須實(shí)施有效麻醉[4]，減輕動(dòng)物由實(shí)驗(yàn)造成的痛苦外，還應(yīng)注重優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)有效情況下，盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量。對(duì)于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)致的優(yōu)化處理，不僅符合當(dāng)今倫理學(xué)要求，更可以保障一些較難重復(fù)的實(shí)驗(yàn)(譬如環(huán)境污染對(duì)機(jī)體造成的慢性復(fù)雜性疾病發(fā)生)可以同步獲得較多的初期指標(biāo)(諸如血常規(guī)、心功能、肺功能等)，以利于進(jìn)一步機(jī)制的深入探索。

常用動(dòng)物麻醉藥有戊巴比妥鈉，水合氯醛，氨基甲酸乙酯，氯胺酮等[5-6]，或者使用兩種或兩種以上麻醉藥比如甲苯噻嗪與氯胺酮組合對(duì)動(dòng)物復(fù)合麻醉[7]。由于麻醉藥物的濃度和劑量選擇在不同研究中較為復(fù)雜，尤其在心電圖觀察中，劑量過多容易造成心電基線不穩(wěn)。同時(shí)麻醉藥本身還存在藥品不同批號(hào)存在藥效差異。研究人員根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]及本實(shí)驗(yàn)室過往經(jīng)驗(yàn)，利用少量小鼠(2～4只/組)進(jìn)行了初步預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定20%氨基甲酸乙酯7 mL/kg劑量、2.5%的水合氯醛溶液3 mL/kg劑量和1%戊巴比妥鈉溶液10 mL/kg劑量均可獲得基線穩(wěn)定的心電圖波形。

本研究顯示給予20%氨基甲酸乙酯后對(duì)小鼠心率前后的影響不明顯，而2.5%水合氯醛和1%戊巴比妥鈉對(duì)小鼠的心率均有一定的抑制作用，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。

水合氯醛對(duì)心臟表現(xiàn)為非迷走神經(jīng)效應(yīng)和迷走神經(jīng)效應(yīng)雙重作用。非迷走神經(jīng)效應(yīng)是對(duì)心臟代謝的抑制；而迷走神經(jīng)效應(yīng)表現(xiàn)為心動(dòng)徐緩。本研究顯示2.5%水合氯醛對(duì)小鼠的心率有抑制作用，引起PR間期延長(zhǎng)，這與心率的變化對(duì)應(yīng)。QRS波寬度未觀察到明顯變化，同時(shí)對(duì)于P波振幅沒有明顯影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)2.5%水合氯醛注射20 min后小鼠心電趨于平穩(wěn)，有報(bào)道顯示臨床口服水合氯醛作為先天性心臟病患兒心臟彩超檢查鎮(zhèn)靜劑[13]，可見其對(duì)心臟各項(xiàng)功能影響不大。

本研究發(fā)現(xiàn)1%戊巴比妥鈉腹腔注射給藥后，小鼠心率降低、PR間期，QRS波寬度和 QT 間期均明顯延長(zhǎng)。有研究指出戊巴比妥鈉可延緩房室結(jié)-希蒲系統(tǒng)傳導(dǎo)，延長(zhǎng)心室除極和復(fù)極時(shí)間，并抑制竇房結(jié)自律性[14]，且隨麻醉時(shí)間延長(zhǎng)而加重。這與本實(shí)驗(yàn)中所觀察到1%戊巴比妥鈉引起C57BL/6小鼠QRS波群增寬以及P波振幅下降的現(xiàn)象相符。QRS波群寬度反映的是心室除極和復(fù)極的時(shí)間，而P波作為心房除極的反映，其電位一部分是由竇房結(jié)的動(dòng)作電位組成，竇房結(jié)受到抑制可影響P波振幅。此外戊巴比妥鈉作用下，小鼠心電表現(xiàn)較不規(guī)律，有文獻(xiàn)報(bào)到戊巴比妥鈉可用于心衰模型的建立[15]，制造急性心功能不全。

本研究中20%氨基甲酸乙酯對(duì)小鼠的心率及各波形組份均無較大影響，與之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[12]。研究發(fā)現(xiàn)在氨基甲酸乙酯麻醉狀態(tài)下，交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于維持心血管活動(dòng)仍起張力性作用[16]。因此多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氨基甲酸乙酯較其它麻醉藥對(duì)各種心血管反射有更好的保護(hù)作用。但是，此作用可能掩蓋心血管藥物對(duì)心肌的基礎(chǔ)生理反應(yīng)，在研究中需加以注意。

“動(dòng)物麻醉藥是動(dòng)物臨床上的一類重要藥品，各類動(dòng)物的個(gè)性化需求增大，臨床應(yīng)用廣泛；但由于其特殊性，需要嚴(yán)格的監(jiān)管，臨床應(yīng)用上出現(xiàn)一些困擾，常常出現(xiàn)無法購(gòu)買到正規(guī)藥品，或者無藥可用的尷尬局面[17]”。而水合氯醛是一類價(jià)格低廉、容易獲得的正規(guī)藥品。同時(shí)必須指出，水合氯醛作用于中樞神經(jīng)產(chǎn)生麻醉效果僅為催眠作用，并不具有鎮(zhèn)痛作用。此外，腹腔注射水合氯醛與大鼠腸梗阻、腹膜炎和胃潰瘍有關(guān)，因此不推薦通過腹腔注射進(jìn)行存活手術(shù)[18]。美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(AVMA)目前已不推薦水合氯醛用于動(dòng)物的麻醉及安樂死。因此，國(guó)內(nèi)的研究者在其研究中往往考慮折中的方式進(jìn)行相關(guān)研究，即：僅需其催眠鎮(zhèn)靜作用進(jìn)行的相關(guān)研究(不涉及手術(shù)等創(chuàng)傷)，且不作為存活實(shí)驗(yàn)的前期麻醉藥。譬如本文的心電圖測(cè)量以及一些影像學(xué)研究，并在進(jìn)行有效觀察后，終止動(dòng)物生存。

綜上所述，20%氨基甲酸乙酯對(duì)小鼠心電前后影響不大，但始終處于高心率狀態(tài)。1%戊巴比妥鈉與2.5%水合氯醛均抑制小鼠心率，使PR間期，QRS波寬度明顯延長(zhǎng)。且水合氯醛在注射20 min后小鼠心電各波形變化趨于平穩(wěn)。因此，在進(jìn)行科學(xué)研究過程中，選擇水合氯醛進(jìn)行麻醉時(shí)，最好在麻醉20 min后再進(jìn)行相應(yīng)數(shù)據(jù)測(cè)量，以減少麻醉藥自身帶來的干擾。

最后還應(yīng)指出，不同麻醉藥甚至同一麻醉藥的不同給藥劑量，對(duì)于同一種屬不同年齡階段的動(dòng)物均可造成較大差異[19]，只有做出精細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，才能真正獲得安全、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，才能完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)真實(shí)的價(jià)值。