利用雙重sgRNAs構(gòu)建miR-223全基因敲除小鼠

趙 宣，王曉亞，劉 莉，劉佩娟，辛智倩，師長(zhǎng)宏，張彩勤，白 冰，黃 勇，張 海*

(1. 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3. 西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西安 710068)

miR-223定位于 X 染色體q12，前體全長(zhǎng)為110個(gè)核苷酸(nt)，成熟體位于前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3’端，長(zhǎng)度為22 nt[1]。miR-223在髓系發(fā)育中有重要作用，是造血系統(tǒng)特異性microRNA分子，與粒細(xì)胞的分化有重要關(guān)系，同時(shí)miR-223也可抑制紅細(xì)胞分化[2-3]。研究表明肝癌和淋巴癌中miR-223的表達(dá)被抑制，但miR-223在胃粘膜相關(guān)淋巴組織結(jié)外邊緣區(qū)淋巴瘤和復(fù)發(fā)的宮頸癌中表達(dá)增高[4-6]。在部分腫瘤組織中，miR-223表達(dá)的下調(diào)與腫瘤發(fā)生和不良預(yù)后有關(guān)[7]。最新研究表明miR-223也可靶向于ATG16L1分子抑制自噬從而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的發(fā)生[8]。

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是細(xì)菌抵抗入侵噬菌體的先天性免疫防御機(jī)制，CRISPR的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物crRNA和tracrRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物，引導(dǎo)Cas9在特定序列PAM區(qū)上游3～4 bp對(duì)目的DNA進(jìn)行切割，從而達(dá)到免疫防御的目的。在此基礎(chǔ)上，研究者將crRNA和tracrRNA嵌合后形成更為方便的short guild RNA(sgRNA)，從此利用Cas9和sgRNA可對(duì)靶基因進(jìn)行剪切的原理而發(fā)展的基因編輯系統(tǒng)已在多個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因敲入，可廣泛用于基因功能和人類疾病動(dòng)物模型研究，但這種方法只能在靶向區(qū)域產(chǎn)生短片段的缺失或插入突變(indel突變)。為更好地研究miR-223的功能，本研究，根據(jù)雙重sgRNAs(dual sgRNAs)的設(shè)計(jì)策略，在miR-223序列上下游各設(shè)計(jì)了一條sgRNA，在C57BL/6小鼠中完整敲除miR-223分子前體和成熟區(qū)序列，構(gòu)建了miR-223基因完全缺失的基因工程小鼠，克服以往單一sgRNA只能引起indel突變的弊端，這為研究miR-223分子的功能提供了良好工具。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)4～6周齡C57BL/6雌鼠30只，體重15～18 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(陜)2014-002]。6～8周齡ICR雌鼠20只購(gòu)自于北京維通利華公司[SCXK(陜)2014-002]，小鼠均飼養(yǎng)于屏障級(jí)設(shè)施[SYXK(陜)2014-001]。動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)(20171207)，在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格貫徹3R原則。

1.2 主要試劑

RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(cat: AM1354)和純化試劑盒(cat: AM1908)均購(gòu)自于Thermo Fisher公司，DNA凝膠回收試劑盒(cat: DP214-02)和總RNA提取試劑盒(cat: DP419)購(gòu)自天根生物科技有限公司。PCR Mix (cat: TSE101)由擎科生物技術(shù)有限公司提供。小鼠基因組DNA提取試劑盒(cat: DE-05213)購(gòu)自成都嘉誠(chéng)生物科技有限公司。Cas9 mRNA (cat: Cas9-102)和Cas9-NLS (cat: M0646T)蛋白分別購(gòu)自百奧邁科生物技術(shù)有限公司和NEB公司。pX330質(zhì)粒由本中心保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雙重sgRNAs設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)錄

分別將小鼠miR-223分子前體基因上、下游各200 bp序列放入http://cripr.mit.edu網(wǎng)站進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果在上、下游序列中各選取1條得分較高的20 bp寡核苷酸作為sgRNA靶向序列，上游sgRNA序列為mir223-TS1(下劃線為sgRNA靶向序列): tTAATACGACTCACTATAggCATGCTGGAAGATGTGCAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；下游sgRNA序列為mir223-TS2(下劃線為sgRNA靶向序列): tTAATACGACTCACTATAggTATGTGCTCTGTCCTGGACCGTTTTAGAGC TAGAAATAGC。sgRNA反向引物序列為：AGCACCGACTCGGTGCCACT。上述序列由擎科生物技術(shù)有限公司合成后，以pX330為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后以MEGAshortscriptTMT7轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化后定量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 sgRNA體外切割效率

取正常小鼠鼠尾組織，加入消化液后65℃作用30 min提取小鼠基因組DNA，具體提取過程按試劑盒說明書進(jìn)行。以基因組DNA為模板，通過miR223-seq-F:GGCCACCAGAATCTCCAGAC，miR223-seq-R: GCAGTCCATGGCATTTTCACA上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增底物DNA。純化后，500 ng的底物DNA中分別加入mir223-TS1、mir223-TS2 sgRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和Cas9-NLS蛋白，37℃作用30 min，具體反應(yīng)體系見表1。然后加入濃度為20 mg/mL蛋白酶K 1 μL，37℃作用 15 min，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 顯微注射及受精卵細(xì)胞移植

4～6周齡的雌性C57BL/6小鼠超數(shù)排卵后收集受精卵細(xì)胞。Cas9和sgRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按2∶1比例混合，稀釋后使其終濃度含100 ng/μL的Cas9和50 ng/μL的sgRNA。將上述RNA混合物注射到受精卵細(xì)胞胞質(zhì)中。注射后的受精卵細(xì)胞37℃培養(yǎng)24 h后移植到假孕的ICR母鼠輸卵管壺腹部。

表1 sgRNA體外切割效率檢測(cè)Table 1 sgRNA in vitro cleavage efficiency assay

1.3.4 敲除小鼠基因型鑒定

取出生1周左右新生小鼠尾組織，同上法提取小鼠基因組DNA。小鼠基因組DNA定量后，取100 ng DNA作為模板，以miR223-seq-F和miR223-seq-R為上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性3 min，98℃ 10 s， 60℃ 10 s，72℃ 20 s，72℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果以SnapGene軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 Real time PCR鑒定miR-223在敲除小鼠體內(nèi)的表達(dá)

頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟組織勻漿后提取總RNA，RNA提取按參考文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。分別建立miR-233-3p、miR-223-5p及相對(duì)應(yīng)的RNU6B內(nèi)參Real time PCR檢測(cè)體系，基因定量采用2-△△CT方法。反轉(zhuǎn)錄及Real time PCR引物如表2所示。

2 結(jié)果

2.1 雙重sgRNAs轉(zhuǎn)錄

根據(jù)雙重sgRNAs的設(shè)計(jì)策略，將miR-223前體基因上下游各200 bp序列分析后在其上游50 bp、下游30 bp處各得到一條活性較高，脫靶較低的sgRNA(TS1、TS2)，用此策略打靶可將miR-223莖環(huán)區(qū)序列完全刪除，包括其5P和3P基因(圖1A)。分別以miR223-TS1、miR223-TS2和sgRNA反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得兩條大小約為120 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后在T7啟動(dòng)子介導(dǎo)下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后大小約為120 bp(圖1B)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后OD260/280=1.81，OD260/230=2.3。體外切割實(shí)驗(yàn)表明miR223-TS1、miR223-TS2sgRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有較強(qiáng)的活性，可介導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶向序列進(jìn)行切割(圖1C)。

2.2 miR-223敲除小鼠基因型鑒定

剪取出生1周左右F0代首建鼠尾組織，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)， #3號(hào)和#15號(hào)小鼠擴(kuò)增出兩條帶，一條帶與野生型小鼠大小一致，另一條帶明顯小于野生型小鼠；而#9號(hào)和#11號(hào)小鼠只擴(kuò)增出小于野生型小鼠的單一條帶(圖2 A)，表明#3號(hào)、#9號(hào)、#11號(hào)和#15號(hào)小鼠可能在靶向區(qū)域發(fā)生突變。PCR產(chǎn)物測(cè)序后發(fā)現(xiàn)#3號(hào)和#15號(hào)小鼠只在靠近TS1區(qū)發(fā)生6 bp的缺失，未對(duì)miR-223序列產(chǎn)生影響，而#9號(hào)和#11號(hào)小鼠在TS1區(qū)后分別發(fā)生了162 bp和168 bp的純合缺失突變(圖2B)，導(dǎo)致miR-223前體和成熟區(qū)序列刪除。

2.3 miR-223在敲除小鼠體內(nèi)表達(dá)

#9號(hào)和#11號(hào)小鼠肝組織提取RNA后以miR-223-5P和3P特異性引物進(jìn)行Real time PCR后發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，兩只小鼠肝組織中幾乎不能檢測(cè)到miR-223的表達(dá)(圖3)，結(jié)合小鼠基因組測(cè)序結(jié)果，表明#9號(hào)和#11號(hào)不僅完整敲除miR-223基因序列，而且導(dǎo)致miR-223表達(dá)完全抑制。

3 討論

常規(guī)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)只需在靶向區(qū)域設(shè)計(jì)一條sgRNA即可實(shí)現(xiàn)基因打靶，這樣形成小片段的indel突變盡管也可導(dǎo)致目的基因讀碼框改變，從而導(dǎo)致基因表型的失活，但這種方法造成的indel突變片段一般不會(huì)超過100 bp[10]，這嚴(yán)重阻礙CRSIPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控。miRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA，長(zhǎng)度大約為300～1000 nt，pri-miRNA經(jīng)過一次加工后，成為pre-miRNA即microRNA前體，長(zhǎng)度大約為70～90 nt；pre-miRNA再經(jīng)過Dicer酶酶切后，成為長(zhǎng)約20～24 nt的成熟miRNA。在前期的研究中，研究人員設(shè)計(jì)一條sgRNA，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除C57BL/6小鼠pre-miR29b1分子3’和成熟體5’部分基因[11]，小鼠飼喂酒精后未誘導(dǎo)出文獻(xiàn)報(bào)道的酒精肝肝纖維化模型，推測(cè)原因可能與miR-29b1基因未完全敲除有關(guān)，殘留的前體和成熟體基因仍可能保留原有生物學(xué)活性，從而影響敲除miR-29b1基因后功能的發(fā)揮。因此在miR分子的研究中有必要將其全部基因進(jìn)行敲除，以最大程度消除殘留基因的影響。

表2 反轉(zhuǎn)錄及real-time PCR引物Table 2 Primers for reverse transcription and real-time PCR

圖1A 雙重sgRNAs設(shè)計(jì)策略圖Figure 1A Diagram of the dual sgRNAs

圖1B 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定sgRNAs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Figure 1B Identification of the sgRNAstranscripts by 1% agarose gel electrophoresis

注：M：DL1000 marker；1～20：小鼠編號(hào)；wt：野生型小鼠。圖2A 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型Note. M：DL1000 marker. 1～20: Serial numbers of the mice. wt: wild type mice.Figure 2A Identification of mouse genotypes by 1% agarose gel electrophoresis

圖2B #9和#11號(hào)小鼠突變區(qū)測(cè)序結(jié)果Figure 2B Sequencing results of the mutation regions of #9 and #11 mice

注：與野生型小鼠比較，**P < 0.01。圖3A miR-223-5P表達(dá)水平Note. Compared with the wild type mice, **P< 0.01.Figure 3A Expression of miR-223-5P

注：與野生型小鼠比較，**P < 0.01。圖3B miR-223-3P表達(dá)水平Note. Compared with the wild type mice, **P< 0.01.Figure 3B Expression of miR-223-3P

與常規(guī)sgRNA不同，雙重sgRNAs是在靶向區(qū)域上下游各設(shè)計(jì)一條sgRNA，在雙重sgRNAs的引導(dǎo)下，Cas9在兩條sgRNA之間序列進(jìn)行有目的切割，根據(jù)雙重sgRNAs距離的遠(yuǎn)近從而實(shí)現(xiàn)不同長(zhǎng)度片段的敲除。在本研究中利用雙重sgRNAs的策略，在miR-223的前體基因上、下游處各設(shè)計(jì)了一條sgRNA，miR-223特異性雙重sgRNAs與Cas9 mRNA共同顯微注射后，將miR-223基因前體和成熟體基因完全刪除，在目的區(qū)域造成162 bp和168 bp缺失。此外隨機(jī)選取20個(gè)sgRNAs靶序列潛在的脫靶位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增后測(cè)序結(jié)果表明未發(fā)生脫靶效應(yīng)。因此雙重sgRNAs是一種簡(jiǎn)便、有效實(shí)現(xiàn)較大片段基因突變的方法，而這為研究miR-223功能提供重要的研究工具。