印跡基因修飾使孤雌胚胎干細(xì)胞獲得四倍體補(bǔ)償能力

李旭，彭柯力，張金鑫，高倩，張文豪，滑若彤，帥領(lǐng)

南開大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點實驗室，天津 300350

孤雌胚胎干細(xì)胞 (Parthenogenetic embryonic stem cells，pESCs) 來源于化學(xué)激活的未受精卵母細(xì)胞發(fā)育來的囊胚中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (Inner cell mass，ICM)，所以兩套基因組均來源于母本。在之前的報道中，pESCs 已經(jīng)在小鼠[1]、兔[2]、靈長類[3]等物種中建立，這些pESCs具備了一定的多能性，可以體外分化為多種體細(xì)胞，同時小鼠pESCs也可以貢獻(xiàn)到嵌合動物的各種組織和器官中。此外，pESCs的基因組來源于卵母細(xì)胞，所以與卵供體具有很好的組織相容性，經(jīng)移植后不會產(chǎn)生免疫排斥[4]，因此，pESCs也是一類進(jìn)行細(xì)胞替代療法理想的資源細(xì)胞。在之前的報道中，pESCs已經(jīng)應(yīng)用于包括帕金森綜合征[5]、心臟損傷修復(fù)[6]和肝臟再生[7]等小鼠動物模型的研究中。所以提高pESCs的多能性對于未來將其更好地應(yīng)用于臨床治療中有重要意義。

基因組印跡在哺乳動物發(fā)育中起到關(guān)鍵作用，當(dāng)胚胎缺失父源或母源任意一方基因印跡時都將無法發(fā)育到期[8]。小鼠的孤雌胚胎由于缺失父源印跡基因最多只能發(fā)育到胚胎發(fā)育的13.5 d(E13.5)[9]。pESCs由于缺失了父源基因印跡，使得印跡基因表達(dá)呈雙母源狀態(tài)，導(dǎo)致其無法像正常的受精卵來源的ESCs一樣具有四倍體補(bǔ)償?shù)哪芰?。此外，印跡基因的表達(dá)水平與DNA甲基化的程度也同樣會影響pESCs的多能性[10]。為了提高pESCs的多能性，研究者們進(jìn)行了許多嘗試。Hikichi 等通過將pESCs細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞的方式改變其DNA的甲基化狀態(tài)[11]，并且最終通過多次連續(xù)核移植的方式獲得了發(fā)育到期的胎兒[12]。H19是位于小鼠7號染色體上的一個母源表達(dá)的基因，編碼長非編碼RNA (Long non-coding RNA，LncRNA)，在胚胎發(fā)育中起到重要作用[13]，其表達(dá)由一段基因內(nèi)部的差異甲基化區(qū)域 (H19differentially methylated region，H19-DMR) 控制，當(dāng)敲低H19后，pESCs的多能性將得到顯著提高[14]。此外，Kono等將敲除H19-DMR的未成熟卵母細(xì)胞核注入正常的卵母細(xì)胞，此重構(gòu)孤雌胚胎經(jīng)激活可以發(fā)育到成年[15]。此外，小鼠12號染色體上有一簇重要的印跡基因群，由位于Dlk1-Gtl2間的差異甲基化區(qū)(Intergenic region differentially methylated region，IG-DMR) 控制多個印跡基因的表達(dá)，該印跡基因群對于胚胎的發(fā)育也起到重要作用[16]。在之前的報道中，Kono等同時敲除H19-DMR與IG-DMR的一個等位基因并獲得重構(gòu)胚胎，大幅度提高了孤雌胚胎發(fā)育到期的效率[17]。之后，Li等通過將H19-DMR與IG-DMR敲除的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞注入卵母細(xì)胞獲得重構(gòu)胚胎，也可以大幅度提高孤雌胚胎的發(fā)育效率[18]。之前的報道證實，敲除H19-DMR與IG-DMR的一個等位基因并通過半克隆的方式可以提高孤雌胚胎的效率。因此推測將H19-DMR與IG-DMR的一個等位基因敲除也可以大幅度提高pESCs的多能性，而四倍體補(bǔ)償正是驗證干細(xì)胞多能性的金標(biāo)準(zhǔn)。文中首次通過敲除pESCs中的H19-DMR與IG-DMR的單等位基因，提高了pESCs的發(fā)育潛能，通過四倍體補(bǔ)償?shù)姆绞将@得了發(fā)育到期的小鼠。具備四倍體補(bǔ)償能力即可證明pESCs可以分化到個體的任一類型細(xì)胞，為將來pESCs的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所需小鼠購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于SPF標(biāo)準(zhǔn)鼠房。所使用細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12、N2、B27、胰酶、限制性內(nèi)切酶等均購自Thermo公司。定量PCR試劑購自Roche公司。所使用抗體均購自Abcam公司。引物合成及測序由北京奧科鼎盛生物科技公司完成。

1.2 方法

1.2.1 孤雌胚胎干細(xì)胞建系

在取卵前兩天對每只129Sv/Jae譜系的雌鼠進(jìn)行腹腔注射5-10 U的PMSG激素，48 h后注射5-10 U的HCG激素。注射HCG 14-16 h后。處死雌鼠，劃開輸卵管膨大部取卵，再將卵母細(xì)胞置于50 μL的操作液中 (CZB-HEPES) 清洗3次，之后在50 μL KSOM (石蠟油覆蓋) 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，再在含有細(xì)胞松弛素和SrCl2的激活液中培養(yǎng)6 h左右，清洗干凈后的胚胎在KSOM中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。將囊胚置于含R1+2i培養(yǎng)液及飼養(yǎng)層細(xì)胞的4孔板中，靜置培養(yǎng)3-4 d，可見內(nèi)細(xì)胞團(tuán)孵出并在飼養(yǎng)層上呈克隆樣，每天換液，待克隆長大后，挑克隆消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

小鼠胚胎干細(xì)胞系ESCs、pESCs、H19-DMR+/-pESCs、DKO-pESCs培養(yǎng)于R1+2i培養(yǎng)液中。R1+2i培養(yǎng)液成分為DMEM/F12 (Gibco)、15%胎牛血清(BI)、1%的NEAA (Millipore)、1 U/mL白血病抑制因子(lif) (Millipore)、40 mmol/L PD0325901、120 mmol/L CHIR99021 (MCE)。每兩天用胰酶(Gibco) 傳一次代，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。為了獲得H19-DMR+/-pESCs、DKO-pESCs，大約1×106細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，共使用8 μg質(zhì)粒，sgRNA-cas9∶同源重組供體質(zhì)粒為1∶1，根據(jù)試劑盒說明書使用Lipofectamine LTX kit (Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6-8 h 換液，36 h 分選GFP陽性細(xì)胞(Cas9陽性)。分選后的細(xì)胞使用G418 (250 μg/mL)篩選7 d獲得 H19-DMR+/-pESCs，或使用嘌呤霉素 (Puromycin) (1 μg/mL) 進(jìn)行抗性篩選3 d獲得DKO pESCs。對挑取的亞克隆進(jìn)行基因型鑒定，各引物序列見表3。

1.2.3 免疫熒光染色

待細(xì)胞長出克隆后，用4% 多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗3次，加入0.3% Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行處理 (30 min)，之后進(jìn)行3次PBS清洗，再加入含3% BSA的PBS進(jìn)行封閉，室溫處理1 h，加入一抗 (1∶200) 4 ℃過夜，之后PBS清洗3次，加入二抗 (1∶200)，室溫1 h，PBS清洗3次，加入DAPI (1∶200)，室溫孵育10-15 min，PBS清洗后，加防熒光淬滅劑封片。使用激光共聚焦顯微鏡收集圖片。文中所用一抗均購自Abcam公司，二抗購自天津三箭生物有限公司。

1.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建

在MIT CRISPR Design網(wǎng)站上設(shè)計基因編輯sgRNAs，sgRNAs 單鏈DNA片段合成后，加磷退火成雙鏈，連入BbsⅠ線性化的PX461 (AddGene)質(zhì)粒中，測序后進(jìn)行大提。為了構(gòu)建同源重組質(zhì)粒，首先通過PCR的方式獲得同源臂DNA片段與抗性片段，之后一步步連接入pEasy-Blunt Simple Vector (TransGene)中，經(jīng)測序驗證成功后大提，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。sgRNA序列見表1。

1.2.5 定量PCR

按照試劑使用說明用 Trizol提取細(xì)胞中的總RNA。之后取1 μg RNA用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，稀釋10倍后進(jìn)行定量PCR。定量PCR試劑盒購自Roche公司。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，使用定量PCR儀 (Thermo)收集數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCt法來表示實驗組和對照組中目的基因的表達(dá)倍數(shù)比。各引物序列見表2。

表1 sgRNAs序列Table 1 Sequence of sgRNA

1.2.6 亞硫酸氰鹽DNA甲基化測序

提取細(xì)胞基因組，按照亞硫酸氰鹽DNA甲基化試劑盒 (Qiagen) 說明進(jìn)行DNA的亞硫酸氰鹽修飾，回收修飾過后的DNA，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物連接入pEASY-Blunt Simple Vector中，挑細(xì)菌單克隆送測序。獲得測序結(jié)果后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入http：//quma.cdb.riken.jp/進(jìn)行分析，引物見表2。

表2 qPCR及DNA甲基化引物序列Table 2 Primers for qPCR and detection of DNA methylation

1.2.7 四倍體補(bǔ)償

取見栓第2天的雌鼠輸卵管沖出2細(xì)胞胚胎，之后將2細(xì)胞置于融合液中清洗3次，融合液為0.3 mol/L甘露醇、0.1 mmol/L MgSO4、3 mg/mL BSA和0.1 mg/mL PVA。最后轉(zhuǎn)移至融合槽兩極間進(jìn)行融合。融合后的胚胎繼續(xù)采用KSOM進(jìn)行培養(yǎng)，1 h后觀察，去除未融合的胚胎。繼續(xù)培養(yǎng)胚胎至4細(xì)胞胚胎，此時注入8-10個胚胎干細(xì)胞于卵周隙中。重構(gòu)胚胎在KSOM培養(yǎng)液中平衡30 min后移植到ICR假孕雌鼠的輸卵管中。

表3 基因鑒定引物序列Table 3 Primers for genotype

2 結(jié)果與分析

2.1 pESCs的獲得

為了獲得pESCs，對雌鼠進(jìn)行了超排取卵，經(jīng)SrCl2激活，經(jīng)細(xì)胞松弛素B (CB) 處理后，獲得孤雌二倍體胚胎。孤雌二倍體胚胎可以正常發(fā)育至囊胚 (圖1A)，孤雌囊胚形態(tài)良好，可以清晰觀察到囊胚腔、內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (ICM)、滋養(yǎng)層外胚層細(xì)胞 (TE) 結(jié)構(gòu) (圖1B)。將狀態(tài)良好的囊胚種植于R1+2i的培養(yǎng)液中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)孵出，經(jīng)擴(kuò)增傳代后，可見穹窿狀的pESCs克隆 (圖1C)。進(jìn)一步檢測了印跡基因H19-DMR和Snrpn在pESCs基因組中的甲基化狀態(tài)。經(jīng)檢測H19-DMR在ESCs基因組中的甲基化為58.8%，在pESCs基因組中的甲基化水平為8.1% (圖1D)，符合父源印跡基因H19-DMR在pESCs中呈現(xiàn)出的低甲基化狀態(tài)。而Snrpn在ESCs基因組中甲基化水平為32.5%，在pESCs基因組中甲基化水平為86.9%(圖1E)，結(jié)果也符合母源印跡基因Snrpn在pESCs中呈現(xiàn)出的高甲基化狀態(tài)。通過以上實驗，成功建立了pES細(xì)胞系。

圖1 通過化學(xué)激活卵母細(xì)胞獲得pESCs并進(jìn)行相關(guān)印跡基因的DNA甲基化檢測Fig.1 Derivation of pESCs from chemically activated oocytes and detection of relate imprinting genes DNA methylation in pESCs.(A) Development of parthenogenetic embryos.(B) Parthenogenetic blastocysts in bright field (BF).(C) Established parthenogenetic embryonic stem cell lines in BF.(D) Schematic of H19-DMR DNA methylation by bisulfite analysis.(E)Schematic of Snrpn DNA methylation by bisulfite analysis.

2.2 pESCs多能性鑒定

圖2 pESCs多能性鑒定Fig.2 Identify the pluripotency of pESCs.(A) The AP stain of pES cells.(B) Immunofluorescence for SSEA1 and OCT4 in undifferentiated pES cells.(C) qPCR analysis the expression of the pluripotency marker gene(Oct4,Nanog,Rex1).(D) The NSCs differentiated from pES cells.(E) Immunofluorescence for Nestin and Pax6 in NSC derived from pES cells.

為確定pESCs的多能性，對pESCs進(jìn)行堿性磷酸酶染色，結(jié)果顯示pESCs具有較強(qiáng)的堿性磷酸酶活性 (圖2A)。進(jìn)一步鑒定其多能性，免疫熒光染色結(jié)果證明，pESCs表達(dá)Oct4與SSEA1兩種胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因 (圖2B)。同時針對RNA水平也進(jìn)行檢測，通過定量PCR結(jié)果顯示，pESCs在Oct4、Nanog和Rex1這3個胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因的表達(dá)與受精卵來源的ESCs無顯著差異。同時pESCs也有良好的神經(jīng)分化能力。pESCs來源的神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)良好 (圖2D)，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志基因 (圖2E)。以上結(jié)果證明pESCs具備良好的多能性。

2.3 獲得H19-DMR+/– pESC與DKO pESCs

雖然pESCs在體外分化方面展現(xiàn)了一定的多能性，但是由于缺失父源基因組而導(dǎo)致其不具備發(fā)育成一個完整個體的能力。而有文獻(xiàn)報道通過修飾父源印跡基因可以提高重構(gòu)孤雌胚胎的發(fā)育能力[15]。因此嘗試通過基因編輯技術(shù)修飾父源印跡H19-DMR與IG-DMR提高pESCs的多能性。為了通過CRISPR/Cas9敲除H19-DMR，設(shè)計敲除方案如圖3A所示。將sgRNA-Cas9 (Cas9攜帶GFP標(biāo)記) 質(zhì)粒與供體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染到pESCs中，之后分選GFP陽性細(xì)胞 (圖3B)。將分選回的細(xì)胞進(jìn)行G418抗性篩選7 d，獲得抗性細(xì)胞 (圖3C)。將抗性pESCs亞克隆傳代后進(jìn)行基因型鑒定，測序結(jié)果顯示為雜合子 (圖3D)，并命名為H19-DMR+/-pESCs。為進(jìn)一步提高pESCs的發(fā)育潛能，在H19-DMR+/-pESCs進(jìn)一步敲除IG-DMR。質(zhì)粒設(shè)計圖如圖3E所示。經(jīng)過流式分選與嘌呤霉素抗性篩選后，對抗性亞克隆進(jìn)行基因型鑒定，測序結(jié)果證明，IG-DMR的單等位基因也被敲除(圖3E)，獲得的細(xì)胞系命名為DKO-pESCs。

圖3 通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組獲得H19-DMR+/-與DKO pESCsFig.3 Derivation of H19-DMR+/- and DKO pESCs through homologous recombination mediated by CRISPR/Cas9.(A) Schematic overview of H19-DMR knockout.(B) Flow cytometry sorting of eGFP positive cells from transfected pESCs.eGFP positive indicates expression of Cas9.(C) G418 resistant results after 7 days.Right panel is the cells with transfection,left without transfection.(D) DNA sequencing of H19-DMR subclones genotype.The F1/R1,F2/R2 and F3/R3 indicate the sites of the H19-DMR genotype primers.(E) Schematic overview of IG-DMR knockout and DNA sequencing of IG-DMR subclones genotype.The F1/R1,F2/R2 and F3/R3 indicate the sites of the IG-DMR knockout genotype primers.

2.4 DKO pESCs四倍體補(bǔ)償獲得小鼠鑒定

獲得DKO pESCs后，首先檢測了H19-DMR與IG-DMR相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明，父源印跡基因H19與Meg3的表達(dá)量顯著下降，母源印跡基因Igf2與Dlk1的表達(dá)量上升。為了進(jìn)一步分析基因編輯后的pESCs的多能性，對其進(jìn)行了四倍體補(bǔ)償實驗。結(jié)果顯示僅敲除H19-DMR無法獲得四倍體補(bǔ)償動物，但是DKO-pESCs卻可以獲得四倍體補(bǔ)償動物，盡管效率極低 (0.29%) (圖4B)。所獲得四倍體補(bǔ)償小鼠雖然個體完整，但是出生后即死亡，而且與對照組同一天出生的野生型小鼠對比可以發(fā)現(xiàn)，小鼠個體偏小，嘴巴張大，舌頭微微外吐 (圖4C)。為確定由四倍體補(bǔ)償獲得的小鼠是否來源于DKO-pESCs，分別進(jìn)行了SSLP鑒定與基因型鑒定 (圖4D-E)。結(jié)果顯示，該小鼠確實為129 DKO-pESCs來源。以上數(shù)據(jù)說明，在pESCs中同時敲除H19-DMR和IG-DMR的單等位基因可以使pESCs具備四倍體補(bǔ)償能力。

圖4 四倍體補(bǔ)償獲得DKO pESCs來源的小鼠胎兒Fig.4 Derivation of pup from DKO pESCs through tetraploid complementation.(A) qPCR analysis the expression of H19-DMR and IG-DMR related genes (H19,Igf2,Meg3 and Dlk1),t test,*P＜0.05,**P＜0.01.Data are represented as mean ±s.(B) The statistics of development efficiency.(C) The newborn pups.The star indicate the DKO pup from tetraploid complementation.The other two is the normal WT pups as the control.(D) Microsatellite analysis shows the alleles of DKO pup is identical to those of DKO pESC but completely different from the tetraploid blastocysts CD1 and others.(E) Genotype the DKO pup through tetraploid complementation.

3 討論

多能性干細(xì)胞既可以自我更新又可以分化為多種體細(xì)胞類型，所以是未來細(xì)胞替代治療療法的重要來源細(xì)胞之一。由于免疫排斥作用，可以被應(yīng)用于臨床的多能干細(xì)胞只能是來源于病人自身的細(xì)胞。目前由于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的安全性尚在評估，核移植胚胎干細(xì)胞又存在著操作復(fù)雜的問題，因此相對安全又容易獲得的pESCs是未來替代療法的重要細(xì)胞資源之一。另外，pESCs僅具備卵母細(xì)胞基因組，所以可與卵供體MHC匹配[4]。pESCs可以通過囊胚嵌合實驗貢獻(xiàn)到各種組織器官中。此外pESCs也可以在體外分化為各種體細(xì)胞類型，包括神經(jīng)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，并應(yīng)用到疾病模型動物的治療研究中[5-7]。之前的研究表明，孤雌胚胎最多可以發(fā)育至E13.5[9]，此外，來源于孤雌囊胚的pESCs的多能性也比ESCs要差一些[19]。印跡基因在胚胎發(fā)育過程中起到重要作用，根據(jù)Yang等的報道，孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞 (Androgenetic haploid ESCs，AG-hESCs) 具備類似精子的能力，可以通過半克隆的方式獲得動物，敲除H19-DMR、IG-DMR后注射到卵母細(xì)胞中可以大幅度提高半克隆效率[20]，而將敲除H19-DMR、IG-DMR的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞 (Parthenogenetic haploid embryonic stem cells，phESCs) 注射到卵母細(xì)胞中也可以大幅度提高孤雌小鼠的發(fā)育率[18]。因此，為進(jìn)一步提高pESCs的多能性，文中首次對pESCs中的父源印跡基因進(jìn)行了編輯。結(jié)果表明，當(dāng)印跡基因H19-DMR、IG-DMR的單等位基因被敲除后，pESCs來源的小鼠可以發(fā)育到期。pESCs通過四倍體補(bǔ)償?shù)男∈罂梢杂^察到小鼠個體偏小、舌頭外吐，我們推測主要原因是僅僅敲除兩個母源表達(dá)印跡基因的單等位基因可能并不足以使得pESCs具備使四倍體補(bǔ)償動物發(fā)育到健康個體的能力。由于在pESCs中仍然有許多重要的印跡基因在發(fā)育進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用，Li等報道[21]，在編輯H19-DMR和IG-DMR的基礎(chǔ)上又編輯了Rasgrf1不僅可以提高獲得孤雌小鼠的效率還獲得了行為正常的成體的孤雌小鼠，因此可能需要編輯更多的關(guān)鍵印跡基因才能使pESCs進(jìn)一步提高獲得四倍體補(bǔ)償動物的效率，并最終獲得正常的孤雌成體動物。為了更好地研究印跡基因在個體發(fā)育中的作用和進(jìn)一步提高pESCs的發(fā)育潛能，可以結(jié)合印跡基因編輯的孤雌/孤雄單倍體細(xì)胞與四倍體補(bǔ)償實驗，獲得健康的孤雌或孤雄小鼠，并發(fā)現(xiàn)更多相關(guān)的關(guān)鍵印跡基因，再針對這些印跡基因在pESCs上進(jìn)行修飾，進(jìn)一步提高pESCs的多能性，獲得健康的孤雌動物，拓展pESCs的應(yīng)用。