• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬miR-331-3p過表達載體的構建及其對細胞增殖的影響

    2019-06-11 08:34:52陳濤馬立霞崔景香耿進紅曾勇慶陳偉
    生物工程學報 2019年5期
    關鍵詞:細胞周期抑制劑試劑盒

    陳濤,馬立霞,崔景香,耿進紅,曾勇慶,陳偉

    1 山東農業(yè)大學 動物科技學院,山東 泰安 271018

    2 山東農業(yè)大學 山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室,山東 泰安 271018

    3 濰坊科技學院,山東 濰坊 262700

    miRNA是長度為18–24 nt的短序列的單鏈非編碼RNA,在進化上具有高度的保守性,主要通過調控基因表達的水平起作用。許多研究已表明,miRNA主要通過與靶基因的3? UTR互補配對,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯[1],實現(xiàn)對基因表達水平的調控,從而參與細胞的增殖、分化、凋亡和代謝等許多生物學過程[2-3]。

    miR-331-3p是一種在各種物種中高度保守的miRNA,目前研究發(fā)現(xiàn)miR-331-3p在癌細胞的增殖分化以及癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4],在功能上具有多種作用。miR-331-3p可以靶向作用于細胞周期相關基因E2F1(E2F transcription factor 1),具有抑制胃癌細胞生長和克隆的形成的能力[5]。研究發(fā)現(xiàn),miR-331-3p的受體lncRNA-HOTAIR參與調節(jié)人表皮生長因子受體 2 (Glutamyl-tRNA (Gln) amidotransferase subunit HER2,HER2)的去阻遏,并強化額外水平的轉錄后調控可降低HER2蛋白的表達,進而降低胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。ING5是一個腫瘤抑制基因,抑制細胞生長并且誘導細胞凋亡。miR-331-3p能夠通過抑制ING5表達促進肝癌(HCC) 細胞的增殖[7]。綜上所述,miR-331-3p一直被認為是一種腫瘤相關因子,本身的作用也具有多樣性,但這些研究都僅限于人類的癌癥細胞中,miR-331-3p對于其他物種或細胞的作用研究很少。

    豬是人類重要的肉食來源,其自身生長受多種因素的影響。miRNA作為目前較熱門的研究領域,已經(jīng)有很多研究表明miRNA在豬生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,例如miR-1、miR-133和miR-206都是肌肉特異性的miRNA,在肌肉形成過程中起著關鍵作用[8],但是miR-331-3p在豬細胞增殖方面的研究鮮有報道。豬腎上皮細胞系即PK15細胞,是一種常見的細胞系,對于豬圓環(huán)病毒 (PCV)、豬細小病毒 (PPV) 和豬瘟病毒(CSFV) 等多種病毒比較敏感,現(xiàn)已廣泛應用于豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬細小病毒等的分離、體外培養(yǎng)以及相關疫苗的生產(chǎn)中,具有非常重要的作用[9]。因此,本研究選取PK15細胞作為研究對象,通過研究miR-331-3p對PK15細胞增殖的影響,為進一步探討miR-331-3p在豬生長發(fā)育中的作用機制奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料及主要試劑

    豬腎上皮細胞 (PK15)、pcDNA 3.1(+) 哺乳動物表達載體均由實驗室保存。萊蕪豬耳組織采于萊蕪豬原種場;DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰酶、胎牛血清 (Fetal bovine serum,F(xiàn)BS) 均購于Gibco公司 (美國);青鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司(中國北京);反轉錄和熒光定量試劑購于TaKaRa(中國大連)。CCK-8試劑盒購于碧云天生物技術有限公司 (中國上海);微量RNA提取試劑盒購于Omega Bio-Tek (美國);細胞周期與凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司 (中國上海);miR-331-3p inhibitor和miR-331-3p NC購于上海吉瑪制藥技術有限公司 (中國上海);T4 DNA連接酶、KpnⅠ內切酶和XbaⅠ內切酶均購于Thermo Scientific (美國);DNA提取試劑盒、質粒大提試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于天根生化科技有限公司 (中國北京);轉染試劑Lipofectamine?3000購于Invitrogen (美國);實驗所用引物合成以及測序均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。實驗地點為山東農業(yè)大學動物育種學研究室。

    1.2 培養(yǎng)基的配制

    10%完全培養(yǎng)基:10%胎牛血清+100 IU/mL青鏈霉素+DMEM。5%完全培養(yǎng)基:5%胎牛血清+100 IU/mL青鏈霉素+DMEM。無雙抗培養(yǎng)基:10%胎牛血清+DMEM。

    1.3 方法

    1.3.1 miR-331-3p過表達載體的構建

    首先利用Primer 5.0設計包含miR-331-3p前體序列的上下游引物,分別在其5?端添加KpnⅠ內切酶和XbaⅠ內切酶的酶切位點以及2 bp的保護堿基AA (表1)[10]。然后提取萊蕪豬耳組織的基因組,以DNA為模板通過普通PCR擴增的方式獲得目的片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)純化回收。最后將目的片段和載體同時酶切、瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收、T4 DNA酶連接構建到pcDNA 3.1(+) 載體上。

    1.3.2 細胞培養(yǎng)

    PK15細胞培養(yǎng)使用完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃。當細胞密度大于80%,換用無雙抗培養(yǎng)基進行實驗。該實驗所用的所有細胞均處于對數(shù)生長期,細胞活性大于95%。

    1.3.3 細胞轉染

    將細胞接種到培養(yǎng)板上,生長到一定密度時,換用無雙抗培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。將實驗分為4組:1) 實驗組:轉染pcDNA3.1(+)-miR-331-3p載體;2) 實驗對照組:轉染pcDNA3.1(+)載體;3) 抑制劑組:轉染miR-331-3p inhibitor;4) 抑制劑對照組:轉染miR-331-3p NC。轉染步驟按照Lipofectamine?3000說明書操作,轉染4 h更換新的無雙抗的培養(yǎng)基,24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),48 h后收集細胞。

    1.3.4 繪制細胞生長曲線

    將生長良好的PK15細胞1×104/mL的密度接種到96孔板,每孔加入100 μL 5%完全培養(yǎng)基。分別在第0 h、24 h、48 h、72 h和96 h,每孔加入10 μL CCK8試劑,37 ℃培養(yǎng)2 h,然后用酶標儀 (Promega,美國) 檢測細胞在450 nm下的OD值,計算平均值,并繪制實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組的生長曲線。

    1.3.5 細胞RNA提取及熒光定量PCR

    將PK15細胞接種到6孔板,待細胞匯合度達到80%時轉染細胞,48 h后提取細胞總RNA,然后反轉錄為cDNA。利用Primier 5.0設計CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B、ING5、CDKN1A和GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 基因的熒光定量引物 (表1),其中GAPDH持家基因作為內參[11]。利用LightCycler?96實時熒光定量PCR系統(tǒng),檢測過表達miR-331-3p后細胞周期相關基因的表達情況,其定量結果通過2-ΔΔCt的方法計算。反應體系 (20 μL) 為:2× TB Green Premix ExTaq10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 7.2 μL。

    同樣,設計miR-331-3p的上游引物 (表1),下游引物使用試劑盒內的通用下游引物,以U6作為內參基因[12],引物使用miRNA反轉錄試劑盒內的U6上下游引物。同樣使用LightCycler?96實時熒光定量PCR系統(tǒng),檢測miR-331-3p的表達變化。反應體系 (20 μL) 為:2× TB Green Premix ExTaq10 μL,上下游引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 6.4 μL。

    表1 實驗中用到的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes used in this experiment

    1.3.6 細胞周期檢測

    將細胞接種到6孔板,待細胞匯合度達到30%左右時分別轉染實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組,當細胞密度達到80%–90%時,小心收集細胞培養(yǎng)液到1.5 mL離心管內備用。用胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養(yǎng)液,終止胰酶消化過程,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。300×g離心3 min去除培養(yǎng)基,再用1 mL預冷PBS洗1遍。然后進行細胞固定,加入1 mL冰浴預冷的70%乙醇中,4 ℃固定12 h,300×g離心去除70%乙醇,使用PBS再洗1遍。最后加入碘化丙啶染色液 (PI),37 ℃避光水浴30 min,結束后錫箔紙包裹離心管放到冰盒上,經(jīng)0.75 μm濾膜過濾后使用BD FACSCalibur流式細胞儀上機檢測細胞所處周期的比例[13]。

    1.3.7 實驗設計與數(shù)據(jù)處理

    所有實驗均設置不少于3次重復,所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差 (±s) 表示,采用SPSS 20統(tǒng)計分析軟件中的One-way ANOVA進行方差分析,通過Duncan氏方法進行多重比較,顯著性水平定為P<0.05。

    2 結果與分析

    2.1 miR-331-3p過表達載體的構建

    實驗所克隆的miR-331-3p前體大小為558 bp,并且以其為模板進行菌液PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)擴增的目的片段與預期大小一致,且條帶單一、無雜帶 (圖1A)。提取質粒經(jīng)測序比對,結果與預期相符,無雜峰干擾 (圖1B),所提取的質粒經(jīng)核酸蛋白濃度測定儀檢測質粒濃度高、質量好,可用于細胞轉染實驗。

    2.2 miR-331-3p對細胞生長曲線的影響

    經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),4組細胞的生長曲線均呈S型 (圖2),符合體外細胞培養(yǎng)的生長特點。在轉染24 h后,實驗組細胞數(shù)顯著高于實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組 (P<0.05);但是實驗對照組、抑制劑組與抑制劑對照組之間差異均不顯著 (P>0.05),可能是由于miR-331-3p抑制劑在24 h時作用效果不顯著,導致此時miR-331-3p的表達下調不顯著。在48 h和72 h時均呈現(xiàn)出實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組的趨勢 (P<0.05),在96 h時實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組差異已不顯著。

    圖1 菌液PCR擴增結果和pre-miR-331-3p測序分析Fig.1 Bacterial liquid PCR and pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p sequencing map.(A) Agarose gel electrophoresis of bacterial PCR.(B) Sequencing map of pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p.

    2.3 miR-331-3p的表達差異分析

    利用qPCR方法分別檢測實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組細胞在轉染48 h后miR-331-3p的表達差異。實驗組miR-331-3p的表達量顯著高于實驗對照組 (P<0.05),這表明所構建的pcDNA3.1(+)-miR-331-3p載體在PK15細胞中能夠發(fā)揮作用,提高了細胞自身miR-331-3p的表達水平,效果良好。相反,抑制劑組miR-331-3p的表達水平相對于抑制劑對照組顯著下降 (P<0.05),這表明miR-331-3p inhibitor確實可以達到抑制細胞本身的miR-331-3p表達的水平,符合實驗要求 (圖3)。

    2.4 過表達miR-331-3p對細胞增殖相關基因的影響

    為了探討miR-331-3p對細胞增殖的影響,利用RT-qPCR法檢測了miR-331-3p的靶基因ING5,以及周期相關基因CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B和CDKN1A的表達變化。結果表明,促進細胞增殖的CDK2、CDK3、CDK4和Cyclin B基因的mRNA表達趨勢均為實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組 (P<0.05) (圖4);而具有抑制細胞增殖作用的CDKN1A和ING5基因的mRNA表達量具有相反的變化趨勢,即實驗組<實驗對照組和抑制劑對照組<抑制劑組 (P<0.05) (圖4)。

    圖3 miR-331-3p表達變化分析Fig.3 Analysis of expression changes of miR-331-3p.Different lower-case letters denoted significant difference (P<0.05).

    圖4 細胞增殖相關基因的表達變化分析Fig.4 Analysis of expression changes of cell proliferation related genes.Different lower-case letters of the same group denoted significant difference (P<0.05).

    2.5 miR-331-3p對細胞周期的影響

    PI染色后利用流式細胞儀檢測各組PK15細胞的周期分布,得到的實驗數(shù)據(jù)經(jīng)ModFit軟件分析后得到流式細胞圖 (圖5)。由圖可知各組中DNA合成前期(G0/G1期)的細胞所占比例,實驗組<實驗對照組和抑制劑對照組<抑制劑組(P<0.05)。各組中處于DNA合成期 (S期)的細胞所占比例,實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組 (P<0.05)。并且各組中處于DNA合成后期和分裂期 (G2/M期) 的細胞所占的比例也是實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組(P<0.05),與細胞處于S期的比例具有相同趨勢。

    圖5 流式細胞術分析細胞所處周期Fig.5 Flow cytometric analysis of the indicated cells.Different lower-case letters of the same group denoted significant difference (P<0.05).

    3 討論

    miRNA作為內源非編碼短鏈RNA,在細胞增殖、凋亡、分化等細胞過程中發(fā)揮著重要的作用。不同的miRNA可能發(fā)揮著相同或相反的作用,甚至同種miRNA在不同的細胞中也具有不同的作用。研究表明miR-331-3p作用機制復雜,在不同的癌細胞中可能發(fā)揮著完全相反的作用機制[14-16]。

    過表達miR-331-3p后相對于實驗對照組和抑制劑對照組,流式細胞術結果表明G0/G1期細胞比例顯著降低,抑制劑組顯著升高,G0/G1期細胞所占比例降低說明細胞增殖速度加快,反之增殖速度減慢[17]。同時DNA合成期 (S期),處于S期的細胞所占比例也顯著性升高,表明過表達miR-331-3p后促使大量細胞由G1期過渡到S期,S期細胞所占比例升高,DNA、組蛋白合成速度加快,組裝成染色體使細胞內染色體數(shù)目加倍為進入細胞分裂期做準備,抑制劑組結果相反。過表達miR-331-3p后在G0/G1期細胞所占比例降低S期細胞所占比例升高的基礎上,DNA合成后期 (G2期) 和細胞分裂期 (M期) 細胞所占比例也顯著地高于實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組。其中G2期是DNA復制結束與開始有絲分裂之間的間隙,在這期間細胞合成某些蛋白質和RNA分子,做好細胞進入M期的物質準備。M期為細胞分裂期,M期細胞所占比例升高直接說明了分裂期細胞增多,表明細胞生長分裂加速。所以處于G2/M期的細胞所占比例顯著升高(P<0.05),表明了細胞此時增殖能力較強能夠快速大量分裂,使細胞數(shù)目增加。與其相反的是抑制劑組相對于其他分組均表現(xiàn)出細胞G2/M期所占比例下降,也從反面證明了這一點。因此流式細胞分析的結果表明miR-331-3p具有促進細胞增殖的效果,這與細胞增殖曲線實驗組增殖速度增快,抑制劑組增殖速度減慢相符合。

    細胞周期蛋白依賴性激酶 (CDKs),如CDK2、CDK3和CDK4已被公認為真核生物細胞生長和增殖的關鍵調控因子,這是哺乳動物細胞G1-S相變所必需的[18-19]。Cyclin B是細胞進入和退出細胞周期M期所必需的[20]。相反地,細胞CDKN1A的過度表達可能通過誘導細胞抑制細胞增殖周期阻滯,它是CDKs的抑制劑[21]。熒光定量表明實驗組隨著miR-331-3p表達升高顯著上調CDK2、CDK3和CDK4促進細胞周期由G1期到S期的轉變,促使處于S期的細胞所占比例顯著上調 (P<0.05),同時上調Cyclin B基因的表達促進細胞周期由G2期進入M期,使實驗組處于G2/M期細胞的比例上調。隨著miR-331-3p的高表達,細胞內的CDKN1A基因表達下調,CDKN1A具有阻滯細胞增殖的作用。其表達下調從另一個方面表明,miR-331-3p具有促進細胞增殖的作用。綜合各個周期相關基因的熒光定量的表達結果說明,miR-331-3p具有促進細胞增殖的功能。有研究表明ING5為miR-331-3p的靶基因[7],miR-331-3p的過表達和抑制表達導致ING5基因發(fā)生相應的下調和上調也證明了這一觀點,因此在豬腎上皮細胞中miR-331-3p有可能是通過作用于ING5基因達到促使細胞增殖的效果。

    4 結論

    本研究成功構建了miR-331-3p的過表達載體,并且發(fā)現(xiàn)miR-331-3p可以通過促進周期相關基因CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B基因的表達,以及抑制ING5和CDKN1A的表達,從而促進豬腎上皮細胞增殖,這為深入研究miR-331-3p在豬生長發(fā)育中的作用機制奠定了基礎。

    猜你喜歡
    細胞周期抑制劑試劑盒
    紅霉素聯(lián)合順鉑對A549細胞的細胞周期和凋亡的影響
    凋亡抑制劑Z-VAD-FMK在豬卵母細胞冷凍保存中的應用
    NSCLC survivin表達特點及其與細胞周期的關系研究
    X線照射劑量率對A549肺癌細胞周期的影響
    癌癥進展(2016年10期)2016-03-20 13:15:43
    GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學驗證
    熊果酸對肺癌細胞株A549及SPCA1細胞周期的抑制作用
    組蛋白去乙?;敢种苿┑难芯窟M展
    磷酸二酯酶及其抑制劑的研究進展
    牛結核病PCR診斷試劑盒質量標準的研究
    哪个播放器可以免费观看大片| 级片在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品野战在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产伦在线观看视频一区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品国产三级普通话版| 最近视频中文字幕2019在线8| 六月丁香七月| 青春草国产在线视频 | 91精品国产九色| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲,欧美,日韩| h日本视频在线播放| 插逼视频在线观看| 久久热精品热| 国产成人福利小说| 97热精品久久久久久| 亚洲国产精品成人久久小说 | 能在线免费观看的黄片| 亚洲图色成人| 婷婷色av中文字幕| 校园春色视频在线观看| 免费观看精品视频网站| av在线亚洲专区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲av.av天堂| 国产精品日韩av在线免费观看| 色播亚洲综合网| 久久久国产成人免费| 亚洲精品456在线播放app| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产成人freesex在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 天堂中文最新版在线下载 | 久久人人爽人人爽人人片va| 久久韩国三级中文字幕| 色视频www国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99热精品在线国产| 欧美日本视频| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 床上黄色一级片| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线免费十八禁| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成人欧美大片| 小说图片视频综合网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 中国国产av一级| 国产成人影院久久av| 日本黄色片子视频| 国产在线男女| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | av在线老鸭窝| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 精品久久久久久久末码| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲无线观看免费| 欧美高清成人免费视频www| 99久国产av精品| 日韩精品有码人妻一区| 此物有八面人人有两片| 国产精品.久久久| 日本熟妇午夜| 99久久精品一区二区三区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 午夜精品国产一区二区电影 | 在线观看av片永久免费下载| 日本黄大片高清| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 在线播放无遮挡| 成人午夜精彩视频在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 性欧美人与动物交配| 一本久久中文字幕| 日本三级黄在线观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 精品久久久久久久久av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 波多野结衣巨乳人妻| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品.久久久| 在线观看66精品国产| 国产成人一区二区在线| 久久人妻av系列| 国产69精品久久久久777片| 秋霞在线观看毛片| 毛片女人毛片| 国模一区二区三区四区视频| av卡一久久| 中文字幕熟女人妻在线| 有码 亚洲区| 国产亚洲91精品色在线| 99热只有精品国产| 久久久成人免费电影| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 99热这里只有精品一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 波多野结衣高清无吗| 久久精品影院6| 97热精品久久久久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产高清视频在线观看网站| 久久精品国产清高在天天线| 一区二区三区免费毛片| 人妻少妇偷人精品九色| 久久亚洲国产成人精品v| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲欧美精品综合久久99| av在线亚洲专区| 日日啪夜夜撸| 有码 亚洲区| 男人的好看免费观看在线视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费人成在线观看视频色| 小说图片视频综合网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产成人a∨麻豆精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 日本一本二区三区精品| 久久99精品国语久久久| 国产精品久久视频播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品国内亚洲2022精品成人| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲va在线va天堂va国产| 中文字幕久久专区| 精品人妻视频免费看| 久久久久久久午夜电影| 国产v大片淫在线免费观看| 国产伦理片在线播放av一区 | 日韩av在线大香蕉| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 搞女人的毛片| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产乱人偷精品视频| 成年版毛片免费区| 久久久久久伊人网av| 免费搜索国产男女视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 小说图片视频综合网站| 国产高清视频在线观看网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日韩强制内射视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产成人freesex在线| 日韩制服骚丝袜av| 在线免费十八禁| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 在线观看美女被高潮喷水网站| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91av网一区二区| 亚洲av一区综合| 少妇熟女欧美另类| 亚洲,欧美,日韩| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 黄色配什么色好看| 免费av毛片视频| 久久韩国三级中文字幕| 久久人妻av系列| 国产极品精品免费视频能看的| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美成人a在线观看| 国产久久久一区二区三区| 色综合色国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 最后的刺客免费高清国语| 色尼玛亚洲综合影院| 看十八女毛片水多多多| 日韩三级伦理在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 成人欧美大片| 村上凉子中文字幕在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 日韩欧美国产在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲18禁久久av| 欧美色视频一区免费| 国产精品永久免费网站| 两个人的视频大全免费| 日韩强制内射视频| 亚洲不卡免费看| h日本视频在线播放| 久久99热这里只有精品18| 两个人视频免费观看高清| 床上黄色一级片| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 岛国毛片在线播放| 国产精品一区二区在线观看99 | 日韩欧美在线乱码| 赤兔流量卡办理| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩成人伦理影院| 伦理电影大哥的女人| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久人人精品亚洲av| 黄片wwwwww| 69av精品久久久久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久久久九九精品二区国产| 中文字幕熟女人妻在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲第一区二区三区不卡| 哪里可以看免费的av片| 99热这里只有是精品在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲内射少妇av| 亚洲人与动物交配视频| 国内精品一区二区在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本欧美国产在线视频| 欧美一级a爱片免费观看看| .国产精品久久| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 有码 亚洲区| 久久99热6这里只有精品| 婷婷亚洲欧美| 亚洲av成人av| 久久99热6这里只有精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品久久视频播放| 青春草视频在线免费观看| 在线观看66精品国产| 日韩欧美精品v在线| 久久久久久久久久黄片| 亚洲国产色片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人a∨麻豆精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲欧美日韩东京热| 精品不卡国产一区二区三区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 99久久成人亚洲精品观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 91久久精品国产一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久久久久久成人| 亚洲av男天堂| 亚洲人与动物交配视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久久成人免费电影| 国产精品嫩草影院av在线观看| 看黄色毛片网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 国产综合懂色| 99国产极品粉嫩在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国内精品久久久久精免费| 最好的美女福利视频网| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲性久久影院| 久久99热这里只有精品18| 熟女人妻精品中文字幕| 久久鲁丝午夜福利片| av又黄又爽大尺度在线免费看 | www.色视频.com| 老司机影院成人| 久久亚洲国产成人精品v| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产美女午夜福利| 级片在线观看| 只有这里有精品99| 一级毛片我不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩av在线大香蕉| 日韩欧美在线乱码| 99热只有精品国产| 精品日产1卡2卡| 日本黄色视频三级网站网址| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲第一电影网av| 男人舔奶头视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人性生交大片免费视频hd| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 国产v大片淫在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载 | 一区二区三区四区激情视频 | 精品久久久久久久久av| 国产淫片久久久久久久久| av天堂中文字幕网| 男女视频在线观看网站免费| 一个人看的www免费观看视频| 国产黄色小视频在线观看| kizo精华| 欧美一区二区亚洲| 中文资源天堂在线| 免费大片18禁| 亚洲不卡免费看| 91久久精品电影网| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品永久免费网站| 久久精品91蜜桃| 99热只有精品国产| 久99久视频精品免费| 国产av麻豆久久久久久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 青青草视频在线视频观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲国产欧美在线一区| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品国产高清国产av| 久久久久久久久大av| 国产淫片久久久久久久久| 18+在线观看网站| 五月伊人婷婷丁香| 性色avwww在线观看| 成人欧美大片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 最后的刺客免费高清国语| 欧美高清成人免费视频www| 变态另类丝袜制服| av专区在线播放| 有码 亚洲区| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩大尺度精品在线看网址| 男女边吃奶边做爰视频| 97超碰精品成人国产| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美性感艳星| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲最大成人中文| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精华一区二区三区| 国内精品美女久久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩亚洲欧美综合| 日韩欧美 国产精品| 免费观看的影片在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲最大成人手机在线| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜精品在线福利| 边亲边吃奶的免费视频| 人妻少妇偷人精品九色| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩高清综合在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一本一本综合久久| 久久精品人妻少妇| 国产日本99.免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 热99re8久久精品国产| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜激情福利司机影院| 日本与韩国留学比较| 青春草国产在线视频 | 麻豆成人午夜福利视频| 波多野结衣高清无吗| 99热这里只有是精品在线观看| 中文欧美无线码| 91精品国产九色| avwww免费| 国产av一区在线观看免费| 亚洲综合色惰| 国产探花在线观看一区二区| 97在线视频观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 嫩草影院新地址| 少妇高潮的动态图| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 中文亚洲av片在线观看爽| 高清毛片免费观看视频网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产片特级美女逼逼视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久久久久久久黄片| 久久这里有精品视频免费| 一级毛片电影观看 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚州av有码| 国产色婷婷99| 乱人视频在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲精品国产av成人精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品亚洲一区二区| 99久国产av精品| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧洲日产国产| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 永久网站在线| 少妇熟女欧美另类| 色噜噜av男人的天堂激情| 高清在线视频一区二区三区 | 欧美性感艳星| 伦理电影大哥的女人| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩人妻高清精品专区| 美女高潮的动态| avwww免费| 国产 一区 欧美 日韩| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 黄色一级大片看看| 禁无遮挡网站| 亚洲精品自拍成人| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 黄色欧美视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国内精品一区二区在线观看| 日本一二三区视频观看| 波多野结衣高清无吗| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜激情欧美在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲va在线va天堂va国产| 91狼人影院| 青青草视频在线视频观看| 国产单亲对白刺激| 久久99蜜桃精品久久| 国产美女午夜福利| 亚洲成人久久性| 精品一区二区三区视频在线| 不卡一级毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日韩欧美国产在线观看| 日日撸夜夜添| 国产精品永久免费网站| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久精品久久久久久久性| 国产极品天堂在线| 久久午夜福利片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 美女内射精品一级片tv| 黄色一级大片看看| а√天堂www在线а√下载| 在线国产一区二区在线| 国产一区二区在线av高清观看| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲美女视频黄频| 晚上一个人看的免费电影| 国产亚洲5aaaaa淫片| 三级毛片av免费| 成人毛片60女人毛片免费| 最近手机中文字幕大全| 色综合色国产| 我要搜黄色片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 长腿黑丝高跟| 亚洲av成人精品一区久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产v大片淫在线免费观看| 美女大奶头视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 日韩一本色道免费dvd| 亚洲成人久久爱视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久九九热精品免费| av.在线天堂| 99久久精品国产国产毛片| 欧美三级亚洲精品| 国产成人影院久久av| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费av毛片视频| 久久久久久久久中文| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美区成人在线视频| 能在线免费观看的黄片| 最新中文字幕久久久久| 国产探花在线观看一区二区| 一区二区三区四区激情视频 | 干丝袜人妻中文字幕| www.色视频.com| 国产伦精品一区二区三区四那| 99国产精品一区二区蜜桃av| 我的老师免费观看完整版| 中出人妻视频一区二区| 日日撸夜夜添| 欧美变态另类bdsm刘玥| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成人二区视频| 国产精品一区二区三区四区久久| av在线亚洲专区| 一本久久中文字幕| 蜜臀久久99精品久久宅男| 直男gayav资源| 少妇的逼好多水| 日本熟妇午夜| 国产真实乱freesex| 中文欧美无线码| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 免费av不卡在线播放| 国产麻豆成人av免费视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲人成网站在线观看播放| 天天躁日日操中文字幕| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一级黄色大片毛片| 在线免费观看不下载黄p国产| 麻豆成人午夜福利视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品野战在线观看| 精品久久久久久久末码| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 级片在线观看| 免费大片18禁| 我的老师免费观看完整版| 午夜精品国产一区二区电影 | 直男gayav资源| 国产黄a三级三级三级人| 久久久久久久久久久免费av| 可以在线观看的亚洲视频| 99久久精品热视频| 麻豆一二三区av精品| 99久久无色码亚洲精品果冻| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄色视频,在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 边亲边吃奶的免费视频| 如何舔出高潮| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产精品成人久久小说 | 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 日日啪夜夜撸| 国产成人a区在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| ponron亚洲| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精品456在线播放app| 国产一区二区在线av高清观看| av福利片在线观看| 久久精品久久久久久久性| 久久精品影院6| 国产精品一区二区在线观看99 | 18禁在线播放成人免费| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美高清性xxxxhd video| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产成人福利小说| 国产老妇女一区| 99久国产av精品| 欧美精品国产亚洲| 国产精品人妻久久久久久| 国产黄片视频在线免费观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久精品94久久精品| 亚洲国产精品合色在线| 毛片女人毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 在线国产一区二区在线| 亚洲av免费高清在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 特级一级黄色大片|