姜黃素對沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠血液和組織中性粒細胞的影響

張東輝，劉江偉*，康 燕，許 琴，李建瑛，李佳佳，是文輝， 董 翔， 馬 娜，宋來陽

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室，烏魯木齊，830000; 2.解放軍69240部隊醫(yī)院，烏魯木齊，830000)

重癥中暑即熱射病是一種危及生命的急性熱致疾病，臨床表現(xiàn)為“類膿毒癥”，普遍認為這是腸源性內(nèi)毒素進入血液循環(huán)，這類熱源作用于下丘腦的視前區(qū)—下丘腦前部的熱敏神經(jīng)元，導(dǎo)致體溫調(diào)定點上升，體溫逐步上升，高熱本身可損傷臟器組織細胞，導(dǎo)致細胞變性、壞死和凋亡，同時白細胞數(shù)量，尤其中性粒細胞數(shù)量明顯增加，最終導(dǎo)致多種臟器功能衰竭危及生命[1-2]。推測中性粒細胞在血液和組織浸潤中的變化可能在沙漠干熱環(huán)境中暑的組織損傷及多器官功能障礙中起重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)處理能夠延長沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠的生存時間，并且未見明顯毒性[3]。姜黃素對沙漠干熱環(huán)境中暑多臟器保護作用機制是一個正在研究的課題，除本課題組的研究外，國內(nèi)外鮮有報道，本研究探討姜黃素預(yù)處理對沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠血液和回腸、肝、腎、肺組織中的中性粒細胞數(shù)量變化的影響，以期從中性粒細胞角度探討姜黃素對中暑大鼠多臟器保護的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠160只(雄性、6～8周齡、體重220～260 g)，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號[SCXK(新)2016-0001]。SD大鼠飼養(yǎng)于新疆軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科SPF環(huán)境獨立通氣籠[SYXK(新)2016-0003](溫度：(25±2)℃；相對濕度：40～70%)中常規(guī)飼養(yǎng)一周。本實驗經(jīng)新疆軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物倫理與福利委員會審查通過。

1.2 主要試劑與儀器

全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BS-180)、全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BC-2800Vet)、羧甲基纖維素鈉(上海源葉生物科技有限公司， 300～800 mpa.s)、姜黃素(東京化工業(yè)株式會社，天然物(CI-75300))、西北特殊環(huán)境人工實驗艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

將160只健康雄性大鼠隨機分為4組： 對照組(鹽水組)：生理鹽水灌胃；姜黃素低劑量預(yù)處理組(低劑量)：姜黃素5 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；姜黃素中劑量預(yù)處理組(中劑量組)：姜黃素10 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；姜黃素高劑量預(yù)處理組(高劑量組)：姜黃素20 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。以上溶液配成混懸液搖勻待用，按照1 mL/100 g灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃7 d。

1.3.2 模型建立及取材方法

大鼠連續(xù)灌胃7 d，第8天轉(zhuǎn)移到西北特殊環(huán)境人工實驗艙內(nèi)，將氣候模式設(shè)定為沙漠干熱環(huán)境：(41±0.5)℃，相對濕度(10±1)%，大鼠進艙前，可隨意飲水，禁食12 h。大鼠進艙后禁食禁水，可在籠內(nèi)自由活動。按0 min、50 min、100 min、150 min時間點從艙中每組取出10只大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉，大鼠麻醉后，剪開腹腔，下腔靜脈采血，用于中性粒細胞數(shù)檢測；取150 min組大鼠回腸、肺、肝、腎置于福爾馬林固定、脫水、切片、HE染色、鏡下觀察，描述組織病理變化；于40×10倍鏡下觀察10個視野，記錄組織中性粒細胞數(shù)，計算單個視野內(nèi)中性粒細胞平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對干熱環(huán)境不同階段中暑大鼠血液中性粒細胞影響結(jié)果

結(jié)果顯示鹽水組、姜黃素低、中、高濃度組血液中性粒細胞在0 min至50 min時呈上升趨勢，鹽水組和低濃度組在50 min明顯高于0 min，具有顯著性差異(P<0.01)，中濃度組和高濃度組雖然在50 min高于0 min，但無顯著性差異(P>0.05)。從50 min至150 min血液中性粒細胞呈下降趨勢，其中在鹽水組和低濃度組，50 min、100 min和150 min三個時間點之間均存在顯著性差異(P<0.01)，在中濃度組，100 min、150 min與50 min之間均有顯著性差異(P<0.01)，但100 min與150 min之間無顯著性差異(P>0.05)；在高濃度組，僅在150 min明顯低于50 min(P<0.01)，區(qū)域各時間點之間無顯著性差異組(P>0.05)。在100 min時，高濃度組明顯高于鹽水組(P<0.05)；在150 min時，高、中濃度組中性粒數(shù)明顯高于鹽水組和低濃度組(P<0.01或P<0.05)，提示中、高濃度姜黃素預(yù)處理組可以阻止血液中性粒細胞的數(shù)量下降減少，其中以高濃度組更加明顯。見表1。

2.2 肝、腎、回腸、肺病理鏡下觀察結(jié)果

2.2.1 肝

第150 min重度中暑狀態(tài)時，鹽水組肝組織中肝細胞顆粒樣變，肝竇擴張充血較為嚴重，竇細胞體積增大，肝竇中有較多中性粒細胞浸潤；第150 min姜黃素高劑量組肝組織中肝細胞顆粒樣變，輕微腫脹，肝竇狹窄，局部肝竇充血，竇細胞體積增大，肝竇中中性粒細胞明顯減少。見圖2。

2.2.2 腎

第150 min鹽水組腎腎小球絲球體中血管擴張充血，絲球體細胞變性，有較多中性粒細胞浸潤，腎小球囊腔狹窄，部分腎小球周圍遠曲管上皮細胞腫脹，顏色變淺，可見管型；姜黃素高劑量組腎小球絲球體細胞輕微腫脹，中性粒細胞浸潤數(shù)量明顯減少，周圍腎小管上皮輕微濁腫。見圖3。

2.2.3 回腸

第150 min鹽水組粘膜上皮細胞變性壞死脫落，部分粘膜固有層中細胞變性壞死較多，細胞數(shù)量明顯減少，并有大量中性粒細胞浸潤；姜黃素高劑量組部分粘膜上皮細胞核濃縮，上皮結(jié)構(gòu)較為完整，粘膜固有層周邊血管擴張充血，固有層中可見少量中性粒細胞浸潤。見圖4。

注：a:100 min時，各濃度組與鹽水組比較，P<0.05； b:150 min時，各濃度組與鹽水組比較，P<0.01，c:各濃度組與低濃度組比較，P<0.05，d: 各濃度組與低濃度組比較，P<0.01； e：各時間組與0 min組比較，P<0.01；f：各時間組與0 min組比較，P<0.05；g：各時間組與50 min組比較，P<0.01；h：各時間組與100 min組比較，P<0.01；j：各時間組與100 min組比較，P<0.05。

Note. a, At 100 min, each concentration group compared with the saline group,P< 0.05. b, At 150 min, each concentration group compared with the saline group,P< 0.01. c, Each concentration group compared with the low concentration group,P< 0.05. d, Each concentration group compared with the low concentration group,P< 0.01. e, Each time group compared with the 0 min group,P< 0.01. f, Each time group compared with the 0 min group,P< 0.05. g, Each time group compared with the 0 min group,P< 0.05. h, Each time group compared with the 100 min group,P< 0.01. j, Each time group compared with the 100 min group,P< 0.05.

圖2 第150 min 鹽水組(a)與150 min 姜黃素高劑量組(b)的肝組織病理圖片。HE染色Figure 2 Histological images of the liver tissues of the 150 min saline group (a) and 150 min curcumin high dose group (b). HE staining.

圖3 第150 min鹽水組腎小球(a)、第150 min鹽水組腎小管管型(b)和第150 min姜黃素高劑量組腎小球(c)的病理學(xué)變化。HE染色Figure 3 Histopathological changes in the kidney tissues showing a glomerulus (a) and urinary cast (b) of the 150 min saline group, and a glomerulus of the 150 min curcumin group (c). HE staining.

圖4 回腸組織的病理學(xué)變化, a: 第150 min鹽水組；b: 第150 min姜黃素高劑量組。HE染色Figure 4 Histopathological changes of the ileum tissues of the 150 saline group (a) and 150 min curcumin high dose group (b).

2.2.4 肺

第150 min鹽水組肺泡數(shù)量減少，部分肺泡上皮細胞核淡染腫脹，部分上皮細胞變性壞死脫落至肺泡腔中，肺泡間隔明顯增厚，間隔中毛細血管擴張充血，可見較多中性粒細胞浸潤；姜黃素高劑量組肺泡間隔輕微增厚，間隔中部分毛細血管擴張充血，可見少量中性粒細胞浸潤。見圖5。

圖5 肺組織的病理學(xué)變化，a: 第150 min鹽水組；b: 第150 min姜黃素高劑量組。HE染色Figure 5 Histological changes in the ileum tissues of the 150 min saline group (a) and 150 curcumin high dose group (b). HE staining.

2.3 姜黃素對干熱環(huán)境第150 min大鼠各組織中性粒細胞浸潤數(shù)量影響結(jié)果

鏡下觀察結(jié)果顯示：第150 min回腸、肝、腎、肺的中性粒浸潤數(shù)隨著姜黃素預(yù)處理濃度的增加，均呈下降趨勢，中、高濃度組中性粒細胞數(shù)明顯低于低濃度組和鹽水組(P<0.01)，低濃度組和鹽水組之間差異無顯著性(P>0.05)，除了回腸的中、高濃度組之間差異具有顯著性外(P<0.01)，肝、腎、肺的中濃度組與高濃度組之間差異無顯著性(P>0.05)提示中、高劑量的姜黃素預(yù)處理在一定時間內(nèi)可以減少浸潤到組織的中性粒細胞數(shù)量。見表2。

表2 第150 min姜黃素各劑量組回腸、肝、腎、肺組織中鏡下中性粒細胞計數(shù)結(jié)果Table 2 Neutrophils counts in the ileum, liver, kidney, and lung tissues of 150 min groups

注：a：各濃度組與鹽水組比較P<0.01；b: 各濃度組與低劑量姜黃素組比較，P<0.01；c: 各濃度組與中劑量姜黃素組比較，P<0.01。

Note. a，Each concentration group compared with the saline group,P< 0.01. b， Each concentration group compared with the curcumin low dose group,P< 0.01. c， Each concentration group compared with the curcumin medium dose group,P< 0.01.

2.4 干熱環(huán)境大鼠血液中性粒細胞數(shù)與各組織浸潤的中性粒細胞數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果

各組在放置150 min時達到熱射病狀態(tài)時，血液中性粒細胞數(shù)與各組織浸潤的中性粒細胞數(shù)進行Pearson相關(guān)性分析(資料符合二元正態(tài)性分布)發(fā)現(xiàn)血液中性粒細胞數(shù)與組織中性粒浸潤數(shù)呈明顯負相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為：回腸(r=-0.482，P=0.002)；肝(r=-0.339，P=0.032)；腎(r=-0.563,P=0.000)；肺(r=-0.360，P=0.022)。

3 討論

中性粒細胞具有很強的變形運動能力，能吞噬、消化細菌及機體本身的壞死組織和衰老的紅細胞，故有防御病菌和清除壞死組織的作用。它是機體發(fā)生急性炎癥時的主要反應(yīng)細胞。重癥中暑時腸粘膜病變，通透性增大，內(nèi)毒素進入血液循環(huán)，血液中的中性粒細胞數(shù)量明顯增加，同時體溫上升，高熱本身可損傷臟器組織細胞，導(dǎo)致細胞變性、壞死和凋亡，此時血液中性粒細胞以變形運動穿出毛細血管大量進入組織中，在壞死組織中清除組織碎屑，而死亡的中性粒細胞會釋放出一些因子，進一步損傷周圍的組織[4]。本次研究發(fā)現(xiàn)沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠鹽水組、溶劑組、姜黃素低濃度組在特殊環(huán)境人工實驗艙干熱環(huán)境[(41±0.5)℃，相對濕度(10±1)%]中放置50 min，血液中性粒細胞數(shù)量均呈上升趨勢，隨時間延長至150 min，各組血液中性粒細胞數(shù)量均呈下降趨勢，姜黃素高濃度和中濃度組組血液中性粒細胞數(shù)量下降明顯減少，尤其以高濃度組更加明顯。這表明一定濃度的姜黃素可延緩血液中性粒細胞進入組織的時間。通過病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)組織中的中性 粒細胞數(shù)量增多與血液中性粒細胞數(shù)下降呈顯著呈負相關(guān)，血液中的中性粒細胞數(shù)量越少越多，組織中的中性粒細胞浸潤數(shù)量越多，組織病變越嚴重。提示姜黃素可能在一定程度上減少中暑大鼠血液中中性粒細胞向組織中轉(zhuǎn)移和浸潤的數(shù)量來減少組織的損傷，因而認為姜黃素預(yù)處理在中暑中發(fā)揮臟器保護作用與姜黃素抑制組織中性粒浸潤有密切關(guān)系。

姜黃素對沙漠干熱環(huán)境中暑過程中多臟器保護作用的機制是多方面的，前期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠臟器組織細胞有直接的保護作用。針對沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠的腦、腎、肝等臟器研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制細胞內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，由于氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與細胞線粒體損傷有關(guān)，推測其機制可能是姜黃素對細胞線粒體有保護作用[5-7]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠姜黃素預(yù)處理組在特殊環(huán)境人工實驗艙高熱環(huán)境中體重降低速率明顯低于鹽水組，即姜黃素預(yù)處理組失水速率小，且發(fā)現(xiàn)姜黃素在干熱環(huán)境中能夠維持血液中較高的 pO2、減緩血液pH值降低、維持血液中糖、甘油三酯能量物質(zhì)于較高水平，從而推論姜黃素通過維持機體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，降低組織細胞缺血缺氧的程度，減輕組織病變，發(fā)揮對沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠損傷保護作用[8]。本研究提示姜黃素可能通過減少組織中中性粒細胞的浸潤來發(fā)揮臟器保護作用。

臨床上中暑患者血液中性粒細胞呈上升趨勢[9]，本研究發(fā)現(xiàn)，在中暑早期血液中中性粒細胞上升明顯，隨著中暑進展血液中中性粒細胞呈逐漸下降趨勢，推測中性粒細胞可能通過損傷的血管內(nèi)皮發(fā)生了“轉(zhuǎn)移”。 Roberts 等[10]的狒狒中暑模型研究發(fā)現(xiàn)，在嚴重中暑，出現(xiàn)微血管內(nèi)皮損害，白細胞發(fā)生透過血管壁遷移現(xiàn)象，同時發(fā)現(xiàn)激活的血小板和中性粒細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，存在著血小板、中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞的相互作用。血小板減少常常作為判斷重癥中暑病情加重的指標(biāo)之一，研究人員認為，若在中暑進展過程中出現(xiàn)中性粒細胞減少常常預(yù)示著病情加重，較多的中性粒細胞通過損傷的內(nèi)皮遷移到臟器組織，增加了組織中性粒細胞的浸潤，從而加重了組織損傷。因此中性粒細胞的減少也可作為判斷中暑病情加重的診斷指標(biāo)。

總之，無論姜黃素直接作用于細胞還是維持機體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定來發(fā)揮中暑大鼠的多臟器保護作用，本研究首次提出，姜黃素可能通過減少血液中性粒細胞的向組織中浸潤和轉(zhuǎn)移來發(fā)揮中暑臟器的損傷保護作用。