吡柔比星脂質(zhì)體制備與表征及其體外抗腫瘤作用

王學(xué)菊　程少會　高立明　鄭　磊　邸　婭　付占昭　姜　麗　徐紅梅　王麗萍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院病理科，吉林　長春　130033)

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吡柔比星脂質(zhì)體制備與表征及其體外抗腫瘤作用

王學(xué)菊程少會1高立明1鄭磊1邸婭1付占昭1姜麗1徐紅梅1王麗萍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院病理科，吉林長春130033)

目的構(gòu)建吡柔比星脂質(zhì)體，提高吡柔比星的生物利用度和抑瘤作用，降低其毒副作用。方法采用薄膜水化法制備吡柔比星脂質(zhì)體，并測定其包封率和物理性狀。構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞U14的荷瘤裸鼠模型，分別尾靜脈注射吡柔比星裸藥及吡柔比星脂質(zhì)體，分析其抑瘤作用。結(jié)果薄膜水化法制備的吡柔比星脂質(zhì)體平均粒徑(140.9±2.36)nm，多分散系數(shù)為(0.203±0.01)，Zeta電位為-(14.2±2.64)mV，包封率為(75.1±3.5)%，并且可以緩釋吡柔比星；吡柔比星脂質(zhì)體組抑瘤率(75.1±8.6)%高于吡柔比星裸藥組(64.9±12.2)%。結(jié)論吡柔比星脂質(zhì)體是很有潛力的抗腫瘤納米藥物。

吡柔比星;脂質(zhì)體;包封率；薄膜水化法；抑瘤率

脂質(zhì)體作為藥物載體，具有靶向性、降低藥物毒性、減少藥物劑量等優(yōu)點，因此脂質(zhì)體作為藥物載體被重視并得到了廣泛應(yīng)用〔1～3〕。脂質(zhì)體作為抗癌藥物載體能增加與癌細(xì)胞的親和力，且能夠增加藥物被癌細(xì)胞的攝取量，克服耐藥性，降低用藥量，提高療效，降低毒副作用。由于脂質(zhì)體的功能不同，脂質(zhì)體可分為傳統(tǒng)脂質(zhì)體、隱身脂質(zhì)體、長循環(huán)脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體等〔4〕。目前制備脂質(zhì)體常規(guī)的方法有薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、表面活性劑除去法、乙醇注入法、乳化法以及pH梯度法、硫酸銨梯度法等〔5〕。吡柔比星主要用于治療的惡性腫瘤包括白血病、乳腺癌、子宮癌、卵巢癌和肺癌等〔6〕。吡柔比星為紅色無臭粉末，其油水分配系數(shù)Log P為4.102(參考值)，脂溶性好，能溶于乙醇和甲醇等溶劑，但其有累積性心臟毒性〔7〕、骨髓抑制、嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)毒副作用〔8〕。本文采用薄膜水化法制備吡柔比星脂質(zhì)體，降低吡柔比星的毒副作用并提高通過其生物利用度，測定吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑、多分散系數(shù)、Zeta電位、包封率、釋放曲線，構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞U14的荷瘤裸鼠模型，研究吡柔比星脂質(zhì)體對實體瘤的腫瘤抑制率。

1　材料與方法

1.1材料及儀器吡柔比星(Sigma-Aldrich試劑公司)，大豆卵磷脂、膽固醇(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)，二氯甲烷、甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

恒溫水浴鍋(杭州迅數(shù)科技有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)、透射電鏡(JEOL JEM-1230)、超聲波清洗儀(日本島津)、紫外-可見吸收光譜儀(Agilent 8453)、馬爾文粒度分析儀(ZEN3600，Malvern Instruments Ltd，UK)。昆明小鼠50只，SPF級，均為雌性，體重(18±2)g。U14宮頸癌細(xì)胞株(北京聯(lián)合利華生物技術(shù)有限公司)。

1.2吡柔比星脂質(zhì)體的制備將一定量的大豆卵磷脂、吡柔比星和膽固醇溶于6 ml的甲醇-氯仿溶液中(氯仿與甲醇的體積比為2∶1)。在40℃，抽真空下除去有機(jī)溶劑，通氮氣5 min以除去殘留的有機(jī)溶劑.將10 ml磷酸緩沖液(pH7.4)加入茄型瓶中水化15 min，超聲15 min，經(jīng)0.45 μm和0.22 μm濾膜過濾制得吡柔比星脂質(zhì)體。

1.3吡柔比星脂質(zhì)體的形態(tài)通過透射電子顯微鏡觀察脂質(zhì)體形貌。將一滴脂質(zhì)體滴加到銅網(wǎng)上，2 min后使用濾紙將銅網(wǎng)表面液體小心吸走。待銅網(wǎng)風(fēng)干后使用2%的鉬酸銨對其進(jìn)行負(fù)染并在風(fēng)干后在透射電鏡下觀察。

1.4吡柔比星脂質(zhì)體粒徑測定、多分散系數(shù)和Zeta電位測定取脂質(zhì)體少量，適量蒸餾水稀釋后，激光粒度分析儀測定吡柔比星脂質(zhì)體的平均粒徑及粒度分布、多分散系數(shù)和Zeta電位。

1.5吡柔比星脂質(zhì)體包封率的測定采用超濾離心法測定吡柔比星脂質(zhì)體的包封率。取吡柔比星脂質(zhì)體2 ml，4 000 r/min離心30 min，收集下清液，紫外分光光度計分析下清液中吡柔比星含量(M游離)。脂質(zhì)體溶液中吡柔比星總質(zhì)量M總計算包封率：EE=(M總-M游離)/M總×100%。

1.6吡柔比星脂質(zhì)體釋放曲線的測定取2 ml吡柔比星脂質(zhì)體置入透析袋中，放入50 ml一次性離心管中；加入釋放介質(zhì)(PBS，pH7.4)30 ml，于37℃、110 r/min恒溫振蕩。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、16、24和40 h取樣2 ml(同時補充等溫等量釋放介質(zhì))，用紫外分光光度計于495 nm測定波長處測定吡柔比星的含量。

1.7荷宮頸癌U14小鼠模型的建立昆明小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18℃～25℃，空氣濕度40%～60%，晝夜節(jié)律。墊料、籠具、飲水等高壓蒸汽滅菌處理，小鼠飼料為SPF級專用高壓滅菌飼料，更換墊料和籠具等操作在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。用生理鹽水稀釋U14宮頸癌細(xì)胞株到適宜的濃度(1×107個/ml)，在每只小鼠的左前肢腋下注射，0.2 ml/只。

1.8小鼠分組將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只：①空白對照組：正常飼養(yǎng)，不予尾部靜脈注射；②陰性對照組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml生理鹽水給藥；③陽性對照組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml環(huán)磷酰胺溶液給藥；④吡柔比星脂質(zhì)體組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml吡柔比星脂質(zhì)體溶液給藥；⑤吡柔比星裸藥組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml吡柔比星裸藥溶液給藥。

1.9抑瘤率測定第14天處死小鼠后，取腫瘤組織，稱取其質(zhì)量，計算抑瘤率：抑瘤率=(1-給藥組瘤質(zhì)量/陰性對照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

2　結(jié)　果

2.1吡柔比星脂質(zhì)體的形貌吡柔比星脂質(zhì)體呈現(xiàn)一定的球狀形貌，視野內(nèi)脂質(zhì)體分布均勻，粒徑均一且圓整，粒徑約為140 nm。見圖1。

圖1　吡柔比星脂質(zhì)體(TEM)

2.2吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑吡柔比星脂質(zhì)體的平均粒徑為(140.9±2.36)nm，與透射電鏡下觀察的粒徑一致，其多分散系數(shù)為0.203±0.01。吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑分布呈正態(tài)分布，多分散系數(shù)表明粒徑分布比較集中，且達(dá)到了納米藥物的要求。因為腫瘤細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞間距大致在100～200 nm，而正常組織間距在50 nm左右。納米藥物最適宜的粒徑應(yīng)該在100～200 nm，這樣藥物更容易進(jìn)入腫瘤組織而不易進(jìn)入正常的組織間，從而發(fā)揮作用。

2.3吡柔比星脂質(zhì)體的Zeta電位吡柔比星脂質(zhì)體的Zeta電位在(-14.2±2.64)mV，表明脂質(zhì)體具有一定的穩(wěn)定性，可以長時間保存而不發(fā)生聚沉現(xiàn)象。

2.4吡柔比星脂質(zhì)體的包封率用紫外分光光度計測在495 nm波長處測定吡柔比星濃度分別為5、10、15、20、30和40 μg/ml溶液的吸光度，吡柔比星的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.015 8x+0.061 4，R2=0.998 8。通過包封率計算公式可以計算得包封率為(75.1±3.5)%。

2.5吡柔比星釋放曲線如圖2所示，吡柔比星裸藥快速釋放且在第4小時處完全釋放，而吡柔比星脂質(zhì)體前期釋放速度較快且逐漸變緩，吡柔比星脂質(zhì)體相比于吡柔比星裸藥具有一定的緩釋性。吡柔比星脂質(zhì)體可以緩釋吡柔比星，從而延長其在體內(nèi)的保留時間，提高其藥效。

圖2　吡柔比星裸藥與吡柔比星脂質(zhì)體釋放曲線

2.6吡柔比星脂質(zhì)體對U14荷瘤小鼠腫瘤抑制作用吡柔比星脂質(zhì)體的抑瘤率可以達(dá)到(75.1±8.6)%，而吡柔比星裸藥的抑瘤率為(64.9±12.2)%，說明吡柔比星可以抑制腫瘤的生長，而吡柔比星脂質(zhì)體對腫瘤具有更好的抑制作用。吡柔比星脂質(zhì)體可以提高吡柔比星的水溶性，其磷脂層可以介導(dǎo)藥物通過細(xì)胞膜。此外，吡柔比星脂質(zhì)體的增加滯留和滲透(EPR)效應(yīng)可以使藥物的被動靶向到腫瘤組織。并且，吡柔比星脂質(zhì)體可以緩釋藥物，從而提高藥物的生物利用度。

3　討　論

本文以薄膜水化法制備吡柔比星脂質(zhì)體，薄膜水化法適用于脂溶性藥物脂質(zhì)體的制備，制備出的吡柔比星脂質(zhì)體呈紅色混懸體系。透射電鏡下觀察吡柔比星脂質(zhì)體的形貌，吡柔比星脂質(zhì)體圓整且粒徑均一，并且分散均勻，與粒徑的分散系數(shù)測定結(jié)果一致。吡柔比星脂質(zhì)體電位為-10.8 mV，可以是脂質(zhì)體保持穩(wěn)定，不產(chǎn)生絮凝。吡柔比星脂質(zhì)體可以緩釋吡柔比星，延長其在體內(nèi)時間。吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑可以使其通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織。體外實驗吡柔比星脂質(zhì)體組抑瘤率高于吡柔比星裸藥組，證明了吡柔比星脂質(zhì)體是很有潛力的抗腫瘤藥物。

1Luo LM，Huang Y，Zhao BX，etal.Anti-tumor and anti-an-angiogenic effect of metronomic cyclic NGR-raodified liposomes containing paclitaxe〔J〕.Erials，2013；34(4)：1102-14.

2Alhariri M，Azghani A，Omri A.Liposomal antibiotics for the treatment of infectious diseases〔J〕.Exp Opin Drug Del，2013；10(11)：1515-32.

3Sun HY，Cacciarelli TV，Singh N.Micafungin versus amphotericin B lipid complex for the prevention of invasive fungal infections in high-risk liver transplant recipients〔J〕.Transplantation，2013；96(6)：573-8.

4Yogita PP，Sameer J.Novel methods for liposome preparation〔J〕.Chem Phys Lipids，2014；177：8-18.

5王瑞蓮，劉成梅，劉偉.脂質(zhì)體制備方法的研究進(jìn)展〔J〕.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2007；109(7)：8-14.

6Fujiwara A，Hoshino T，Westley JW.Anthracycline antibiotics〔J〕.Crit Rev Biotechnol,1985；3(2)：133.

7呂俊，丁念，朱家薔，等.蕙環(huán)類藥物心臟毒性及其預(yù)防的研究進(jìn)展〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008；28(15)：1302-6.

8賈彥熹，賈英杰，趙成，等.吡柔比星聯(lián)合化療治療晚期腫瘤37例臨床觀察〔J〕.腫瘤研究與臨床，2005；17(1)：59-60.

〔2016-07-14修回〕

(編輯曲莉)

吉林大學(xué)橫向課題(2014220101000363)

王麗萍(1963-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。

王學(xué)菊(1978-)，女，主治醫(yī)師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2016)17-4174-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.017

1秦皇島市第一醫(yī)院