核酸外切酶Ⅷ截短體的重組表達及其在體外DNA重組反應中的應用

朱燕，韓小韋，牛毅男，鄭蓓，李學俊，徐全樂，陳鵬

西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100

分子克隆技術(shù)通常使用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶實現(xiàn)DNA的體外克隆，載體多克隆位點有限的酶切位點和DNA分子內(nèi)部存在的酶切位點限制了該方法的通用性和可操作性[1-2]。不依賴連接酶的克隆方法 (Ligase independent cloning，LIC)即無縫克隆技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了體外DNA重組克隆的效率。LIC通過特定的DNA外切酶使兩個DNA分子產(chǎn)生可互補的單鏈末端，單鏈末端的退火推進DNA發(fā)生重組，這種重組克隆的方式不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制，使基因克隆的操作更靈活，可滿足高通量DNA克隆的需求[3-5]。

目前不依賴連接酶克隆系統(tǒng)用于形成DNA單鏈末端的酶主要有核酸外切酶Ⅲ、T4 DNA聚合酶、λ核酸外切酶等。核酸外切酶Ⅲ具有3?-5?核酸外切酶活性，已有的研究顯示，使用適量的核酸外切酶Ⅲ處理載體和片段30–60 s即可產(chǎn)生有效的末端同源臂[6]。核酸外切酶Ⅲ對存在3?單鏈末端的dsDNA無外切活性，因此由形成3?單鏈末端的限制性內(nèi)切酶 (如PstⅠ) 制備的DNA無法選擇該體系進行克隆[7]。T4 DNA聚合酶具有3?-5?核酸外切酶活性，且在dNTPs存在條件下可以催化DNA的合成，使用該酶處理目的片段和載體可產(chǎn)生5?單鏈末端，經(jīng)退火復性即可實現(xiàn)重組[8]。然而由于T4 DNA聚合酶外切活性強且具有持續(xù)性，因此容易對雙鏈DNA造成過度外切而產(chǎn)生過長的單鏈末端，長的末端容易形成二級結(jié)構(gòu)而抑制有效的重組反應[9-10]。λ核酸外切酶是一種噬菌體來源的5?-3?核酸外切酶，可使載體和目的片段產(chǎn)生3?單鏈末端促進重組反應[11]，然而λ核酸外切酶的最適底物是5?磷酸化的dsDNA，對于通過PCR制備的載體和PCR產(chǎn)物外切效率極低，因此λ核酸外切酶用于體外的重組反應時存在作用底物上的巨大局限[12-13]。除了上述酶系統(tǒng)外，大腸桿菌RecA重組系統(tǒng)也被用于體外的重組反應，該系統(tǒng)利用RecBCD的解旋酶和5?-3?外切酶活性產(chǎn)生3?單鏈末端，在RecA的作用下完成重組。但該體系不僅需要較為復雜的蛋白因子和輔因子 (如ATP等)，而且需要151 bp以上的同源區(qū)才能實現(xiàn)有效的重組，體外條件下超長的同源區(qū)不僅增加單鏈末端自身形成二級結(jié)構(gòu)的概率，同時增加引物合成的成本和出錯率[14-16]。

大腸桿菌核酸外切酶Ⅷ (Exonuclease Ⅷ，Exo Ⅷ)是一種不依賴ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶，在37 ℃的反應條件下表現(xiàn)為持續(xù)性的底物外切活性，即造成所結(jié)合的特定DNA鏈的連續(xù)外切，而在10 ℃的反應條件下對線性雙鏈DNA外切表現(xiàn)為分配性，即反應體系中形成具有較為均一長度3?單鏈的DNA。Exo Ⅷ對5?磷酸化和非磷酸化的雙鏈DNA具有相同的外切效率[17-18]。Chang等報道大腸桿菌Exo Ⅷ C端分子量約為34 kDa的截短體保留了完整的5?-3?外切酶活性，且具有與98 kDa完整酶相同的催化特性[19]。Zhang等報道在大腸桿菌中誘導表達Rac噬菌體Exo Ⅷ和RecT蛋白可以實現(xiàn)外源線性化的DNA和環(huán)狀載體在大腸桿菌體內(nèi)的高效重組，反應需要35–60 bp的同源臂[20-21]。目前Exo Ⅷ主要用于去除環(huán)狀雙鏈DNA或環(huán)狀ssDNA中的線性dsDNA，而利用Exo Ⅷ外切活性介導體外DNA重組的研究至今尚未見報道。

本研究在重組表達和純化具完整外切活性的Exo Ⅷ截短體 (Truncated exonuclease Ⅷ，tExo Ⅷ)的基礎(chǔ)上，對tExo Ⅷ介導體外重組的可行性及反應體系進行優(yōu)化，為建立基于tExo Ⅷ的高效體外重組體系奠定基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

本研究采用的菌株大腸桿菌Escherichia coliMach1 T1、BL21 Star (DE3) 以及質(zhì)粒pET28a、pYES2等均為實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂，pH 7.0) 用于培養(yǎng)大腸桿菌。

1.1.3 酶和試劑

2× IProof DNA polymerase Mix購自Bio-Rad公司；TaqDNA聚合酶、Pfu DNA polymerase購自Promega公司；NdeI、XhoI、Hind III、XbaI、T4 DNA Ligase購自Thermo Scientific公司；dNTPs購自Roche公司；Talon resin購自Clontech公司。

1.1.4 感受態(tài)細胞

參考Chung等的方法采用TSS法大量制備Mach1 T1感受態(tài)細胞[22]。采用KCM法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pUC18檢測感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率為2.2×106CFU/μg[23]。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增

根據(jù)tExo Ⅷ序列利用Primer Premier 5.0設計并合成引物序列EXO8-1和EXO8-2 (表1)，并以大腸桿菌TOP10基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建

tExo Ⅷ的PCR 擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a分別用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細胞，利用TaqDNA聚合酶，并以EXO8-1和EXO8-2為引物進行菌落PCR鑒定陽性克隆并測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-tExo Ⅷ。

1.2.3 tExo Ⅷ的表達與純化

將重組質(zhì)粒pET28a-tExo Ⅷ轉(zhuǎn)入表達菌株E.coliBL21 Star (DE3) 中，挑取單菌落接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素 (Kana) 的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。按1∶100的比例接種菌液于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為1.0，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導表達8 h。取1 mL菌液，10 000 r/min離心5 min，棄上清，同時以未加入IPTG的菌體作為對照。將菌體懸浮于100 μL SDS-PAGE上樣緩沖液中，100 ℃煮沸5 min，離心取上清，使用SDS-PAGE (分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為4%)檢測tExo Ⅷ重組蛋白的表達。

將誘導的菌體懸浮于破菌緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH 7.5) 中進行超聲波破碎，裂解液在12 000 r/min離心10 min，分別取上清和沉淀按上述方法進行SDS-PAGE分析，以檢測表達蛋白的可溶性[24]。

參考Mitsudome等的方法用鈷離子螯合層析柱 (Talon Resin，Clontech) 對目的蛋白進行分離純化[25]。洗脫的目的蛋白用截留分子量為10 kDa的超濾管進行濃縮，SDS-PAGE檢測純化蛋白的純度。蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍G250法，用牛血清白蛋白制作標準曲線。

1.2.4.tExo Ⅷ活性的測定

參照Ko等的方法[26]，酶活力單位定義為50 μL反應體系，37 ℃、30 min生成1 nmol核苷酸所需的酶量。以線性化pGEX-6P-1質(zhì)粒DNA為底物。反應體系為：冰浴條件下在PCR管中加入5 μL 10×反應緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，100 mmol/L MgSO4，10 mmol/L DTT，pH 8.0)，10 μg線性化pGEX-6P-1質(zhì)粒及純化的tExo Ⅷ并用ddH2O補充體積至50 μL，混勻，37 ℃保溫30 min。反應結(jié)束后，加1/4體積1 mol/L HCl，并用25% TCA終止反應。上清用滅菌ddH2O稀釋，測定260 nm處光吸收值。

1.2.5 tExo Ⅷ介導的體外重組反應的可行性

為驗證tExo Ⅷ進行體外重組的可行性，以經(jīng)Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切線性化的pYES2質(zhì)粒為載體，苦蕎抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白 3(Natural resistanceassociated macrophage protein 3，Nramp3)、ABC(ATP-binding cassette，ABC) 家族G11蛋白、ABC家族B1蛋白的基因片段nramp3 (1 000 bp)、g11(2 200 bp)、b1 (4 000 bp) 為克隆目標進行tExo Ⅷ介導的體外重組反應。

pYES2質(zhì)粒的制備及目的基因的PCR擴增：使用質(zhì)粒抽提試劑盒 (TIANprep Mini Plasmid Kit) 提取pYES2質(zhì)粒，經(jīng)Hind III和XbaI雙酶切后回收。用引物pYES2-Nramp3-F和pYES2-Nramp3-R擴增nramp3目的片段 (同源臂長度為21 bp)，pYES2-B1-F和pYES2-B1-R擴增b1目的片段(同源臂長度為21 bp)，分別用pYES2-G11(21)-F和pYES2-G11(21)-R、pYES2-G11(17)-F和pYES2-G11(17)-R、pYES2-G11(13)-F和 pYES2-G11(13)-R、pYES2-G11(8)-F和pYES2-G11(8)-R擴增同源臂長度分別為21、17、13、8 bp的g11目的片段。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

tExo Ⅷ介導的體外重組反應的可行性：基于前期預實驗的結(jié)果，在10 μL的重組體系中加入2.5 U的tExo Ⅷ即可完成有效的重組。按照載體和重組基因片段摩爾比值1∶3的比例取對應量的線性化載體pYES2 (5 856 bp) 和nramp3 (1 000 bp)，加入5 μL 含有 tExo Ⅷ的重組反應液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，40 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2，2.5 U tExo Ⅷ)，用ddH2O補足體系至10 μL后進行重組反應。分別在25 ℃、30 ℃外切反應10 min，重組反應液冰浴后用KCM法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細胞[23]，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評價重組的可行性。PCR鑒定采用基因特異性引物進行。每個重組反應至少重復3次。

1.2.6 體外同源臂延伸對于重組效率的影響

參考1.2.5的方法和體系，在重組反應體系中添加dNTPs和PfuDNA 聚合酶，形成在體外條件下單鏈同源臂區(qū)的延伸，即按照載體和重組基因片段摩爾比值1∶3的比例取對應量的線性化載體pYES2 (5 856 bp) 和nramp3 (1 000 bp)，加入5 μL含有tExo Ⅷ的重組反應液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，40 mmol/L KCl，500 μmol/L dNTPs，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2，2.5 U tExo Ⅷ，1 U Pfu DNA聚合酶)，用ddH2O補足體系至10 μL后進行重組反應。分別在25 ℃、30 ℃外切反應10 min后，50 ℃保溫50 min延伸同源臂。重組反應液經(jīng)冰浴后使用KCM法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細胞[23]，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評價重組效率，每個重組反應至少重復3次。

1.2.7 外切反應溫度對重組效率的影響

參考1.2.6的重組反應體系，分別在0 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃外切反應10 min后，50 ℃保溫50 min延伸同源臂。重組反應液冰浴后用KCM法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細胞[23]，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評價重組效率，每個重組反應至少重復3次。

1.2.8 外切反應時間對重組效率的影響

參考1.2.6的反應體系，分別在25 ℃、30 ℃外切反應5、7.5、10、12.5 min，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細胞，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評價重組效率。

1.2.9 基因片段大小對體外重組反應效率的影響

參考1.2.6的反應體系，在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反應條件下將載體和目的片段按摩爾比值1∶3的比例取對應量的線性化載體pYES2(5 856 bp)，分別與nramp3 (1 000 bp)、g11 (2 200 bp)、b1 (4 000 bp)基因片段進行重組反應，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細胞，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評價重組效率。每個重組反應至少重復3次。

1.2.10 同源臂長度對重組效率的影響

將載體和目的片段按摩爾比值1∶3的比例取對應量的線性化載體pYES2和純化的同源臂長度分別為21、17、13、8 bp的g11目的片段，參考1.2.6的反應體系和條件進行重組反應，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細胞，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評價重組效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Exo Ⅷ截短體基因的擴增和重組表達載體的構(gòu)建

以EXO8-1和EXO8-2為引物擴增目的基因tExoⅧ，電泳結(jié)果顯示約為900 bp的單一條帶 (圖1A)，大小與預期基因片段大小相符。

使用NdeI、XhoI對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示分別為約5 300 bp的載體及約900 bp的目的基因條帶 (圖1B)，與預期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示構(gòu)建的表達載體正確，將其命名為pET28a-tExo Ⅷ。

2.2 tExo Ⅷ表達與純化

重組質(zhì)粒pET28a-tExo Ⅷ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star (DE3)，0.8 mmol/L IPTG誘導8 h的菌體經(jīng)超聲細胞破碎，上清液通過鈷離子螯合層析進行純化。SDS-PAGE檢測誘導的菌體及純化蛋白，如圖2所示，誘導的菌體較未誘導的樣品在約38 kDa位置出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與tExo Ⅷ蛋白的理論分子量大小一致，經(jīng)鈷離子柱純化獲得與之分子量一致的單一條帶。每升誘導的菌液可純化92.40 mg的tExo Ⅷ，比活力為1.21×105U/mg。

2.3 tExo Ⅷ介導體外重組反應的可行性

圖1 Exo Ⅷ截短體基因的克隆(A)及pET28a-tExoⅧ重組載體的雙酶切鑒定(B)Fig.1 PCR amplification of truncated Exo Ⅷ gene (A)and double digestion of pET28a-tExo Ⅷ (B).(A) M:DL2000 DNA marker;1:PCR product of tExo Ⅷ.(B) M:DL2000 DNA marker;1,2:double digested pET28atExo Ⅷ.

圖2 tExo Ⅷ表達與純化的SDS-PAGE分析Fig.2 Expression and purification of tExo Ⅷanalyzed by SDS-PAGE.M:protein marker;1:purified tExo Ⅷ;2:induced cells containing pET28a-tExo Ⅷ;3:non-induced cells containing pET28a-tExo Ⅷ.

以同源臂長度為21 bp，1 kbnramp3基因為插入片段，25 ℃、30 ℃外切反應10 min，每微克載體可分別形成2 640、5 181個克隆，陽性率檢測顯示均達到80%。結(jié)果表明tExo Ⅷ介導的體外重組反應存在有效性和可行性。

2.4 體外同源臂延伸及反應溫度和時間對重組效率的影響

2.4.1 體外同源臂延伸對tExo Ⅷ重組效率的影響

以同源臂長度為21 bp，1 kbnramp3基因為插入片段，25 ℃、30 ℃外切反應10 min后，利用Pfu DNA聚合酶的聚合活性，50 ℃反應50 min進行同源臂同源匹配區(qū)的延伸，每微克載體可分別形成10 164、8 346個克隆，陽性率檢測顯示均大于80%。結(jié)果說明添加Pfu DNA聚合酶可以有效提高tExoⅧ介導體外重組的效率?；诖私Y(jié)果，后續(xù)僅對于tExo Ⅷ外切反應的時間和溫度進行優(yōu)化。

2.4.2 tExo Ⅷ外切反應溫度對重組效率的影響

使用0–37 ℃的外切反應溫度及后續(xù)50 ℃、50 min的保溫進行重組反應，結(jié)果顯示各重組條件下均具有較高的陽性率，進一步說明利用tExo Ⅷ進行體外DNA重組反應的可行性。在0–30 ℃范圍內(nèi)，隨著外切反應溫度的升高重組效率持續(xù)增加，并且均具有較高的陽性率 (表2)。而在37 ℃外切反應10 min，重組反應的效率明顯下降。結(jié)果表明tExoⅧ用于重組反應時適宜的外切反應溫度范圍為25–30 ℃。

2.4.3 外切反應時間對重組效率的影響

在25 ℃、30 ℃溫度下使用不同外切反應時間進行重組轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示在不加入50 ℃退火反應的快速重組中，反應條件為25 ℃ 12.5 min、30 ℃10 min時重組效率最高 (表3)。在這兩種條件下后續(xù)進行50 ℃、50 min的同源臂延伸，結(jié)果顯示外切反應條件為25 ℃ 12.5 min時重組效率最高，說明tExo Ⅷ介導的體外重組體系較為適宜的反應條件為在25 ℃下反應10–12.5 min。

表2 不同外切反應溫度對tExo Ⅷ介導的重組克隆效率的影響Table 2 Effect of different reaction temperatures on tExo Ⅷ-mediated recombinant cloning efficiency (per μg of vector)

表3 不同外切反應時間對tExo Ⅷ介導的重組克隆效率的影響Table 3 Effect of different reaction duration on tExo Ⅷ-mediated recombinant cloning efficiency (per μg of vector)

2.4.4 基因片段大小對體外重組反應效率的影響

為了分析基于tExo Ⅷ的體外重組體系對不同長度基因片段重組效率的差異，在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反應條件下使用nramp3 (1 000 bp)、g11 (2 200 bp)、b1 (4 000 bp) 三種不同大小的基因片段進行重組克隆。結(jié)果顯示tExo Ⅷ介導的體外重組體系對于上述基因均可實現(xiàn)有效克隆，且體系對于nramp3及g11的重組效率較b1基因高，表現(xiàn)出隨著片段長度的增加克隆效率下降的趨勢 (表4)。

表4 tExo Ⅷ介導的體外重組體系對不同長度DNA片段的克隆效率Table 4 Cloning efficiency of tExo Ⅷ mediated in vitro recombination for different DNA sizes (per μg of vector)

2.4.5 同源臂長度對重組反應的影響

使用同源臂長度分別為21、17、13、8 bp的g11基因片段和pYES2線性化載體在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反應條件下進行重組反應，以探究同源臂長度對于重組克隆效率的影響。結(jié)果如表5所示，隨著同源臂長度的增加重組效率增加，同源臂長度為21、17 bp時重組效率最高且無顯著性差異。同源臂長度為8 bp時仍可形成有較高陽性率的克隆，降低后續(xù)同源臂延伸的反應溫度至40 ℃可提高重組效率 (表5)。

3 討論

不依賴于連接酶的無縫克隆技術(shù)的發(fā)展大大加速了基因克隆的效率和操作通量?，F(xiàn)有的體外重組系統(tǒng)依賴于核酸外切酶Ⅲ、T4 DNA聚合酶、λ核酸外切酶等形成單鏈的同源重組臂[6-9,11-13]。其中，核酸外切酶Ⅲ是3?-5?核酸外切酶，其優(yōu)選底物是平末端或3?凹陷末端，而對于存在四堿基或更長的3?單鏈末端的DNA分子無活性[7]，λ核酸外切酶對5?去磷酸化的雙鏈DNA表現(xiàn)出低的外切效率 (約為5?磷酸化底物的20%)[27]，T4 DNA聚合酶具有超強外切酶活性，在形成單鏈的同源重組臂時必須精確控制反應溫度和時間等以防止酶切過度。鑒于上述原因?qū)е卢F(xiàn)有的體外重組體系不同批次的克隆操作效率存在巨大差異，因此拓展新的外切酶種類用于體外重組反應中單鏈同源臂的形成具有重要的實踐價值。

表5 同源臂長度對g11重組克隆效率的影響Table 5 Effect of homology arm lengths on the recombinant cloning efficiency of g11 (per μg of vector)

Exo Ⅷ是一種不依賴于ATP的5?-3?核酸外切酶，在10 ℃的反應條件下對線性雙鏈DNA的外切呈分配性，能有效外切具有長達250個核苷酸的5?單鏈末端的DNA分子，其對底物的識別不依賴于雙鏈DNA的5?磷酸基團，且對具5?單鏈末端、平末端、3?單鏈末端的雙鏈底物能以較為一致的效率進行外切，這些特性使Exo Ⅷ非常適合于體外DNA重組中均一單鏈同源臂的形成[18]。Exo Ⅷ是體外DNA重組反應極具應用價值的候選蛋白，但迄今為止關(guān)于Exo Ⅷ用于體外重組的研究尚未有文獻報道。已有文獻報道Exo Ⅷ的C末端結(jié)構(gòu)域有著完整的核酸外切酶活性[19]，本研究克隆了保留完整外切活性的Exo Ⅷ截短基因 (tExo Ⅷ)，并實現(xiàn)了其在大腸桿菌內(nèi)的重組表達。tExo Ⅷ表達量可達92.40 mg/L，純化酶的比活力可以達到1.21×105U/mg，按照本研究建立的體系可以用于超過300萬次的重組反應。

圖7 Exo Ⅷ介導的同源重組體系示意圖Fig.7 Diagram of the homologous recombination system mediated by Exo Ⅷ.

在本研究的重組體系中，引入促進體外同源臂延伸的新策略 (圖7)，25 ℃保溫條件下Exo Ⅷ外切雙鏈DNA可能形成長于設計的同源單鏈區(qū)，不同來源的同源單鏈區(qū)退火形成局部的雙鏈，在重組體系中含有的PfuDNA聚合酶的作用下，50 ℃、50 min的保溫可以使PfuDNA聚合酶以互補區(qū)域存在的兩個3′端為起始點，催化兩個片段同源重組互補區(qū)長度的增加，使后續(xù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌時同源雙鏈區(qū)更加穩(wěn)定，更有利于轉(zhuǎn)入宿主細胞后進行缺刻質(zhì)粒的修復。本研究結(jié)果證明促進同源臂穩(wěn)定的匹配是提高重組效率的有效途徑。在同源臂僅為8 bp的條件下進行重組反應，降低后續(xù)同源臂延伸的溫度可以有效地提高克隆的效率，其主要原因是在50 ℃條件下延伸時，8 bp的同源區(qū)相互匹配的效率較低，造成同源臂的有效延伸下降，在保障充分的延伸時間條件下，降低延伸溫度可以提升同源臂延伸的有效性。感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率是影響體外重組克隆的重要因素。本研究利用實驗室自制的轉(zhuǎn)化效率僅為2.2×106CFU/μg的感受態(tài)細胞即可實現(xiàn)高效的克隆，充分說明本研究體系的有效性。利用商業(yè)化的轉(zhuǎn)化效率為1.0×108CFU/μg的感受態(tài)細胞進行重組轉(zhuǎn)化，其形成的有效克隆數(shù)增加5–13倍 (以同源臂長度為21、17、13 bp的1 kbnramp3基因為插入片段，每微克載體形成的平均克隆數(shù)分別為127 842、75 233、51 036)；另外研究中也嘗試利用Exo Ⅷ介導體外DNA重組克隆體系進行多種類型 載體和不同基因的克隆，均顯示出高效性 (結(jié)果未顯示)。

本研究首次報道和應用Exo Ⅷ于體外的DNA重組克隆體系，具有簡便高效的顯著特征。