流感嗜血桿菌快速檢測(cè)膠體金試紙的研制

陶冶，郝惠文，李杰，王猛，王毅,2,3，張改平，胡征,2,3

1 湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068

2 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (湖北工業(yè)大學(xué))，湖北 武漢 430068

3 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068

4 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002

流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae，簡(jiǎn)寫H.influenzae)是一種革蘭氏陰性桿菌，是感染人類的一種重要的呼吸道病原微生物，根據(jù)有無莢膜可將其分類為莢膜型和無莢膜型，其中莢膜型又可分為a-f 6個(gè)血清型，無莢膜型只有一種不可分型流感嗜血桿菌，其中b型流感嗜血桿菌 (Hib)是5歲以下兒童細(xì)菌性腦膜炎和其他侵入細(xì)菌性疾病的主要原因[1]。目前世界范圍內(nèi)開展的H.influenzae血清學(xué)檢查大多也只針對(duì)侵襲力較強(qiáng)的莢膜b型。而由于該型菌株莢膜多糖疫苗的成功研發(fā)與應(yīng)用，其流行已被有效控制。近年來研究顯示，不可分型流感嗜血桿菌 (NTHi) 是目前引起多種上呼吸道疾病和下呼吸道疾病的主要致病菌之一[2]，能引起包括急性中耳炎[3]、肺炎、支氣管炎[4]、慢性阻塞性肺疾病和結(jié)膜炎[5]等疾病。此外，NTHi的發(fā)病率正逐年增加，其臨床分離率已達(dá)50%以上[6]。因此對(duì)這兩種H.influenzae菌株同時(shí)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，在感染早期進(jìn)行診斷干預(yù)更具臨床意義。

目前常見的H.influenzae檢測(cè)方法主要有3類：血清學(xué)檢測(cè)法[7]、核酸檢測(cè)法[8]和病原體直接檢測(cè)法[9]。其中血清學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)標(biāo)的物為抗莢膜抗體，無法檢測(cè)出沒有莢膜的NTHi；核酸檢測(cè)需要特殊試劑及設(shè)備；病原體直接檢測(cè)法操作復(fù)雜、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)。因此這3類方法難以滿足臨床快速簡(jiǎn)便精準(zhǔn)檢測(cè)需求。為了解決H.influenzae的檢測(cè)，急需建立一種高靈敏度和高特異性的檢測(cè)方法。膠體金免疫層析試紙快速檢測(cè)技術(shù)具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、特異、無需特殊設(shè)備及試劑、結(jié)果判定直觀等優(yōu)點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用[10]。本研究根據(jù)膠體金免疫層析原理，基于針對(duì)流感嗜血桿菌特異性的表面蛋白胞外暴露區(qū)的高親和力抗體，建立了一套H.influenzae的快速檢測(cè)方法，為呼吸道感染的臨床快速檢測(cè)提供了初步的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

重組工程菌pET-28a(+)-P6，由本實(shí)驗(yàn)室趙可勝構(gòu)建；感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌Escherichia coliRosetta購(gòu)自TaKaRa公司。流感嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC 49247) 及本實(shí)驗(yàn)涉及到的4種病原菌株肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae，ATCC 25238)、嗜肺軍團(tuán)菌 (Legionella pneumophila，ATCC 33152)、肺炎支原體 (Mycoplasma pneumoniae，ATCC 15531)、卡他莫拉菌 (Moraxella catarrhalis，ATCC 49619) 均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；金黃色(Staphylococcus aureus) 葡萄球菌由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；其他病原菌株：肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumonia)、產(chǎn)酸克雷伯菌 (Klebsiella oxytosus)、鮑曼不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter baumannii)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 均由湖北省武警總醫(yī)院提供。

1.1.2 主要設(shè)備、試劑及層析試紙條耗材

無標(biāo)記分子相互作用儀購(gòu)自ForteBio公司；IPTG、BSA購(gòu)自Biosharp公司；二水合檸檬酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四水合氯金酸購(gòu)自Sigma公司；羊抗兔IgG購(gòu)自武漢飛羿科技有限公司；硝酸纖維素膜 (CN140) 購(gòu)自Sartorius公司；玻璃纖維膜 (CB08)、吸水紙 (CH37K)、PVC板 (SM31-40) 購(gòu)自上海良信科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人流感嗜血桿菌P6抗原的制備

流感嗜血桿菌P6蛋白胞外結(jié)構(gòu)域單一線性表位抗原的制備：經(jīng)生物信息學(xué)分析 (表面可及性預(yù)測(cè)及線性表位預(yù)測(cè)均由武漢百意欣生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)服務(wù))，選定人流感嗜血桿菌P6蛋白 (GenBank登錄號(hào)：AGH02799.1) V62-E75位的14個(gè)氨基酸組成的短肽作為制備兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白的線性抗原表位，該段氨基酸序列為VLVEGNTDERGTPE (P6Line)。在氨基酸序列的N端添加1個(gè)半胱氨酸后，用多肽自動(dòng)合成儀合成多肽并純化，純化后的多肽與載體蛋白KLH (Keyhole limpet hemocyanin，鑰孔血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)，形成P6Line-KLH復(fù)合蛋白。

流感嗜血桿菌P6-His融合蛋白的制備：將重組工程菌E.colipET-28a-P6接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至吸光度OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，18 ℃、170 r/min誘導(dǎo)過夜，收集菌體，超聲破碎后取沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。取超聲破碎上清液用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過濾后用His Trap親和層析柱 (GE公司) 進(jìn)行純化，按照說明書分步收集洗脫液，各取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.2 抗人流感嗜血桿菌外膜蛋白P6多克隆抗體的制備和純化

將2只新西蘭大白兔分別免疫P6Line-KLH復(fù)合蛋白和P6-His融合蛋白，具體免疫方法如下：將抗原蛋白與佐劑以1∶1 (V/V) 混合，總體積0.5 mL，抗原量1 mg，使用S10高速分散器將抗原充分乳化，乳化后分別在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射3次，每次間隔7-10 d，除初次免疫使用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫均使用弗氏不完全佐劑，第3次注射10-12 d后，分別收集、分離得到含有流感嗜血桿菌P6蛋白抗體的血清，分別記為P6蛋白胞外結(jié)構(gòu)域單一線性表位抗體 (AbP6Line)和P6融合蛋白多克隆抗體 (AbP6-His)，ELISA檢測(cè)血清中兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體的效價(jià)，效價(jià)均可達(dá)到1∶512 000以上。

AbP6Line的純化：采用GE公司的rProtein A親和層析柱，按照其說明書收集洗脫液，以磷酸鹽為緩沖體系經(jīng)超濾更換緩沖液后，使用SMART-LIFESCIENCES公司的PabPur Sulfolink Beads多肽親和層析柱，按照其說明書偶聯(lián)肽鏈P6Line。經(jīng)蛋白A親和純化后的抗體再次進(jìn)行肽鏈親和純化，得到高純度AbP6Line。

AbP6-His的純化：采用GE公司的rProtein A親和層析柱，按照其說明書收集洗脫液，以磷酸鹽為緩沖體系超濾濃縮。超微量分光光度計(jì)測(cè)濃度定量，分裝后貼上標(biāo)簽，使用離心凍干機(jī)凍至干粉狀態(tài)，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)及鑒定

分別以純化的P6-His融合蛋白和P6Line-KLH為包被抗原，羊抗兔IgG-HRP為酶標(biāo)二抗，用間接ELISA方法測(cè)定2種抗體的效價(jià)[11]。結(jié)果判定方法，S/N=待檢樣品OD450/陰性對(duì)照OD450。S/N＞2.1為陽性。以S/N＞2.1所對(duì)應(yīng)的抗體最高稀釋倍數(shù)作為該抗體的效價(jià)。

生物膜干涉技術(shù) (BLI) 檢測(cè)：采用無標(biāo)記分子相互作用儀分別對(duì)純化后的AbP6Line和AbP6-His抗體進(jìn)行抗原抗體相互作用力檢測(cè)。將兩種抗體分別固化到AMC傳感器上，再浸入含分析物 (P6重組抗原) 的緩沖液中進(jìn)行結(jié)合，濃度梯度分別為1 000 nmol/L、500 nmol/L、250 nmol/L、125 nmol/L、61.25 nmol/L。然后浸入緩沖溶液中進(jìn)行解離，并利用分子互作儀的分析軟件得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)。利用GraphPad Prism 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理生成結(jié)合解離曲線。

采用Western blotting對(duì)純化后的2種抗體進(jìn)行鑒定：離心收集H.influenzae菌體，經(jīng)超聲破碎、離心，分別收集菌體上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，得到H.influenzae菌體超聲破碎上清和沉淀蛋白條帶，轉(zhuǎn)至PVDF膜，將制備的2種多克隆抗體分別作為一抗孵育，以HRP標(biāo)記的羊抗兔為二抗，通過ECL化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯影。

1.2.4 免疫層析試紙條的制備

膠體金結(jié)合墊的制備：采用檸檬酸鈉還原法[10]制備40 nm的膠體金顆粒。取1 mL制備好的膠體金加2 μL的0.2 mol/L K2CO3調(diào)pH至8.0，1 mL膠體金標(biāo)記4 μg AbP6Line，標(biāo)記好后離心重懸至100 μL，以8 μL/cm噴涂于玻璃纖維膜上，37 ℃鼓風(fēng)干燥箱放置1 h以上。

檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被：將P6融合蛋白多克隆抗體和羊抗兔IgG分別稀釋至2 mg/mL和1 mg/mL，以1 μL/cm通過噴金劃膜儀在硝酸纖維素膜上劃線，分別作為檢測(cè)線 (T線) 和質(zhì)控線(C線)，37 ℃鼓風(fēng)干燥箱放置12 h以上。

免疫層析試紙條的組裝：將樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙依次貼在PVC底板上，用斬切機(jī)將試紙切割成0.4 cm的試紙條，然后與干燥劑封裝在鋁箔袋內(nèi)。

1.2.5 測(cè)試方法與判定標(biāo)準(zhǔn)

將待檢樣品溶于生理鹽水 (0.85% NaCl溶液)，取150 μL滴在樣品墊上，層析15 min后判斷結(jié)果。若C線和T線均出現(xiàn)條帶，則結(jié)果為陽性，若C線有條帶且T線無條帶，則結(jié)果為陰性，若C線和T線均無條帶，說明試紙條失效，結(jié)果無效。

1.2.6 試紙條的質(zhì)量測(cè)試

特異性測(cè)試：用試紙條分別檢測(cè)流感嗜血桿菌H.influenzae、肺炎鏈球菌S.pneumoniae、嗜肺軍團(tuán)菌L.pneumophila、肺炎支原體M.pneumonia、卡他莫拉菌M.catarrhalis、金黃色葡萄球菌S.aureus、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae、產(chǎn)酸克雷伯菌K.oxytoca、鮑曼不動(dòng)桿菌A.baumannii、銅綠假單胞菌P.aeruginosa十種呼吸道常見病原菌稀釋液 (10 mmol/L PBS將菌體濃度稀釋至1×108CFU/mL)，鑒定試紙條的特異性。

靈敏性測(cè)試：將流感嗜血桿菌用10 mmol/L PBS分別稀釋至1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/mL，以能觀察到陽性結(jié)果的最低菌濃度為試紙條的檢測(cè)極限。

穩(wěn)定性和重復(fù)性測(cè)試：將3個(gè)不同批次的試紙條置于25 ℃儲(chǔ)存6個(gè)月，每隔30 d用陽性樣本和陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)，且每個(gè)樣本檢測(cè)3次以觀察重復(fù)性。

1.2.7 試紙條的初步臨床應(yīng)用

用所制備的流感嗜血桿菌的膠體金試紙條對(duì)采集的湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的200份病人咽拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用平板培養(yǎng)法做平行試驗(yàn)，比較兩者的符合率情況，評(píng)價(jià)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組P6抗原的制備和純化

重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取表達(dá)前菌液、表達(dá)后菌液、表達(dá)后菌體超聲破碎上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，如圖1所示，可看到約在分子量14 kDa處出現(xiàn)表達(dá)條帶，與預(yù)期大小一致，表明表達(dá)產(chǎn)物為rP6蛋白，且部分可溶，取超破上清經(jīng)鎳柱親和純化，目標(biāo)蛋白在100 mmol/L咪唑濃度的洗脫液中純度達(dá)到90%以上 (圖1)，測(cè)定濃度后離心凍干得到10 mg純蛋白。

2.2 抗人流感嗜血桿菌外膜蛋白P6多克隆抗體的純化

AbP6Line經(jīng)A蛋白親和純化、肽鏈親和純化，AbP6-His經(jīng)A蛋白親和純化分別得到AbP6Line純抗體5.69 mg、AbP6-His純抗體268.29 mg，純度均達(dá)到90%以上。

2.3 抗人流感嗜血桿菌外膜蛋白P6多克隆抗體的鑒定

用間接ELISA方法測(cè)定2種抗體的效價(jià)，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)用倍比稀釋法將待檢抗體稀釋512 000倍時(shí)，AbP6Line和AbP6-His的S/N值分別為4.46、4.65，均大于2.1，則判定為陽性結(jié)果。因此兩種待測(cè)抗體的效價(jià)均達(dá)到1∶512 000。

圖1 P6-His融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果Fig.1 Expression and purification of recombinant protein P6-His.M：protein marker;1：negative control;2：recombinant P6 expression after 4 h IPTG induction;3：supernatant collected from ultrasound disrupted E.coli;4：precipitation collected from ultrasound disrupted E.coli;5：penetrating fluid;6：eluent with 20 mmol/L imidazole;7：eluent with 40 mmol/L imidazole;8：eluent with 100 mmol/L imidazole.

圖2 間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)Fig.2 Determination of antibody titer by indirect ELISA.(A) P6-Line complex protein antiserum titer.(B)P6-His recombinant protein antiserum titer.

采用無標(biāo)記分子相互作用儀分別對(duì)純化后的AbP6Line和AbP6-His抗體進(jìn)行抗原抗體相互作用力檢測(cè)，結(jié)果見圖3和表1。由曲線可看出，2種抗體分別與抗原相互作用，結(jié)果顯示相互作用力均在108以上，有較好的親和力[12]。表中KD值為解離速率常數(shù) (kdis) 和結(jié)合速率 (kon)比值，解離速率在10-4，說明抗原抗體結(jié)合得很穩(wěn)定，解離常數(shù)越小，KD越??；而KD值越小則抗原抗體的相互作用力越強(qiáng)；R2＞0.9，說明擬合曲線與實(shí)際曲線擬合度高，數(shù)據(jù)更有說服性；由此可得2種抗體均有較好的親和力。

Western blotting鑒定AbP6Line結(jié)果見圖4，泳道1和泳道2在17 kDa以下均出現(xiàn)一條清晰條帶，與Hi天然表面蛋白P6的分子量 (約16 kDa)吻合，且沒有其他雜帶，表明AbP6Line能夠高特異性識(shí)別天然Hi抗原。

圖3 生物膜干涉技術(shù) (BLI) 檢測(cè)抗體親和力Fig.3 Detection of antibody affinity by Bio-layer interference (BLI).(A) AbP6Line binding and dissociation curves.(B) AbP6-His binding and dissociation curves.

表1 生物膜干涉技術(shù) (BLI) 檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 1 Data results of Bio-layer interference (BLI) test

圖4 Western blotting鑒定AbP6LineFig.4 Identification of AbP6Line by Western blotting.M：protein marker;1：supernatant of H. influenzae after ultrasonication;2：recipitation of H. influenzae after ultrasonication.

Western blotting鑒定AbP6-His結(jié)果見圖5，泳道1、2、3在17 kDa以下出現(xiàn)條帶，根據(jù)分子量大小確定泳道1中條帶為rP6-His重組蛋白 (約14 kDa)，泳道2、3中為Hi天然P6蛋白 (約16 kDa)，表明AbP6-His能夠識(shí)別天然Hi抗原。

2.4 特異性測(cè)試

檢測(cè)流感嗜血桿菌的試紙條，C線和T線均出現(xiàn)條帶，結(jié)果為陽性；其他呼吸道常見病原菌，如肺炎鏈球菌S.pneumoniae、嗜肺軍團(tuán)菌L.pneumophila、肺炎支原體M.pneumonia、卡他莫拉菌M.catarrhalis、金黃色葡萄球菌S.aureus、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae、產(chǎn)酸克雷伯菌K.oxytoca、鮑曼不動(dòng)桿菌A.baumannii、銅綠假單胞菌P.aeruginosa檢測(cè)結(jié)果均為陰性 (圖6)，說明制備的流感嗜血桿菌檢測(cè)試紙條具有較高的特異性。

圖5 Western blotting鑒定AbP6-HisFig.5 Identification of AbP6-His by Western blotting.M：protein marker;1：recombinant proteinP6-His;2：supernatant of H. influenzae after ultrasonication;3：precipitation of H. influenzae after ultrasonication.

圖6 流感嗜血桿菌膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測(cè)Fig.6 Specificity test of H. influenzae colloidal gold immunochromatography strip.

2.5 靈敏性測(cè)試

當(dāng)樣本中菌濃度稀釋至1×105CFU/mL時(shí)，T線上出現(xiàn)一條較弱的紅帶，繼續(xù)稀釋樣本進(jìn)行檢測(cè)，僅在C線上出現(xiàn)紅帶，說明在流感嗜血桿菌的連續(xù)稀釋液中，試紙條的檢出限為1×105CFU/mL，結(jié)果見圖7。

2.6 穩(wěn)定性和重復(fù)性測(cè)試

將試紙條置于25 ℃儲(chǔ)存6個(gè)月后取出，對(duì)流感嗜血桿菌進(jìn)行檢測(cè)，其特異性和靈敏性都沒有發(fā)生明顯變化，且平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

2.7 初步臨床應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

2017年11月至2018年2月對(duì)湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科所采集的200份病人咽拭子臨床樣品，如表2，采用所制備的流感嗜血桿菌膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出57份陽性樣品，平板培養(yǎng)法檢出的陽性樣品為63份，二者陽性符合率為90.5%。

3 討論

圖7 流感嗜血桿菌膠體金免疫層析試紙條的靈敏度檢測(cè)Fig.7 Sensitive test of H. influenzae colloidal gold immunochromatography strip.1-6：represents the concentration of H. influenzae：1×109 CFU/mL,1×108 CFU/mL,1×107 CFU/mL,1×106 CFU/mL,1×105 CFU/mL,1×104 CFU/mL;7：negative control.

表2 流感嗜血桿菌膠體金免疫層析試紙條的初步臨床檢測(cè)結(jié)果Table 2 Preliminary clinical test results of Haemophilus influenzae colloidal gold immunochromatographic test strip

流感嗜血桿菌是一種可引起人類嚴(yán)重呼吸道疾病的病原微生物，其主要致病型為Hib和NTHi[13]。因此，開發(fā)用于有效檢測(cè)兩種不同流感嗜血桿菌菌株的方法十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，P6蛋白是一種肽聚糖偶聯(lián)的脂蛋白，在所有H.influenzae菌株間均有表達(dá)，其具有種屬特異性、廣譜表達(dá)性和充分的表面暴露性[14]，且在一些臨床樣本中P6蛋白序列或基因序列都具有高度保守性[15-16]，因此本研究確定以P6蛋白作為H.influenzae的檢測(cè)標(biāo)的物。

在本研究中，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)P6蛋白胞外結(jié)構(gòu)域單一線性表位抗原決定簇，選定一條由14個(gè)氨基酸序列組成的短肽作為線性表位抗原，免疫得到兔抗血清，經(jīng)A蛋白親和純化、免疫親和純化得到純抗體，間接ELISA測(cè)定效價(jià)均達(dá)到1∶512 000，且通過生物膜干涉技術(shù) (BLI)驗(yàn)證均有較高親和力，同時(shí)Western blotting鑒定其與天然H.influenzae抗原結(jié)合特異性強(qiáng)，條帶單一，達(dá)到單克隆抗體的效果。將AbP6Line作為金標(biāo)抗體、AbP6-His作為捕獲抗體，形成雙抗體夾心，制備免疫層析檢測(cè)試紙條，具有良好的靈敏度和特異性，此外，用本實(shí)驗(yàn)所制備的流感嗜血桿菌膠體金試紙條和平板培養(yǎng)法同時(shí)對(duì)200份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果兩者陽性符合率為90.5%。本研究建立的雙抗夾心免疫層析法可在15 min內(nèi)得到準(zhǔn)確結(jié)果，相較于其他傳統(tǒng)檢測(cè)流感嗜血桿菌的方法，具有快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏的特點(diǎn)，不需要專業(yè)人員的培訓(xùn)和昂貴的儀器設(shè)備，可進(jìn)行床旁檢測(cè)，尤其適用于醫(yī)院對(duì)吸道感染病人的實(shí)時(shí)診斷，有助于精準(zhǔn)檢測(cè)及精準(zhǔn)治療，有利于解決抗生素濫用等問題，具有廣闊的應(yīng)用前景。