文拉法辛對慢性束縛應(yīng)激大鼠焦慮和抑郁樣行為的影響

趙洪慶，雷 昌，楊 嫻，何文龍，張思靜，韓遠(yuǎn)山,2，王宇紅,2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，科技創(chuàng)新中心，長沙 410208)

焦慮癥和抑郁癥是當(dāng)今社會(huì)最常見的兩種神經(jīng)精神疾病，兩者具有高度關(guān)聯(lián)性且多同時(shí)發(fā)生，為患者造成了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)WHO流行病學(xué)調(diào)查顯示，兩者共病比例可高達(dá)70%，且近80%的抑郁癥患者伴有明顯的焦慮癥狀，焦慮癥狀不僅能導(dǎo)致抑郁癥治療產(chǎn)生阻抗，也是增加其致殘率和致死率的重要原因[2]。因此，尋找兩種疾病的共性，并在此基礎(chǔ)上開展防治研究具有重要意義。大量文獻(xiàn)研究表明，慢性束縛應(yīng)激能誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物的抑郁和焦慮樣行為，但對束縛時(shí)長及造?？倳r(shí)長有不同的報(bào)道[3-4]，本課題組前期通過對大鼠束縛時(shí)間(3 h、6 h)和慢性束縛應(yīng)激總時(shí)長(7 d、14 d、21 d)篩選研究發(fā)現(xiàn)，21 d慢性束縛應(yīng)激6 h能使大鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑郁和焦慮樣行為，是研究抑郁與焦慮共患病的良好動(dòng)物模型[5]。文拉法辛是一種新型抗抑郁藥，主要通過抑制5-HT和NE的再攝取來改善抑郁患者的臨床癥狀，臨床研究發(fā)現(xiàn)，文拉法辛治療抑郁癥伴發(fā)焦慮障礙患者效果要明顯優(yōu)于氟西汀等常規(guī)抗抑郁藥[6]。然而，目前對文拉法辛的基礎(chǔ)研究都是從抗抑郁作用著手，并未明確其對動(dòng)物焦慮樣行為的影響?；诖耍緦?shí)驗(yàn)以慢性束縛應(yīng)激大鼠為研究對象，觀察文拉法辛對大鼠焦慮和抑郁樣行為的影響，并從腦內(nèi)單胺遞質(zhì)和HPA軸等角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動(dòng)物房[SYXK(湘)2015-0003]，實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)：20180717。大鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均在室溫(24±1)℃、相對濕度(50±5)%環(huán)境下，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸文拉法辛片(規(guī)格：每片75 mg，批號(hào)：L20778)購于成都康弘藥業(yè)公司；5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)、去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)、多巴胺(dopamine, DA)對照品購于中國食品藥品檢定研究院；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)試劑盒購于上海晶天生物公司；蘇木精、伊紅購于上海江萊生物公司；大鼠固定架購于北京冀諾泰科技公司；高架十字迷宮購于長沙肯基科技公司；斯金納箱購于西班牙Panlab公司；RM223切片機(jī)、倒置光學(xué)顯微鏡購于德國Leica公司；高效液相色譜儀購于美國Agilent公司；電化學(xué)檢測器購于荷蘭Antec公司；酶標(biāo)儀購于美國Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與造模

根據(jù)體質(zhì)量值將36只SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組、慢性束縛應(yīng)激模型組和文法拉辛組，每組12只。對照組大鼠正常飼養(yǎng)，模型組和文拉法辛組大鼠均給予21 d的慢性束縛應(yīng)激，具體方法為：將大鼠放入特制的長22 cm，直徑8 cm的固定架中，固定架前端有通氣孔使動(dòng)物保持正常呼吸，尾端有三個(gè)孔徑的圓形門，可根據(jù)動(dòng)物身長自由切換，每天固定時(shí)間為9:00～15:00，共6 h。

1.3.2 動(dòng)物給藥

于造模期間灌胃給藥，文拉法辛臨床人用劑量為75 mg/d，根據(jù)體表面積比率換算，大鼠的臨床等效劑量為6.75 mg/kg，灌胃體積為10 mL/kg，每天1次，對照組和模型組大鼠則給予等體積蒸餾水。末次給藥完成后，動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)測試，測試完成后取血液和海馬組織保存。

1.3.3 行為學(xué)檢測

(一)焦慮行為檢測：① 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入標(biāo)準(zhǔn)的高架十字迷宮正中央?yún)^(qū)域，頭朝閉臂，使動(dòng)物自由探索5 min，記錄大鼠分別進(jìn)入封閉臂次數(shù)(closed-arm entries, CE)和開放臂次數(shù)(open-arm entries, OE)，以及在封閉臂停留時(shí)間(closed-arm times, CT)和開放臂停留時(shí)間(open-arm times, OT)，由此計(jì)算出：(1)總穿臂次數(shù)(total entries, TE)：OE+CE；(2)進(jìn)入開放臂次數(shù)的比例(OE%)：OE/(OE+CE)×100%；(3)開放臂停留時(shí)間比例(OT%)：OT/(OT+CT)×100%。② 場景恐懼測試：于測試前1 d進(jìn)行訓(xùn)練，大鼠在斯金納箱適應(yīng)2 min后，給予30 s的噪音(5 kHz，75 dB)，在噪音結(jié)束最后2 s同時(shí)給予電擊(50 V)，繼續(xù)停留30 s。24 h后進(jìn)行測試，大鼠進(jìn)入斯金納箱2 min后給予60 s的噪音，記錄60 s內(nèi)大鼠的僵住時(shí)間(Freezing)百分比。

(二)抑郁行為檢測：① 曠場實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入長寬高分別為80、80、40 cm的黑色敞箱中，敞箱底部均勻劃分為25個(gè)小格，測試時(shí)將大鼠置于敞箱正中央小方格中，每次均從同一方向放入，大鼠自由活動(dòng)1 min后，記錄4 min內(nèi)大鼠的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)和垂直站立次數(shù)。② 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入高50 cm、直徑20 cm、水深約35 cm的圓柱形塑膠玻璃筒中，水溫保持在(24±1)℃，待大鼠自由游泳適應(yīng)1 min后，記錄5 min內(nèi)大鼠游泳不動(dòng)時(shí)間。

1.3.4 組織病理形態(tài)觀察

取固定于4%多聚甲醛溶液中的海馬組織，常規(guī)石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟、水化后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)后再進(jìn)行脫水、透明和封片，裝盒待用。顯微鏡下觀察、拍取圖片，分析各組大鼠海馬組織的病理損傷情況。

1.3.5 HPLC-ECD檢測

采用高效液相色譜-電化學(xué)(HPLC-ECD)法檢測大鼠海馬單胺遞質(zhì)含量，取海馬組織稱重，按1:10比例加入0.01 mol/L高氯酸溶液，冰上勻漿，4℃、13 000 r/min條件下離心15 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后待測。色譜條件為：色譜柱：Quattro 3 C18柱；流動(dòng)相：磷酸二氫鈉/檸檬酸混合液—甲醇(87∶13)；流速：0.2 mL /min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法為：精密稱取適量對照品溶于0.01 mol/L高氯酸溶液中，配成1 mg/mL儲(chǔ)備液，依次稀釋成200、100、50、25、12.5、6.25 ng/mL，根據(jù)各峰面積計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

1.3.6 ELISA實(shí)驗(yàn)

采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血漿CRH、ACTH、CORT含量，整個(gè)過程按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。依次將血漿、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體加入到試劑盒中，37℃溫育30 min，洗滌液沖洗5次；分別加入顯色劑A、顯色劑B各50 μL，混勻，37℃避光顯色15 min，而后加入終止液50 μL以終止反應(yīng)，于450 nm波長下測量各孔的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各組大鼠血漿待測物質(zhì)的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 單胺遞質(zhì)對照品的回歸方程和線性范圍Table 1 Regression equations and linear ranges of three monoamine neurotransmitters

2 結(jié)果

2.1 文拉法辛對慢性束縛應(yīng)激大鼠焦慮行為的影響

在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠較正常大鼠的TE、OE%、OT%值均明顯下降(P<0.01)；文拉法辛給藥后，大鼠TE、OE%和OT%值均顯著上升(P<0.01或P<0.05)；在場景恐懼測試中，模型組大鼠Freezing時(shí)間比顯著上升，給藥后則有較明顯的下降(P<0.05)。說明文拉法辛能改善慢性束縛應(yīng)激大鼠的焦慮樣行為。見表2。

2.2 文拉法辛對慢性束縛應(yīng)激大鼠抑郁行為的影響

曠場實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠比較，慢性束縛應(yīng)激大鼠自主活動(dòng)評分顯著下降(P<0.01)，不動(dòng)時(shí)間增加(P<0.01)，展現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)不能和行為絕望的抑郁樣特征，在文拉法辛治療后，大鼠抑郁樣行為得到明顯改善，水平和垂直得分增加(P<0.01或P<0.05)，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間下降(P<0.01)。見表3。

2.3 文拉法辛對慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬形態(tài)學(xué)的影響

如圖1所示，正常大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞間隙正常，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞有較明顯的缺失，細(xì)胞排列紊亂，部分神經(jīng)元胞體呈空泡狀，胞核深染，整體損傷明顯；文拉法辛組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量增多，排列趨于正常，整體損傷情況有明顯的緩解。

2.4 文拉法辛對慢性束縛應(yīng)激大鼠單胺神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中神單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA含量均顯著下降(P<0.01或P<0.05)；而在給予文拉法辛治療后，單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯回升(P<0.01或P<0.05)，表明文拉法辛能改善慢性束縛應(yīng)激大鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)失調(diào)狀態(tài)。見表4。

表2 各組大鼠焦慮樣行為測試結(jié)果 (n=12)Table 2 Results of anxiety-like behavior test in the rats

注：與對照組比較，**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the control group,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表3 各組大鼠抑郁樣行為測試結(jié)果 (n=12)Table 3 Results of depressive-like behavior test in the rats

注：與對照組比較，**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01.

Note. Compared with the control group,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表4 各組大鼠海馬單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量 (ng/g，n=6)Table 4 Hippocampal monoamine neurotransmitter content in the rats

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.5 文拉法辛對慢性束縛應(yīng)激大鼠血漿HPA軸指標(biāo)的影響

與對照組相比，模型組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量均有明顯的上升(P<0.01)，HPA軸紊亂明顯；文拉法辛治療后，血漿CRH、ACTH、CORT含量均有不同程度的下降(P<0.01或P<0.05)，其中以CRH下降最為明顯(P<0.01)，表明文拉法辛能抑制慢性束縛應(yīng)激大鼠HPA軸過度亢進(jìn)現(xiàn)象。見表5。

3 討論

本研究采用21 d慢性束縛應(yīng)激的方法造模，經(jīng)多種行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠在高架十字迷宮中的開臂探索行為下降，場景恐懼中的Freezing時(shí)間比增加，同時(shí)自主活動(dòng)能力下降，絕望行為增加，表現(xiàn)出穩(wěn)定的焦慮和抑郁樣行為。該結(jié)果證明慢性應(yīng)激是焦慮癥與抑郁癥的共同發(fā)病因素，慢性束縛應(yīng)激可作為焦慮抑郁共病發(fā)病機(jī)制研究及藥物篩選的動(dòng)物模型。

單胺假說是目前公認(rèn)的抑郁癥發(fā)病關(guān)鍵機(jī)制，假說認(rèn)為抑郁癥的發(fā)病與中樞神經(jīng)單胺類遞質(zhì)5-HT、NE、DA的耗竭緊密相關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的嚴(yán)重程度與體內(nèi)單胺遞質(zhì)的耗竭呈正相關(guān)[8]。目前臨床上主要以5-HT、NE重吸收抑制劑(SSRIs)作為抑郁類疾病治療的首選藥物，通過阻斷5-HT或NE重吸收，提升其在突觸間隙的濃度，進(jìn)而有效緩解病情[9]。海馬作為腦內(nèi)主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶及情緒行為的組織，是焦慮、抑郁等神經(jīng)精神疾病研究的關(guān)鍵靶器官[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬組織存在神經(jīng)元缺失、排列紊亂、部分胞體呈空泡狀等病理現(xiàn)象，單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量顯著下降，均與其焦慮和抑郁樣行為相關(guān)，而在給予抗抑郁藥文拉法辛干預(yù)治療后，大鼠神經(jīng)元損傷情況有所緩解，海馬組織內(nèi)單胺遞質(zhì)含量有明顯的升高，焦慮及抑郁樣行為均明顯改善。

HPA軸由下丘腦、垂體和腎上腺構(gòu)成，是體內(nèi)重要的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，下丘腦分泌CRH，激活垂體產(chǎn)生ACTH，繼而促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)的組織增生及皮質(zhì)激素的生成分泌，共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡[11]。研究表明，焦慮癥與抑郁癥患者均存在HPA軸功能亢進(jìn)現(xiàn)象，且抑郁共患焦慮患者HPA軸亢進(jìn)更為明顯[12]。長期接受慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致HPA軸基礎(chǔ)活性增高，使腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素增多，透過血腦屏障進(jìn)入到腦，而海馬組織又是腦內(nèi)HPA軸的高位調(diào)節(jié)中樞，密集分布著糖皮質(zhì)激素受體，易遭受過量糖皮質(zhì)激素的攻擊而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，影響大腦的認(rèn)知功能并加重情緒障礙[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量為正常大鼠的數(shù)倍，顯示其體內(nèi)HPA軸高亢，而文拉法辛治療后能降低模型大鼠的HPA軸功能亢進(jìn)狀態(tài)。

圖1 各組大鼠海馬組織的病理改變(HE染色)Figure 1 Pathological changes in hypocampal tissues of the rats

組別Groups促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素CRH促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH皮質(zhì)酮CORT對照組 Control7.85 ± 0.964.27 ± 0.6918.91 ± 3.10模型組 Model20.89 ± 4.64??9.70 ± 1.97??37.37 ± 5.81??文拉法辛組 Venlafaxine 11.79 ± 2.08?? 6.84 ± 0.91# 26.75 ± 4.72#

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

綜上，文拉法辛能改善慢性束縛應(yīng)激大鼠的焦慮和抑郁樣行為，減緩海馬組織的損傷，其作用可能與上調(diào)腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量，抑制體內(nèi)HPA軸過度亢進(jìn)有關(guān)。