曲克蘆丁對吡柔比星所致大鼠急性心肌毒性的保護及其機制

張 桐，范志民，張 洋，侯天一，賈泓瑤，秦 夢，孫 波，任立群*

(1.吉林大學藥學院, 長春，130021；2.吉林大學第一醫(yī)院，長春130021)

吡柔比星(pirarubicin, THP)是一種臨床上常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，廣泛地用于治療血液系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤，如乳腺癌、淋巴癌、急性白血病等。目前，臨床上一線抗腫瘤的標準方案，通常是以THP等蒽環(huán)類藥物為基礎的聯(lián)合治療，其療效確切[1]。但THP可引起脫發(fā)、骨髓抑制和心臟毒性等毒副反應，其中心臟毒性最為嚴重[2]。這些毒副反應極大地限制了THP的臨床應用。右丙亞胺(dexrazoxane, DZR)是目前FDA唯一批準的預防蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性的保護劑，但右丙亞胺對使用人群的性別、年齡及用量上有所限制[3-4]，因此，目前急需找到安全、有效藥物用于預防THP引起的心臟毒性，顯得尤為重要。

曲克蘆丁(troxerutin, TRX)，是蘆丁的衍生物，是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物[5]。TRX具有抑制紅細胞和血小板凝聚、防止血栓形成[6]、改善微循環(huán)[7]、促進新血管生成等作用。此外，TRX還能對抗5-羥色胺和緩激肽引起的血管損傷并對內(nèi)皮細胞起到保護作用，并可以防止由于長距離引起的飛行水腫，還具有抗化學性肝損傷、抗炎癥作用[8-11]。目前，本課題組已發(fā)現(xiàn)蘆丁可顯著改善THP所致大鼠急性心肌毒性的心肌組織病理學損傷，心電異常，和心臟功能障礙、心肌酶異常；蘆丁可通過顯著降低JNK、cleaved caspase-3蛋白水平、升高BCL-2 /BAX比率。從而改善THP所致大鼠急性心肌毒性。本實驗是通過THP所致急性心肌毒性大鼠模型，觀察TRX對THP所致急性心肌毒性大鼠的心臟系數(shù)、心電圖、心功能、血清心肌酶、SOD和MDA、心臟組織病理學形態(tài)等指標的影響，探討TRX對THP所致大鼠急性心肌毒性的保護機制。旨在為進一步開發(fā)應用曲克蘆丁提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康2月齡SPF級Wistar雄性大鼠60只，體重170～190 g，購于遼寧長生生物技術有限公司[SCXK(遼) 2015-0001]。飼養(yǎng)于吉林大學藥學院中藥藥理三級實驗室[TCM-2009-084]，經(jīng)吉林大學藥學院實驗動物倫理委員會批準(2017年，研審第(20170503))，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。室溫為25℃,相對濕度為50%～70%，飼喂全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，臺式低溫離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)，Nikon ECLIPSE 80i正置顯微鏡(日本尼康公司)，電泳轉移裝置(美國Bio-Rad公司)，純水儀(成都品成科技有限公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國MD公司)，化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將60只雄性Wistar大鼠(體重170～190 g)，隨機分為6組，每組10只，即正常組(CON)、吡柔比星組(THP)、右丙亞胺+吡柔比星組(DZR+THP)、曲克蘆丁低劑量+吡柔比星組(TL+THP)、曲克蘆丁中劑量+吡柔比星組(TM+THP)、曲克蘆丁高劑量+吡柔比星組(TH+THP)。

1.3.2 動物給藥及血流動力學指標采集

按照體重隨機分組，TRX低、中、高組每天灌胃TRX水溶液1次(25、50、100 mg/(kg·d)),其余3組每日灌胃等體積三蒸水作為對照，每天灌胃持續(xù)5 d。且實驗第6天的灌胃后，DZR+THP組單次尾靜脈注射180 mg/kg的DZR，尾靜脈注射30 min后，除正常組大鼠注射等體積生理鹽水外，其余各組大鼠均單次注射18 mg/kg的THP[14]，TRX繼續(xù)灌胃，第8天實驗結束。

實驗結束后，每組大鼠進行心功能測定，麻醉后固定于手術臺上，四肢導聯(lián)。并由胸鎖骨胸鎖乳突肌內(nèi)側分離右頸總動脈，頭端結扎，向心端插入連有感受器的靜脈留置針。將靜脈留置針緩緩插入，使之通過左側動脈瓣和房室瓣進入左心室[18]，采用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，連接到計算機上，待連有感受器的靜脈留置針進入左心室后，產(chǎn)生穩(wěn)定的波形，進行數(shù)據(jù)保存，采集左心室收縮壓(LVSP，mmHg)、左心室終末舒張壓(LVEDP，mmHg)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax，mmHg/s)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax，mmHg/s)等血流動力學指標。同時，在檢測心功能參數(shù)的同時，按標準肢體Ⅱ導聯(lián)方法，分析大鼠心電圖。采集QRS波群、Q-T間期、心率(HR)等心肌電生理參數(shù)。

1.3.3 指標檢測

采集完血流動力學數(shù)據(jù)后，腹主動脈取血，室溫靜置1 h，3000 r/min離心10 min，分離血清。檢測血清中MDA、SOD、BNP、CK-MB、cTn-T及LDH的含量。

“茶產(chǎn)品分析與檢驗”課程具有較強的實務性、實踐性及應用性特點，應配備一定的實驗課，以強化學生的實驗動手能力、觀察分析能力和數(shù)據(jù)處理能力，是應用能力培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。實驗內(nèi)容的安排一是要與理論課程銜接；二是以相關國家產(chǎn)品標準的檢驗項目和檢驗方法標準的方法為依據(jù)，其中產(chǎn)品標準中的出廠檢驗項目列為必做項目；四是有利于學生的創(chuàng)新能力提高。

1.3.4 心組織心臟系數(shù)的測定及其病理學檢查

稱取大鼠體重，處死后，迅速取出心臟組織，用生理鹽水清洗，稱取心臟重量，公式如下：

切取心臟心尖凍存，其余部分10%甲醛(pH 7.4)中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡檢。

1.3.5 Western blot檢測大鼠心臟組織中AKT、p-AKT及caspase蛋白的表達

冰凍組織按總蛋白提取試劑盒說明書提取各組心肌組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，調(diào)整每條泳道的上樣量，進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉膜至PVDF膜上，封閉液封閉1 h后，Western blot一抗稀釋液稀釋，各一抗稀釋濃度AKT(1∶1000)、P-AKT(1∶1000)，caspase-9(1∶2000)、caspase-3(1∶2000)、cleaved-caspase3(1∶2000)、BAX(1∶2000)、BCL-2(1∶200)。4℃孵育過夜，次日用Western blot二抗稀釋液稀釋二抗，室溫孵育搖床1 h，滴加Ecl發(fā)光工作液，化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 TRX對THP誘導大鼠急性心肌毒性心臟系數(shù)的影響

實驗結束后，取各組大鼠心臟并稱重，計算其心臟系數(shù)。圖1顯示，THP、DZR及TL組大鼠的心臟系數(shù)顯著高于CON組(P<0.05)；TM、TH組大鼠的心臟系數(shù)顯著低于THP組，且TH組效果最為明顯(P<0.05)。

2.2 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠心功能的影響

大鼠心功能結果顯示，THP組大鼠的LVSP、±dp/dtmax明顯低于CON組，LVEDP顯著高于CON組(P<0.05)。與THP組相比，TM、TH及DZR組大鼠LVEDP降低，LVSP、±dp/dtmax明顯升高(P<0.05)，且TH組大鼠改善效果最好。見表1。

注：與CON組比較，*P<0.05;與THP組比較，#P<0.05;與DZR+THP組比較，△P <0.05。圖1 TRX對THP誘導大鼠急性心肌毒性CWI的影響Note. Compared with the CON group, *P <0.05. Compared with the THP group, #P<0.05. Compared with the DZR+THP group,ΔP <0.05.Figure 1 CWI after application of troxerutin on THP-induced acute myocardial toxicity in rats

表1 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠心功能的影響Table 1 Effect of TRX on cardiac function in the THP-induced acute myocardial toxicity rat model

注：與正常組比較，*P<0.05;與吡柔比星組比較，#P<0.05;與右丙亞胺+吡柔比星組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the CON group,*P<0.05. Compared with the THP group,#P<0.05. Compared with the DZR+THP group,ΔP<0.05.

2.3 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠心電的影響

給藥后72 h，測標準肢體Ⅱ導聯(lián)心電15 min，利用BL-420F生物信號系統(tǒng)監(jiān)測各組心率(HR)、QT間期及QRS波群電壓變化情況。與CON組相比，THP組大鼠QT間期延長及QRS波群電壓顯著降低(P<0.05)，心率減弱(P<0.05)；與THP組相比，DZR組、TRX各組大鼠心率顯著增加，其中，TM和TH組的QRS波群電壓增加顯著，Q-T間期縮短(P<0.05)，尤以TH組改善效果為明顯。見表2。

2.4 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠心肌酶活性的影響

實驗結束后，分離血清并按照試劑盒說明書方法檢測血清中LDH、CK-MB、cTn-T和BNP水平，結果顯示，THP組大鼠血清中LDH、CK-MB、cTn-T和BNP水平顯著高于CON組(P<0.05)。與THP組相比，DZR組、TM和TH可顯著降低LDH、CK-MB、cTn-T、BNP水平(P<0.05)；TL可顯著降低cTn-T、BNP的水平(P<0.05)；與DZR組相比，TH可顯著降低cTn-T和CK-MB水平(P<0.05)；TL組和TM組均顯著降低cTn-T(P<0.05)。TM和TH組改善心肌酶含量的效果最佳。見表3。

2.5 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠的SOD、MDA含量影響

大鼠取血后，分離血清并按照試劑盒說明書方法檢測血清中 SOD 和MDA 的含量，結果顯示，與CON組相比，THP 組大鼠血清中 SOD 的活性出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，MDA 的含量出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)。與THP組相比，DZR組、TRX各劑量組均可顯著升高SOD水平(P<0.05)，降低MDA水平(P<0.05)。其中，TM和TH組改善SOD、MDA的水平效果最佳。見表4。

表2 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠心電的影響Table 2 Effect of troxerutin on electrocardiogram of the rats with THP-induced acute myocardial toxicity

注：與正常組比較，*P<0.05;與吡柔比星組比較，#P<0.05;與右丙亞胺+吡柔比星組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the CON group,*P<0.05. Compared with the THP group,#P<0.05. Compared with the DZR+THP group,ΔP<0.05.

表3 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠心肌酶活性的影響Table 3 Effects of troxerutin on the levels of LDH, CK-MB, cTn-T and BNP in the THP-induced acute myocardial toxicity rat model

注：與正常組比較，*P<0.05;與吡柔比星組比較，#P<0.05;與右丙亞胺+吡柔比星組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the CON group,*P<0.05. Compared with the THP group,#P<0.05. Compared with the DZR+THP group,ΔP<0.05.

表4 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠的SOD、MDA含量影響Table 4 Effects of troxerutin on the levels of SOD and MDA in the THP-induced acute myocardial toxicity rat model

注：與正常組比較，*P<0.05;與吡柔比星組比較，#P<0.05;與右丙亞胺+吡柔比星組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the CON group,*P<0.05. Compared with the THP group,#P<0.05. Compared with the DZR+THP group,ΔP<0.05.

2.6 TRX對THP誘導的急性心肌毒性大鼠的心肌組織病理學改變

CON組心肌纖維排列整齊，心肌細胞無萎縮或肥大；THP組大鼠出現(xiàn)不同程度的心肌細胞肥大、壞死，間質膠原結締組織增生，心肌纖維扭曲、斷裂、橫紋模糊。DZR組心肌纖維排列較為整齊；間質內(nèi)偶見少量膠原纖維增生胞漿，心肌纖維排列較為整齊。TM和TH組排列較為整齊，質內(nèi)偶見少量膠原纖維增生胞漿，部分心肌細胞出現(xiàn)萎縮，心肌纖維扭曲程度，斷裂程度較小。見圖2。

2.7 TRX對THP誘導大鼠急性心肌毒性心肌組織相關蛋白水平表達的影響

通過對上述實驗結果分析，曲克蘆丁中、高劑量組改善THP所致的心肌毒性程度最佳，因此，選擇CON、THP、DZR+THP、TM+THP、TH+THP等5組進行蛋白免疫印跡(Western blot)。

結果分析表明，THP激活AKT磷酸化水平較低，同時，caspase-9、caspase-3、BCL-2的表達水平降低，并上調(diào)cleaved caspase-3、BAX蛋白的表達。加入TRX作用后，AKT磷酸化水平升高，caspase-9、caspase-3、BCL-2的含量升高，下調(diào)cleaved caspase-3、BAX等蛋白表達量。見圖3。

圖2 TRX對THP誘導心肌毒性大鼠的心肌組織的作用(HE染色，×200)Figure 2 Effect of troxerutin on the THP-induced acute myocardial toxicity in the rats

3 討論

吡柔比星所致的急性大鼠心肌毒性通常表現(xiàn)為:(1)血流動力學異常：LVSP、±dp/dtmax偏低，LVEDP偏高；(2)心肌出現(xiàn)不同程度的心肌細胞肥大、壞死，間質膠原結締組織增生，心肌纖維扭曲、斷裂、橫紋模糊；(3)血清中LDH、CK-MB、cTn-T、BNP心肌酶含量升高。蘆丁對THP所致大鼠的血流動力學指標、心電、心肌組織病理學形態(tài)異常指標有所改善，本實驗室以往研究發(fā)現(xiàn)蘆丁逆轉THP所致的急性大鼠心肌毒性[13]。同時，已有相關文獻說明TRX具有相似的保護作用。Shu等[14]用150 mg/kg TRX預處理，大鼠心肌缺血/再灌注模型。與模型組相比，TRX預處理使大鼠的LVEDP顯著降低，LVSP、±dp/dtmax顯著升高。TRX預處理顯著降低心肌梗塞面積，改善心臟功能，并降低肌酸激酶(CK)，天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平。本研究觀察TRX高劑量對THP所致大鼠的心臟系數(shù)、LVEDP、LVSP、±dp/dtmax、心電、心肌組織病理學形態(tài)等指標有所改善；另外，TRX降低THP所致大鼠血清中的cTn-T，CK-MB，BNP，LDH等相關心肌酶含量。提示TRX可改善THP所致的急性大鼠心肌毒性程度。

SOD具有清除體內(nèi)自由基的作用，降低機體的脂質過氧化反應，對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用[15]。MDA為氧自由基氧化細胞膜上磷脂形成的脂質過氧化物的穩(wěn)定存在形式，其含量變化可反映機體內(nèi)脂質過氧化程度[16]。SOD和MDA含量異常，也是THP所致的急性大鼠心肌毒性重要指標[13]。Yu等[17]發(fā)現(xiàn)TRX可減少代謝綜合征小鼠模型(MS)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，增強抗氧化能力。本研究結果顯示，TRX能明顯降低THP所致大鼠血清中MDA含量、提高SOD活力。提示，TRX對THP所致的急性大鼠心肌毒性，可能與降低脂質過氧化物水平，提高機體抗氧化能力有關。

圖4 曲克蘆丁對吡柔比星所致大鼠急性心肌毒性的保護作用機制示意圖Figure 4 Schematic diagram of the protective mechanism of troxerutin against acute myocardial toxicity induced by pirarubicin in rats

AKT具有調(diào)控細胞存活、生長、增殖等多種生物學進程作用，是多種細胞信號轉導的核心因子[18-19]。Caspase家族是細胞凋亡重要的調(diào)控因子[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)AKT與caspase家族之間存在著密切關系。Shu等[14]用150 mg/kg TRX預處理激活Akt磷酸化，降低BAX、caspase-3(激活型)蛋白的表達，從而改善心肌缺血/再灌注的心肌損傷程度。Yu等[21]發(fā)現(xiàn)心臟休克波治療(CSWT)激活AKT磷酸化，抑制細胞凋亡因子，從而改善慢性心肌缺血的豬模型中的心肌灌注、心臟功能、嚴重冠狀動脈疾病(CAD)患者的心肌缺血，又可逆轉缺血/缺氧(I / H)誘導的心肌細胞凋亡。醛脫氫酶是一類以多種醛類為底物的酶類，醛脫氫酶除了具有催化作用之外還具有很多其它重要的生理功能，Yu等[22]發(fā)現(xiàn)醛脫氫酶2(ALDH2)蛋白的表達水平升高時，可激活AKT的磷酸化，上調(diào)BCL-2蛋白表達量，下調(diào)cleaved caspase-3、BAX蛋白表達量，參與遠程缺血后處理(RIPostC)過程，改善心肌缺血/再灌注后的心肌損傷程度；Luo 等[23]發(fā)現(xiàn)10 g/kg播娘蒿可依賴的上調(diào)AKT磷酸化、BCL-2蛋白表達量，下調(diào)BAX、cleaved caspase-3蛋白表達，從而改善腎上腹主動脈縮窄手術后大鼠心肌纖維化和損傷程度；Huang等[24]觀察到丹參和川芎嗪注射液，依賴于激活AKT磷酸化、上調(diào)一氧化氮合酶eNOS蛋白表達量及BCL-2 / BAX比例，下調(diào)cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達水平，實現(xiàn)其改善心肌缺血/再灌注的心肌受損程度。Wang等[25]通過體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3(GSRg3)可上調(diào)pAKT、eNOS蛋白表達量及BCL-2 /BAX、pro-caspase-3、pro-caspase-9比例，下調(diào)cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達，從而改善心肌損傷程度。Xu[26]采用計算機藥物設計，已確定TRX和AKT之間具有極好的相關性。TRX通過抑制PTEN的激活以激活AKT磷酸化，從而阻止JNK的活化以保護細胞。

本研究結果顯示，TRX通過激活AKT磷酸化，上調(diào)凋亡蛋白caspase-9、caspase-3、BCL-2，下調(diào)cleaved caspase-3、BAX等蛋白的表達。TRX對THP所致心肌毒性的保護作用可能是通過激活AKT，并抑制Caspase的表達完成。

本研究采用吡柔比星復制大鼠急性心肌毒性模型[13]，實驗結果表明，TRX對THP所致大鼠的心臟系數(shù)、LVEDP、LVSP、±dp/dtmax、心電、心肌組織病理學形態(tài)等指標均有所改善；TRX降低THP所致大鼠血清中的cTn-T，CK-MB，BNP，LDH等心肌酶含量；TRX可升高THP所致大鼠血清中SOD水平以及降低其MDA水平，降低脂質過氧化物水平，提高機體抗氧化能力；TRX可能通過激活AKT磷酸化，上調(diào)caspase-9、caspase-3、BCL-2，下調(diào)cleaved caspase-3、BAX等蛋白的表達。根據(jù)上述，實驗可繪制TRX的保護THP所致心肌毒性分子機制(如圖4)。因此，TRX逆轉THP所致心肌毒性作用可能通過激活AKT，抑制Caspase的表達完成。