乙二醛酶1在疾病中表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

李 虹，李赫健，樊 奔，張文生,3

(北京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)部1. 中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2. 天然藥物教育部工程研究中心，北京 100875；3. 三七資源保護(hù)與利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650000)

甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)是一種活性羰基化合物，主要通過糖酵解過程中磷酸二羥丙酮(dihydroxyactone phosphat，DHAP)和甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate，G3P)的中間體，經(jīng)非酶催化過程而產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物。MG能夠與DNA的瞇基殘基端發(fā)生反應(yīng)，對其進(jìn)行修飾，從而使DNA雙鏈斷裂、形成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物等，抑制DNA及RNA的合成，與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)，造成細(xì)胞凋亡和炎癥等細(xì)胞毒性和組織損傷[1-2]。1913年，Neuberg[3]發(fā)現(xiàn)乙二醛酶系催化MG轉(zhuǎn)化為無毒的D-乳酸。Racker[4]于1951年揭示了乙二醛酶系統(tǒng)主要由乙二醛酶1(glyoxalsse 1，Glo 1)和乙二醛酶2(glyoxalsse 2，Glo 2)兩個連續(xù)的催化步驟，其中Glo 1是該系統(tǒng)中的限速酶。之后，針對Glo 1的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及在相關(guān)疾病中表達(dá)變化越來越引起人們的關(guān)注。本文總結(jié)近年Glo 1在不同疾病中分子調(diào)控機(jī)制的有關(guān)文獻(xiàn)，以期為深入研究Glo 1在疾病中的作用提供參考。

1 Glo 1基因的分子結(jié)構(gòu)和遺傳特征

人類Glo 1基因位于6號染色體上，介于著絲粒和人類白細(xì)胞抗原DR(human leukocyte antigen DR，HLA-DR)之間，全長27 252 bp，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生2 071 bp的mRNA，編碼184個氨基酸。人類Glo 1是由1個雙等位基因所編碼的兩個結(jié)構(gòu)相似的亞基GLO 1-A和GLO 1-E組成的二聚體，兩個亞基的主要區(qū)別在于第111位氨基酸——GLO 1-A為丙氨酸，而GLO 1-E為谷氨酸。Glo 1等位基因是以一種簡單的共顯性方式遺傳的，在所有組織中都有典型的表型表達(dá)。Glo 1主要包含3種等位基因酶：GLO 1-1、GLO 1-2和GLO 2-2。所有的等位基因酶相對分子質(zhì)量均為46 ku(凝膠過濾)或42 ku(序列)，等電點(diǎn)(pI)為4.8～5.1，但它們每一種具有獨(dú)特的電荷密度和分子形狀[5]。通過氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)不同物種間Glo 1具有較高的同源性，這說明Glo 1基因在進(jìn)化上具有高度的保守性(Tab 1)。

2 在疾病中Glo 1拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)

CNV也稱為拷貝數(shù)多態(tài)性，是個體之間基因組序列上>50 bp片段的插入、缺失、重復(fù)和復(fù)雜多位點(diǎn)的變異[6]。2004年，Redon等[7]對來自歐洲、非洲或亞洲的270名受試者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Glo 1基因具有122 kb的CNV，其中具有Glo 1 CNV的人數(shù)占總?cè)藬?shù)的2%。隨后發(fā)現(xiàn)其他靈長類動物中也存在Glo 1 CNV。小鼠Glo 1 CNV在近交系小鼠中發(fā)現(xiàn)，是一段長達(dá)475 kb串聯(lián)重復(fù)序列。Glo 1在人類和小鼠基因組中存在功能性CNV的位點(diǎn)，使Glo 1表達(dá)增加2-4倍。

2.1 在癌癥中Glo 1 CNV近期研究表明，人腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Glo 1 CNV，Glo 1拷貝數(shù)增加是癌癥中Glo1表達(dá)增加的主要原因之一。對520種人類腫瘤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大約有8%的腫瘤中Glo 1基因拷貝數(shù)增加，其中最高的是乳腺癌(19%)、小細(xì)胞肺癌(16%)和非小細(xì)胞肺癌(11%)(Tab 2)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，Glo 1的表達(dá)增加與癌癥化學(xué)療法中的多重耐藥性(multi-drug resistance，MDR)相關(guān)，推測Glo 1基因拷貝數(shù)增加可能發(fā)生在腫瘤發(fā)展的早期階段，并且導(dǎo)致Glo 1蛋白表達(dá)和活性增加，MG含量減少。在臨床中，在低流行率(6%)的臨床肝癌中發(fā)現(xiàn)Glo 1拷貝數(shù)增加，在更高的肝癌患病率(48%)中發(fā)現(xiàn)Glo 1表達(dá)增加，而具有Glo 1拷貝數(shù)增加的所有肝癌患者均高表達(dá)Glo 1[6]。

Tab 1 Comparison of amino acid homology of Glo 1 between species

Tab 2 Glo 1 expression in human cancer and normal tissues

ND represents no change.

2.2 在焦慮癥中Glo 1 CNVWilliams等[9]發(fā)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室小鼠品系中的Glo 1 CNV，并與小鼠焦慮樣行為相關(guān)。Cahan等[10]利用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步探索了Glo1 CNV與焦慮表型的關(guān)聯(lián)，在Glo1過表達(dá)2、4和5倍的模型中，過表達(dá)4倍和5倍的小鼠表現(xiàn)出焦慮表型。此外，Glo1 拷貝數(shù)增加的BAC Tg小鼠較正常小鼠易出現(xiàn)焦慮樣行為，原因或許與MG過度減少有關(guān)。MG是一種內(nèi)源性γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)受體激動劑，激活突觸GABAA受體，調(diào)節(jié)階段抑制信號。Glo1拷貝數(shù)增加導(dǎo)致Glo1表達(dá)和活性增加，清除MG，從而減少GABAA受體的激動，導(dǎo)致焦慮癥[11]。

3 在疾病中Glo 1單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)

SNP是指在基因組水平上，一種常見的單個核苷酸的突變所引起的多態(tài)性變化，主要有單個堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，也可由堿基的插入或缺失造成，Glo 1基因存在多達(dá)70個SNP[12]。近年來，針對Glo 1 SNP與各種疾病(如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、糖尿病等)的關(guān)系越來越受到關(guān)注。

3.1 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中Glo 1 SNPBarua等[13]采用蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，Glo 1 rs2736654位點(diǎn)SNP與自閉癥密切相關(guān)。AA基因型自閉癥患者類淋巴母細(xì)胞中的Glo1活性比CC基因型細(xì)胞中Glo1活性明顯降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)C突變?yōu)锳，導(dǎo)致Ala突變?yōu)镚lu，從而改變了Glo 1基因結(jié)構(gòu)與功能，致使Glo 1酶活性降低。Arai等[14]利用精神分裂癥患者和正常人外周血提取DNA，對Glo 1基因進(jìn)行重測序，發(fā)現(xiàn)2個雜合子框移突變，其中一個框移突變是位于第1個外顯子97核苷酸插入1個腺嘌呤堿基，這一插入突變改變了酶的一級結(jié)構(gòu)；另一個框移突變是位于第4個外顯子365核苷酸刪除了1個胞嘧啶堿基，改變了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。這些框移突變使Glo 1酶表達(dá)和酶活性下降了40%～50%。此外，rsl781735和rsl049346也與精神分裂癥易感性相關(guān)，連鎖不平衡分析中發(fā)現(xiàn)這兩個位點(diǎn)位于Glo 1啟動子區(qū)域，并且是完全連鎖。rsl781735和rsl049346突變致使Glo 1啟動子活性下降，進(jìn)而使Glo 1 mRNA以及Glo 1酶表達(dá)和活性降低[15]。

3.2 在癌癥中Glo 1 SNP在113名乳腺癌患者和58名健康者中，Germanová等[16]研究發(fā)現(xiàn)，rs2736654位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有明顯的相關(guān)性。C等位基因增加乳腺癌發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險，C等位基因頻率和CC基因型頻率在乳腺癌患者中較高，在乳腺癌晚期階段的頻率也明顯升高。CC型基因型攜帶者Glo 1表達(dá)量和酶活性升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與雌激素陽性乳腺癌比較，C等位基因在雌激素陰性乳腺癌的頻率更高，以及在雌激素受體陰性的患者中CC基因型頻率更高，Glo 1表達(dá)量和酶活性明顯更高。

3.3 在糖尿病中Glo 1 SNPGroener等[17]選取209名1型糖尿病患者和524名2型糖尿病患者，針對Glo 1 rs2736654位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)在1型糖尿病中，AA基因型頻率的患病率明顯較高，但基因型與糖尿病性視網(wǎng)膜病、腎病或神經(jīng)病變均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。相比之下，CC基因型在2型糖尿病患者中基因型頻率較高，并且與糖尿病神經(jīng)病變的患病率明顯相關(guān)，而與糖尿病腎病或視網(wǎng)膜病變無關(guān)，其原因值得深入研究。

4 轉(zhuǎn)錄因子對Glo 1的調(diào)控

Fig 1 Schematic diagram of transcription factor binding site of Glo 1 gene promoter region

在Glo 1基因啟動子區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括抗氧化應(yīng)答元件(antioxidant response-element，ARE)、胰島素應(yīng)答元件(insulin-response element，IRE)、金屬應(yīng)答元件(metal-response element，MRE)、負(fù)調(diào)節(jié)元件(negative regulatory element，NRE)和糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(glucocorticoid response element，GRE)、特異性蛋白1(specificity protein 1，SP1)、核因子κB(nuclear factor κappa B，NF-κB)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein，C/EBP)和激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)等[5](Fig 1)。

4.1 在癌癥中轉(zhuǎn)錄因子對Glo 1的調(diào)控ARE位于Glo 1基因第1個外顯子的5’-UTR區(qū)域，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)時，核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)被激活進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與ARE應(yīng)答元件結(jié)合，從而調(diào)控Glo 1的轉(zhuǎn)錄[18]。在癌細(xì)胞中Nrf2表達(dá)增加，導(dǎo)致Glo 1基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。肝癌中Nrf2表達(dá)增加的高患病率與生存率降低有明顯相關(guān)性，可能也與Glo 1介導(dǎo)的MDR有關(guān)。用Nrf2激活劑鼠草酸預(yù)處理SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，可減少M(fèi)G及其衍生物晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)形成。同時，鼠尾草酸還誘導(dǎo)了乙二醛酶系中谷胱甘肽(glutathione，GSH)的表達(dá)，這可能有利于形成D-乳酸，從而使MG在這些細(xì)胞中得以清除[19]。炎癥中激活的NF-κB與Nrf2不同，能下調(diào)Glo1的表達(dá)。此外，AP-1/2和SP1位點(diǎn)位于Glo1基因最小啟動子區(qū)域(-40～-182 bp)，在癌細(xì)胞中兩者缺失可導(dǎo)致啟動子活性的完全喪失。用100 g·L-1的胰島素處理HepG2細(xì)胞后，Glo 1基因的啟動子活性上升了2倍，說明胰島素可能通過IRE來調(diào)控Glo1的表達(dá)。25、75 μmol·L-1ZnCl2處理HepG2細(xì)胞48 h后，Glo 1基因的啟動子活性上升了2倍，表明該序列中的MRE對Glo 1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[20]。

5 非編碼RNA對Glo 1的調(diào)控

人類基因組計劃揭示人基因組中有30億個堿基對，其中1.5%能夠編碼蛋白質(zhì)，98.5%是非蛋白質(zhì)編碼基因，這些基因序列一度被認(rèn)為是垃圾基因。但隨后的“DNA元件百科全書(encyclopedia of DNA elements，ENCODE)”計劃表明，大約75%的人類基因組能被轉(zhuǎn)錄成RNAs，其中74%是非蛋白編碼RNA(non-coding RNA，ncRNAs)。目前，ncRNA研究領(lǐng)域主要包含微小RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。近年研究證明，ncRNAs在許多生命活動過程中扮演著重要角色[21]。

5.1 癌癥中miRNA對Glo 1的調(diào)控miRNA是存在于真核生物及病毒中的一類長約19～25 nt短序列的內(nèi)源性非編碼RNA，在各物種間具有高度的保守性。miRNAs通過抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNA，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來參與調(diào)控一系列生命活動，包括細(xì)胞增殖、生長發(fā)育、器官形成、造血、凋亡、腫瘤的發(fā)生。在哺乳動物中，大約有50% mRNA的翻譯由miRNA調(diào)控[22]。近些年，隨著科學(xué)研究的進(jìn)展，大量的miRNA已經(jīng)被鑒定出來，截至目前，發(fā)現(xiàn)人的成熟miRNA有2 693條，小鼠的有2 013條，秀麗隱桿線蟲的有267條。研究發(fā)現(xiàn)，miR-137直接靶向Glo 1 3′-UTR。過表達(dá)miR-137可以降低黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)源性Glo 1 mRNA和蛋白表達(dá)，而miR-137抑制劑上調(diào)Ma-Mel-79b和Ma-Mel-86b細(xì)胞中Glo 1 mRNA的表達(dá)，抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，表明Glo 1可能是黑色素瘤的潛在治療靶點(diǎn)[23]。

5.2 阿爾茨海默病中l(wèi)ncRNA對Glo1的調(diào)控lncRNA是一類長度大于200 nt的ncRNA，廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中。lncRNA生物學(xué)功能多樣，主要表現(xiàn)在表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控3個方面，參與各種疾病發(fā)生、發(fā)展[24]。Zhang等[25]運(yùn)用lncRNA-seq對快速老化小鼠SAMP8和對照小鼠SAMR1腦lncRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有7條lncRNA調(diào)控Glo 1，但其調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。

6 總結(jié)與展望

MG是含有2個羰基的有毒化合物，隨著糖酵解過程產(chǎn)生，經(jīng)過乙二醛酶系統(tǒng)代謝為無毒的D-乳酸而排除體外。但在糖酵解異常的病理狀態(tài)下，體內(nèi)Glo 1表達(dá)異常，造成MG積累量異常。MG的累積與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。癌細(xì)胞為了存活和分裂，利用Warburg效應(yīng)來產(chǎn)生大量的ATP，導(dǎo)致MG的大量產(chǎn)生，從而需要高速率的乙二醛酶系進(jìn)行清除[26]。在多種類型的腫瘤中，Glo 1通過CNV或者利用轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，導(dǎo)致Glo 1表達(dá)和活性明顯升高。在人類晶狀體和大腦中，MG積累量隨著年齡的增長而升高，而Glo 1的表達(dá)和活性隨著年齡的增長而降低[27]。此外，在阿爾茨海默病的患者腦組織中，Glo 1表達(dá)在早期增加，但在晚期減少，MG的積累量也隨之增加[28]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，Glo 1可能通過SNP或者ncRNAs進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致Glo 1表達(dá)和活性降低，其機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。綜上，Glo1在不同疾病中的變化規(guī)律不同，CNV、SNP、轉(zhuǎn)錄因子和非編碼RNA提示我們，從CNV、SNP、轉(zhuǎn)錄因子和非編碼RNA等多方面綜合系統(tǒng)研究Glo 1在不同疾病中表達(dá)調(diào)控的規(guī)律意義重大，通過這些研究可以為相關(guān)疾病的診斷和和治療提供潛在的靶點(diǎn)和新思路。