應(yīng)用RAD多肽展示體系制備抗hCG類抗體分子

劉夢(mèng)雯，王美，王瓊，辛化偉,2

1 武漢科技大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院，湖北 武漢 430065

2 臨沂大學(xué) 藥學(xué)院，山東 臨沂 276000

人絨毛膜促性腺激素 (hCG) 是人正常妊娠及某些惡性腫瘤發(fā)生中產(chǎn)生的多肽類激素[1-3]。hCG由胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌，由α和β兩個(gè)亞基組成，以二硫鍵將其連結(jié)在一起形成二聚體結(jié)構(gòu)[4-5]。hCG的α亞基與LH、TSH及FSH的α亞基基本相似，而β亞基的結(jié)構(gòu)卻不一樣，hCG的生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性主要取決于β亞基[6-7]。hCG-β也是正常妊娠及相關(guān)失調(diào)、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的標(biāo)識(shí)分子。另外，近期研究發(fā)現(xiàn)，在其他非滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤如卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸癌中，也顯示hCG-β的異常表達(dá)。因此，利用特異性的hCG結(jié)合分子檢驗(yàn)血和尿中的hCG水平，在檢測(cè)極早期妊娠及惡性腫瘤過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

當(dāng)前包括hCG-β在內(nèi)的疾病標(biāo)識(shí)分子的臨床檢驗(yàn)一直沿用基于單克隆抗體的免疫檢測(cè)技術(shù)[8-9]。近年來(lái)，隨著體外蛋白質(zhì) (及非蛋白質(zhì))識(shí)別分子技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用非抗體蛋白骨架、通過(guò)多肽嫁接或置換篩選技術(shù)獲得特定蛋白的親和分子的方法逐漸受到人們的重視，并開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)分子檢驗(yàn)的嘗試。但是，由于大多數(shù)蛋白骨架的可變位點(diǎn)有限，可容許大片段多肽嫁接的蛋白骨架較少，導(dǎo)致多肽嫁接后不能有效地結(jié)合目標(biāo)分子。近期有研究報(bào)道，一種應(yīng)用嗜熱古菌Pyrococcus furiosus的重組酶RadA分子的球形ATP酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)骨架 (簡(jiǎn)稱RAD骨架)，可接納多肽、完整結(jié)構(gòu)域甚至全長(zhǎng)蛋白的插入、嫁接，具有其他蛋白質(zhì)骨架所沒(méi)有的高度靈活性，并可在細(xì)菌中表達(dá)和快速生產(chǎn)，引起了研究者的注意[10]。這種蛋白質(zhì)骨架還具有很高的熱穩(wěn)定性，不含半胱氨酸殘基，能容忍表面突變和缺失[11-12]。利用RAD骨架建立的多肽或蛋白展示體系 (RAD display) 制備類抗體分子，有望用于醫(yī)學(xué)標(biāo)識(shí)分子等的檢測(cè)[13-14]。因此，本研究以hCG為檢驗(yàn)分子，嘗試制備其RAD嫁接類抗體分子，并與單域嫁接抗體及商業(yè)單克隆抗體進(jìn)行抗原結(jié)合活性比較，檢驗(yàn)其應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a(+) 質(zhì)粒、pET30a(+)-sfGFP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；重組抗hCG-α抗體、重組抗hCG-β抗體-sfGFP融合蛋白 (cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP)，pCDNA3-hCG-α、LHB (促黃體生成素β亞基) 表達(dá)質(zhì)粒，hCG-α+LHB轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞分泌上清，由本實(shí)驗(yàn)室制備；大腸桿菌E.coliDH5α和大腸桿菌E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室制備；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天公司；JEG-3細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽公司；hCG Antigen購(gòu)自上海領(lǐng)潮公司；Anti-hCG-β/FITC購(gòu)自北京博奧森公司；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；Ni-NTA親和柱購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；基因合成由杭州金唯智公司完成；DNA測(cè)序由武漢擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

全基因合成P.furiosus重組酶RadA的ATPase結(jié)構(gòu)域 (RAD展示骨架) 基因，在其上、下游分別引入BglⅡ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，將其用BglⅡ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，pET30a-sfGFP質(zhì)粒用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用T4 DNA連接酶將膠回收后的RAD基因片段和pET30a-sfGFP酶切DNA產(chǎn)物于22 ℃連接2 h，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoR Ⅴ和SalⅠ雙酶切鑒定，并將雙酶切鑒定正確的陽(yáng)性克隆送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。質(zhì)粒圖譜如圖1A所示。

全基因合成hCG結(jié)合多肽插入RAD骨架L2環(huán)的嫁接RAD (后簡(jiǎn)稱RAD/hCGBP) 基因序列，同樣在其上、下游分別引入BglⅡ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，克隆到pET30a-sfGFP載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoR Ⅴ單酶切鑒定，并將酶切鑒定正確的陽(yáng)性克隆送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。質(zhì)粒圖譜如圖1B所示。

1.3 類抗體蛋白的表達(dá)

將質(zhì)粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。分別挑取單克隆菌落搖種子，按1∶60 (V/V) 的接種量轉(zhuǎn)接。當(dāng)OD值為0.6時(shí)，取部分未誘導(dǎo)菌液作為陰性對(duì)照。剩余部分加入0.5 mmol/L IPTG于18 ℃低溫誘導(dǎo)12 h，離心收集菌體沉淀，取一部分菌體沉淀用于檢測(cè)全菌蛋白；另一部分加入9倍體積的Buffer H緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl，10%甘油，10 mmol/L β-巰基乙醇，30 mmol/L咪唑)，1倍體積10 mg/mL溶菌酶，0.1倍體積0.1 mol/L PMSF，混勻，冰浴超聲破碎20 min，離心分離上清和沉淀，用12% SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)菌體全蛋白與超聲破碎后上清和沉淀中的蛋白。

1.4 類抗體蛋白的純化與SDS-PAGE鑒定

在適宜的誘導(dǎo)條件下 (18 ℃，120 r/min) 誘導(dǎo)類抗體蛋白的表達(dá)。收集誘導(dǎo)后菌體、取超聲破碎菌體后的裂解液上清，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，與Ni-NTA親和柱 (柱子平衡緩沖液：上述Buffer H)充分結(jié)合，以含0.075 mol/L咪唑的Buffer H洗脫雜蛋白，接著使用新鮮配制0.3 mol/L咪唑的H-Buffer洗脫目的蛋白，分別收集親和柱穿透峰和洗脫峰，用12% SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)收集的蛋白。收集洗脫峰蛋白，透析去除咪唑。類抗體蛋白R(shí)AD-sfGFP和RAD/hCGBPsfGFP的理論分子量分別為57 kDa和58 kDa。

圖1 pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP質(zhì)粒圖譜Fig.1 Plasmid maps of pET30a-RAD-sfGFP and pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP.(A) Plasmid map of pET30a-RAD-sfGFP.(B) Plasmid map of pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP.

1.5 類抗體蛋白濃度及抗原結(jié)合活性的測(cè)定

按照BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定樣品的蛋白濃度。

類抗體蛋白的抗原結(jié)合活性采用親和吸附-GFP熒光檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。用包被緩沖液(碳酸鹽緩沖液pH 9.6，含5%新生牛血清)將anti-hCG-α稀釋至1 μg/mL，在每個(gè)96孔聚苯乙烯發(fā)光板的反應(yīng)孔中加0.1 mL上述抗體稀釋液，4 ℃包被過(guò)夜。第二天，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗滌緩沖液瞬時(shí)洗3次，3 min/次，第3次要棄凈孔中溶液 (此過(guò)程為洗滌，下同)。分別加一定梯度稀釋JEG-3細(xì)胞 (人絨毛膜癌細(xì)胞：該細(xì)胞是從Erwin-Turner腫瘤的Woods系分離建立的6個(gè)克隆中的一個(gè)，可產(chǎn)生hCG) 分泌上清或hCG Antigen 0.1 mL于上述已包被孔中，37 ℃孵育1 h后洗滌，同時(shí)做空白孔對(duì)照。然后于各反應(yīng)孔中，分別加入0.1 mL同濃度的RAD-sfGFP、RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP (應(yīng)用單域抗體通用骨架cAbBCII10，以hCG結(jié)合多肽取代互補(bǔ)決定區(qū)CDR1或CDR3，制備的具有一定抗原結(jié)合活性的抗hCG單域抗體分子)、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗滌。于各反應(yīng)孔中加入0.2 mL的PBS，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)光和熒光檢測(cè)波長(zhǎng)分別為488 nm和525 nm。

1.6 類抗體蛋白滴度測(cè)定

按照同上包被步驟進(jìn)行包被，加一定相同濃度JEG-3細(xì)胞分泌上清0.1 mL于已包被的反應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h后洗滌，同時(shí)做空白孔對(duì)照。于各反應(yīng)孔中，分別加入0.1 mL一定稀釋濃度的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗滌。于各孔中加入0.2 mL的PBS，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 類抗體蛋白的抗原結(jié)合特異性測(cè)定

按包被步驟進(jìn)行包被，分別加一定相同濃度JEG-3細(xì)胞分泌上清或hCG-α+LHB轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞分泌上清0.1 mL于上述已包被反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h后洗滌，同時(shí)留空白孔對(duì)照。于各反應(yīng)孔中分別加入 0.1 mL相同濃度的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗滌。于各孔中加入0.2 mL的PBS，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.8 類抗體蛋白的生化穩(wěn)定性測(cè)定

分別將RAD/hCGBP-sfGFP和cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP與足量的DP-GFP (一種GFP結(jié)合蛋白，本實(shí)驗(yàn)室制備) 混勻，保證GFP標(biāo)簽的穩(wěn)定性。取等份的上述混合物及Anti-hCG-β/FITC抗體分別置于4 ℃、16 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴鍋中水浴30 min，取出，恢復(fù)至室溫。各取100 μL上清于聚苯乙烯板中，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，分析類抗體蛋白的熱穩(wěn)定性。

取等份上述混合物及Anti-hCG-β/FITC抗體，用伯瑞坦-羅賓森 (Britton-Robinson) 廣泛緩沖液 (H3PO4-HAc-H3BO3) 調(diào)pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于4 ℃放置30 min，取出，待恢復(fù)至室溫。各取100 μL于聚苯乙烯板中，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，分析類抗體蛋白的酸堿穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

重組子pET30a-RAD-sfGFP經(jīng)EcoRⅤ和SalⅠ雙酶切鑒定后，結(jié)果所得2條目的帶大小大約為721 bp和5.4 kb，pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP重組子經(jīng)EcoRⅤ單酶切鑒定后得到2條目的帶大小約為603 bp和5.5 kb，結(jié)果符合預(yù)期 (圖2)。酶切正確的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果證實(shí)，連入載體的目的序列與預(yù)期序列一致，密碼子閱讀框準(zhǔn)確無(wú)誤，說(shuō)明兩個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP的構(gòu)建Fig.2 Construction of pET30a-RAD-sfGFP and pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP recombinant plasmid.M1：1 kb DNA marker;M2：100 bp DNA marker;1：digestion of pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP with EcoRⅤ;2：digestion of pET30a-RAD-sfGFP with EcoRⅤand SalⅠ.

2.2 類抗體蛋白的表達(dá)

將pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBPsfGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，收集細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果(圖3) 顯示，IPTG誘導(dǎo)后的E.coliBL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP和E.coliBL21(DE3)/pET30a-RAD-sfGFP可見(jiàn)明顯的蛋白誘導(dǎo)條帶。這兩種蛋白在上清與沉淀中均有顯示，在上清中較多，說(shuō)明可通過(guò)純化可溶性蛋白的方式純化目的蛋白。

2.3 Ni-NTA親和層析柱純化類抗體蛋白

將兩個(gè)重組質(zhì)粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP轉(zhuǎn)化大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)超聲后收集的上清，經(jīng)Ni-NTA親和柱純化后，用不同濃度的咪唑洗脫液進(jìn)行洗脫，獲得較高純度的類抗體蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)分析純化結(jié)果(圖4) 表明，兩個(gè)轉(zhuǎn)化菌株的菌體裂解液上清樣品分別在約57 kDa和58 kDa位置有特異性蛋白條帶，與類抗體蛋白理論分子量大小相近，表明成功純化得到目的蛋白。

圖3 類抗體蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP和RAD-sfGFP的表達(dá)Fig.3 Expression of RAD/hCGBP-sfGFP and RAD-sfGFP fusion proteins.M：marker (10-170 kDa);1：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP,uninduced;2：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP,IPTG induced;3：pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP supernatant,IPTG induced;4：pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP precipitate,IPTG induced;5：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RADsfGFP,uninduced;6：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RADsfGFP,IPTG induced;7：pET30a-RAD-sfGFP supernatant,IPTG induced;8：pET30a-RAD-sfGFP precipitate,IPTG induced.

2.4 類抗體蛋白的濃度與抗原結(jié)合活性分析

通過(guò)BCA蛋白測(cè)定法可以得出RAD-sfGFP和RAD/hCGBP-sfGFP兩個(gè)類抗體蛋白的濃度分別為1.97 mg/mL、2.95 mg/mL。以anti-hCG-α蛋白作為捕獲抗體，以JEG-3細(xì)胞分泌含有hCG抗原的上清作為抗原，分別以RAD-sfGFP、RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC為探測(cè)抗體測(cè)定與hCG的結(jié)合活性，結(jié)果如圖5所示。除空白對(duì)照RAD-sfGFP外，其他4種蛋白對(duì)hCG均有一定結(jié)合活性，其中RAD嫁接類抗體 (RAD/hCGBP) 的抗原結(jié)合活性高于CDR3嫁接抗體 (CDR3/hCGBP3) 和CDR1嫁接抗體 (CDR1/hCGBP1)，且具有不低于Anti-hCG-β/FITC抗體的結(jié)合活性。

圖4 類抗體蛋白R(shí)AD-sfGFP和RAD/hCGBP-sfGFP的純化Fig.4 Purification of RAD-sfGFP and RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.(A) Purification of RAD-sfGFP fusion proteins.M：protein Mw marker (10-170 kDa);1：E. coli BL21 (DE3)/pET30a-RAD-sfGFP supernatant;2：flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;3-6：elutions of Ni-NTA affinity chromatography resin.(B) Purification of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.M：protein Mw marker(10-170 kDa);1：E. coli BL21 (DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP supernatant;2：flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;3-6：elutions of Ni-NTA affinity chromatography resin.

圖5 類抗體蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP結(jié)合hCG抗原 (JEG-3分泌上清) 的活性檢測(cè)Fig.5 Determination of hCG-binding affinity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (hCG antigen from the supernatant of JEG-3 cells).(A) hCG-binding curve against Ag (antigen) relative concentration.(B) hCG-binding curve against log2 of Ag (antigen) relative concentration.

以anti-hCG-α蛋白作為捕獲抗體，以商業(yè)化的hCG Antigen作為抗原，分別以上述5個(gè)蛋白為探測(cè)抗體測(cè)定與hCG的結(jié)合活性，結(jié)果如圖6所示。與單域抗體通用骨架嫁接的抗體相比，RAD嫁接類抗體 (RAD/hCGBP) 對(duì)不同來(lái)源的hCG抗原均展現(xiàn)了較高的結(jié)合活性。

2.5 類抗體蛋白的滴度分析

分別以梯度稀釋的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC為探測(cè)抗體測(cè)定與hCG抗原 (JEG-3細(xì)胞分泌上清) 的結(jié)合活性，結(jié)果如圖7所示，3種分子結(jié)合hCG抗原的滴度測(cè)定曲線相似，滴度均為1∶20。

圖6 類抗體蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP結(jié)合hCG抗原 (hCG Antigen) 的活性檢測(cè)Fig.6 Determination of hCG-binding affinity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (hCG antigen from the hCG Antigen).(A) hCG-binding curve against Ag (antigen) relative concentration.(B) hCG-binding curve against log2 of Ag(antigen) relative concentration.

圖7 類抗體蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP的滴度分析Fig.7 Analysis on titer of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.

2.6 類抗體蛋白的抗原結(jié)合特異性分析

以JEG-3培養(yǎng)細(xì)胞上清液或hCGα+LHB轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清液作為抗原，以RAD/hCGBPsfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP或AntihCG-β/FITC為探測(cè)抗體，分別測(cè)定對(duì)兩種相似抗原 (hCG 和LH) 的結(jié)合特異性，結(jié)果如圖8所示，3種蛋白對(duì)hCG的結(jié)合活性均高于對(duì)LH的結(jié)合活性，差異顯著性相關(guān) (P＜0.01)，并對(duì)LH存在一定的交叉結(jié)合活性；且RAD/hCGBP- sfGFP對(duì)hCG的結(jié)合特異性相對(duì)較高。

圖8 類抗體蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP的特異性分析(**P<0.01)Fig.8 Analysis of specificity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (**P＜0.01).

2.7 類抗體蛋白的穩(wěn)定性

通過(guò)圖9A可以看出，溫度對(duì)3種蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC的穩(wěn)定性均有很大影響。在37-50 ℃內(nèi)其穩(wěn)定性較好，在70 ℃時(shí)幾乎完全喪失穩(wěn)定性。同樣，通過(guò)圖9B可以看出，pH對(duì)3種蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC的穩(wěn)定性也有很大影響。穩(wěn)定性在pH＜7的范圍內(nèi)隨pH的降低而降低，在pH為4時(shí)幾乎喪失穩(wěn)定性，在pH＞8的范圍內(nèi)穩(wěn)定性開(kāi)始下降。

圖9 類抗體蛋白R(shí)AD/hCGBP-sfGFP的穩(wěn)定性分析Fig.9 Analysis of stability of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.(A) Stability of antibody protein at different temperature conditions.(B) Stability of antibody protein at different pH conditions.

3 討論

應(yīng)用抗體/類抗體蛋白骨架制備新嫁接抗體/類抗體的技術(shù)是一種改善結(jié)合多肽的生化性能的重要手段[15]。理想的類抗體蛋白骨架具有分子量小、高水溶性和熱穩(wěn)定性等生化特征，其可以允許插入多肽、甚至更大的結(jié)構(gòu)性肽段。在本項(xiàng)工作中，我們以來(lái)源于嗜熱古菌P.furiosus的RAD蛋白骨架制備hCG結(jié)合多肽的嫁接類抗體[4]，展示了優(yōu)異的hCG結(jié)合活性，并且嫁接類抗體的生化穩(wěn)定性等均與經(jīng)典途徑制備的商業(yè)單克隆抗體相近[16-17]，暗示RAD骨架可能是一種較理想的多肽展示蛋白骨架。

應(yīng)用多肽展示技術(shù)制備抗hCG抗體的工作已有研究者進(jìn)行嘗試[18]。本研究結(jié)合前期研究對(duì)hCG結(jié)合多肽篩選工作和單域抗體通用骨架的選擇、測(cè)試工作的成果基礎(chǔ)上[19-20]，嘗試?yán)肦AD新骨架進(jìn)行多肽嫁接，獲得了具有較高抗原親和力的RAD嫁接類抗體分子。RAD嫁接類抗體蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)較好，且高度可溶，并顯示出了較高的生化穩(wěn)定性，基本繼承了原蛋白骨架優(yōu)良的生化性能，也充分說(shuō)明了RAD骨架的高度穩(wěn)定性[9]。與前期研究工作相符，RAD骨架的DNA結(jié)合L2環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以容忍序列多樣性，其置換甚至刪除均不影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。我們測(cè)定了不同條件下RAD嫁接類抗體的穩(wěn)定性，最終發(fā)現(xiàn)RAD嫁接類抗體蛋白的穩(wěn)定性未受到干擾[21]。RAD蛋白骨架的穩(wěn)定性為插入多肽片段維持較恒定的空間構(gòu)象提供了一定保障，可能是其抗原結(jié)合活性得以提高的主要因素。

在本項(xiàng)研究中，我們比較了RAD嫁接類抗體與應(yīng)用單域抗體通用骨架的嫁接抗體 (CDR1嫁接抗體和CDR3嫁接抗體) 結(jié)合hCG抗原的活性情況，發(fā)現(xiàn)RAD嫁接類抗體展示了更好的抗原結(jié)合活性。類抗體分子的抗原結(jié)合活性主要取決于所接入的多肽片段，本研究所挑選的hCG結(jié)合多肽對(duì)hCG抗原具有較高的結(jié)合特異性，但與LH存在一定的交叉結(jié)合活性，為了提高其對(duì)hCG抗原的特異結(jié)合活性，可通過(guò)進(jìn)行結(jié)合多肽的掃描突變等方法進(jìn)行嘗試。

本研究建立了一個(gè)新的嫁接類抗體制備體系，并成功制備了hCG的類抗體，有望應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)hCG水平，用于早期妊娠或腫瘤檢測(cè)。