性別及雌激素水平對(duì)腎血管性高血壓大鼠血管組織ACE1-Ang Ⅱ-ATR軸的影響

阿瓦古麗·達(dá)吾提，劉 丹，阿迪拉·迪力夏提，阿布來(lái)提·阿布力孜，阿地力江·薩吾提，艾再提·克日木，阿迪力·阿不都熱合曼，鄔利婭·伊明

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

腎血管性高血壓(renovascular hypertension，RVH)是各種原因造成腎動(dòng)脈狹窄或阻塞后產(chǎn)生的繼發(fā)性高血壓，是僅次于腎臟疾病導(dǎo)致繼發(fā)性高血壓的第2位原因[1]。

近年來(lái)，關(guān)于雌激素在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，逐漸引起了研究者的關(guān)注。流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，女性絕經(jīng)后與同年齡絕經(jīng)前婦女相比，心腦血管疾病和高血壓的發(fā)病率明顯升高[2]。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素對(duì)心血管疾病有保護(hù)作用，并參與血壓的調(diào)節(jié)[3],其作用主要通過(guò)下調(diào)腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)重要組分表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，♂ RVH大鼠的血壓水平低于♀，切除雙側(cè)卵巢導(dǎo)致雌激素低下后，血壓下降并接近♂動(dòng)物[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)RVH及雌激素低下合并RVH大鼠的血管組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶1(angiotensin converting enzyme 1，ACE1)、血管緊張素Ⅱ的1a型受體(angiotensin type 1a receptor，AT1aR)、血管緊張素Ⅱ的1b型受體(angiotensin type 1b receptor，AT1bR)、血管緊張素Ⅱ 2型受體(angiotensin type 2 receptor，AT2R)的mRNA，以及ACE1、AT1R、AT2R蛋白表達(dá)，探討性別及雌激素水平對(duì)腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10周齡的45只SD大鼠(♀30只，♂15只)，體質(zhì)量(180±20)g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(新)20160003。根據(jù)手術(shù)類型分為雄性手術(shù)組(2K1C-M)、雌性手術(shù)組(2K1C-F)、雌性去勢(shì)組(2K1C-OVX)，手術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)32周。

1.2 試劑雌二醇放射免疫分析試劑盒、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， Ang Ⅱ)放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；戊巴比妥鈉(Sigma公司)；總蛋白抽提試劑盒和蛋白定量試劑盒(上海天根生物有限公司)；ACE1、AT1R、AT2R抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記的二抗、免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；TRIzol、RNase inhibitor、Oligd(T)18、dNTPs、10×PCR buffer，均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 儀器Powerlab生物信號(hào)處理系統(tǒng)(澳大利亞AD Instruments公司)；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；UV-2802紫外分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)；Real time PCR儀(ABI公司)；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能)。

2 方法

2.1 兩腎一夾(two-kidney one-clip，2K1C)RVH動(dòng)物模型的制備30只SD大鼠，♀♂各半，以戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉，分離左側(cè)腎動(dòng)脈，套U型銀夾子(內(nèi)徑為0.25 mm)以狹窄腎動(dòng)脈，術(shù)后分層縫合切口，后肢肌肉注射青霉素鈉(每只80 000 U)預(yù)防感染，完成2K1C手術(shù)。

2.2 高血壓合并雌激素低下動(dòng)物模型的制備♀SD大鼠(15只)做左側(cè)腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)的同時(shí)，分離雙側(cè)卵巢，結(jié)扎卵巢動(dòng)脈后切除雙側(cè)卵巢(ovariectomized，OVX)，手術(shù)后給予青霉素(每只80 000 U)預(yù)防感染，完成2K1C-OVX手術(shù)。麻醉清醒前注意保溫，以防凍死，清醒后在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)水、進(jìn)食，常規(guī)喂養(yǎng)32周。

2.3 大鼠動(dòng)脈血壓的測(cè)定術(shù)后32周后，戊巴比妥鈉按40 mg·kg-1腹腔注射麻醉，充滿肝素化生理鹽水的PE50導(dǎo)管插入右側(cè)頸總動(dòng)脈；將導(dǎo)管接壓力換能器，信號(hào)輸入至Powerlab生物信號(hào)處理系統(tǒng)測(cè)動(dòng)物的收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)。以SBP>18.62 kPa為篩選標(biāo)準(zhǔn)，血壓高于此標(biāo)準(zhǔn)入選，剔除低者。

2.4 標(biāo)本留取將符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物取2 mL血，室溫下靜置0.5～1 h后, 300 r·min-1離心10 min，取上清液，置-80 ℃冰箱保存。取血2 mL迅速注入含酶抑制劑(3.0 mmol·L-1EDTA二鈉20 μL、3.4 mmol·L-18-羥基喹啉20 μL、3.2 mmol·L-1二巰基丙醇10 μL)的抗凝管中，搖勻，300 r·min-1、4 ℃離心15 min，將上清液置于-80 ℃冰箱保存，用放射免疫法按說(shuō)明書測(cè)雌二醇和Ang Ⅱ的濃度。

2.5 qPCR法檢測(cè)大鼠血管組織中ACE1、AT1aR、AT1bR、AT2R的mRNA表達(dá)取各組大鼠動(dòng)脈組織100 mg，在液氮中磨成粉狀，加入1 mL TRIzol試劑，氯仿抽提和乙醇沉淀方法準(zhǔn)備總RNA。檢測(cè)RNA樣品在260 nm和280 nm處的吸光度。在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以2.0 μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總反應(yīng)體系為25 μL，所得cDNA于-20 ℃凍存。引物序列見Tab 1。待測(cè)樣品均作復(fù)管，每次實(shí)驗(yàn)均以不加模板的PCR體系作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min(熱啟動(dòng))，94 ℃，30 s(變性)，65 ℃，30 s(退火)，72 ℃，30 s(延伸)，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果用MJ opticon monitor軟件分析。

2.6 Western blot檢測(cè)血管組織中ACE1、AT1R及AT2R的蛋白表達(dá)稱取0.1 g胸主動(dòng)脈組織，剪碎組織，加入0.5 mL組織裂解液(RIPA)進(jìn)行裂解, 4 ℃、12 000×g離心10 min,取上清液，用Bradford法測(cè)定所提取的蛋白濃度。將樣品適當(dāng)稀釋后，95 ℃變性5 min，冷卻后-20 ℃凍存。SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以封閉液室溫封閉膜1 h后，加入一抗ACE1(1 ∶2 000)、AT1R(1 ∶1 000)、AT2R(1 ∶500)、內(nèi)參β-actin(1 ∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。用HRP結(jié)合的二抗在室溫孵育1 h，DAB試劑直接在PVDF膜上顯色。采用Imagetool凝膠圖像分析軟件對(duì)PVDF膜掃描分析，以每組目的蛋白表達(dá)的面積灰度值與β-actin表達(dá)的面積灰度值的比值作為半定量分析值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血壓、Ang Ⅱ濃度及雌激素水平的比較2K1C-F組的收縮壓明顯高于2K1C-M組和2K1C-OVX組(P<0.05)，各組動(dòng)物的舒張壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與2K1C-F組比較，2K1C-M組、2K1C-OVX組的Ang Ⅱ含量明顯升高(P<0.01);與2K1C-M組相比，2K1C-OVX組的收縮壓及Ang Ⅱ含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與2K1C-F組相比，切除卵巢之后雌激素含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Tab 2。

Tab 1 Primers used in real-time PCR

Tab 2 Blood pressure, estrogen, Ang Ⅱ concentration in n=15)

*P<0.05,**P<0.01vs2K1C-F;#P<0.05vs2K1C-M

Tab 3 mRNA expression of ACE1, AT1aR, AT1bR，AT2R and AT1aR/AT2R, AT1bR/AT2R in vascular

*P<0.05,**P<0.01vs2K1C-F;#P<0.05,##P<0.01vs2K1C-M

3.2 血管組織中ACE1、AT1aR、AT1bR、AT2R mRNA的表達(dá)Tab 3結(jié)果顯示，與2K1C-F組比較，2K1C-M組的ACE1、AT1aR、AT1bR、AT2R mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，2K1C-OVX組的ACE1、AT1bR mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，AT2R明顯下調(diào)(P<0.05)；與2K1C-M組比較，2K1C-OVX組ACE1、AT1bR、AT2R的mRNA水平明顯下調(diào)(P<0.05), AT1aR也下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與2K1C-F組比較，2K1C-M組，2K1C-OVX組的AT1aR/AT2R和AT1bR/AT2R比值均明顯升高，與2K1C-M組比較，2K1C-OVX組的AT1aR/AT2R比值明顯下降，AT1bR/AT2R 比值明顯升高。

3.3 血管組織中ACE1、AT1R、AT2R的蛋白表達(dá)如Fig 1所示，與2K1C-F組比較，2K1C-M組ACE1、AT1R、AT2R的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，2K1C-OVX組AT2R的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，ACE1、AT1R的相對(duì)表達(dá)量顯示上調(diào)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與2K1C-M組比較, 2K1C-OVX組ACE1、AT2R的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，AT1R也降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

本研究選用RVH動(dòng)物模型，制作這種動(dòng)物模型最常用的方法是兩腎一夾(2K1C)[6],此模型的成模原理主要是激活腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)，模型建立成功后比較穩(wěn)定，重復(fù)性也較好。

本研究發(fā)現(xiàn)，2K1C-F組的血壓高于2K1C-M組和2K1C-OVX組。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，2K1C-F組的內(nèi)皮素(endothelin-1，ET-1)的含量大于2K1C-M組和2K1C-OVX組[5]，推測(cè)NO-內(nèi)皮素系統(tǒng)的變化可能是♀動(dòng)物的血壓高于♂的原因，但雌激素促進(jìn)ET-1釋放的機(jī)制尚不確定。雌性2K1C-F組Ang Ⅱ的含量，ACE1、AT1R的mRNA及蛋白表達(dá)均低于2K1C-M組，提示RAS的mRNA及蛋白表達(dá)均有性別差異性，以及雌激素可下調(diào)ACE1-Ang Ⅱ-AT1R軸的活性。文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，RAS的各個(gè)組分在女性和男性中的表達(dá)都有差異[7-8]，且雌激素可下調(diào)組織中ACE1和AT1R受體的表達(dá)[9]。Ang Ⅱ主要作用于兩種受體:血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)和血管緊張素Ⅱ2型受體(AT2R)。Ang Ⅱ與AT1R結(jié)合，產(chǎn)生血管收縮、水鈉潴留、醛固酮釋放、升高血壓等生理效應(yīng)。對(duì)于AT2R的生理作用有爭(zhēng)議，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，AT2R引起的生理效應(yīng)與AT1R相反，AT2R具有舒張血管和對(duì)抗AT1R介導(dǎo)的收縮血管作用[10]。有研究報(bào)道，♀自發(fā)性高血壓動(dòng)物主動(dòng)脈中，AT1R的mRNA表達(dá)水平明顯高于♂和去卵巢組，AT2R的表達(dá)反而雌性的低于雄性和去卵巢組，但雌性動(dòng)物AT1R/AT2R的比值明顯低于雄性和去卵巢組[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，2K1C-F組中AT2R的mRNA表達(dá)水平明顯低于2K1C-M組，但2K1C-F組AT1aR/AT2R、AT1bR/AT2R比值明顯低于2K1C-M組和2K1C-OVX組，表明雌激素下調(diào)AT1R表達(dá)的影響大于AT2R。

Fig 1 Protein expression of ACE1, AT1R，

*P<0.05vs2K1C-F;#P<0.05vs2K1C-M

本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除后雌激素水平降低，且Ang Ⅱ含量及ACE1、AT1R的表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢切除后不僅上調(diào)ACE1、AT1R的表達(dá)，且下調(diào)AT2R的表達(dá)[12]。實(shí)驗(yàn)表明，與同齡男性比較，絕經(jīng)后女性RAS基因表達(dá)水平增加[13]。但在我們實(shí)驗(yàn)中可能是因?yàn)?K1C-OVX組的雌激素濃度仍然高于2K1C-M組，導(dǎo)致了2K1C-M組的RAS表達(dá)高于2K1C-OVX組。

綜上所述，RVH大鼠血管組織中Ang Ⅱ的含量，AT1R、AT2R、ACE1的mRNA及蛋白表達(dá)存在性別及雌激素水平差異性：切除卵巢的RVH大鼠和♂RVH大鼠的ACE1-Ang Ⅱ-AT1R軸的mRNA及蛋白表達(dá)量均高于♀RVH大鼠。但血管組織中RAS的性別差異性和雌激素差異性不能解釋血壓的差異性。