水產(chǎn)品中嗜水氣單胞菌耐藥性研究進(jìn)展

任亞林，李耘，韓剛，朱鋒，劉暢，宋金龍

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081

2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141

1 嗜水氣單胞菌耐藥性現(xiàn)狀

嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的最常見致病菌之一，廣泛存在于水體、土壤及水生動(dòng)物體內(nèi)，是一種典型的人-畜-水生動(dòng)物共患病的條件致病菌，可大規(guī)模引起淡水魚類皮膚潰瘍和急性出血性敗血癥[1-5]。近年來，人類因嗜水氣單胞菌感染而發(fā)生急性霍亂及傷口化膿的病例也時(shí)有報(bào)道[6]。由于抗菌藥物的不合理使用以及耐藥菌株和耐藥基因的傳播，導(dǎo)致嗜水氣單胞菌耐藥問題突出[7-9]，給水產(chǎn)動(dòng)物嗜水氣單胞菌病的防治帶來困難，同時(shí)嚴(yán)重影響水產(chǎn)動(dòng)物源食品的質(zhì)量安全。

嗜水氣單孢菌耐藥菌株表現(xiàn)出耐藥譜廣、耐藥率高的特點(diǎn)[10-11]。目前，從水生動(dòng)物中分離出的嗜水氣單胞菌多耐藥現(xiàn)象普遍，表1以韓國地區(qū)為例綜述了2018年不同水生動(dòng)物源分離株對(duì)多種抗生素的耐藥率，結(jié)果顯示，菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等多種抗生素均有不同程度耐藥。雖然不同地區(qū)用藥方式的區(qū)別導(dǎo)致菌株耐受情況不同，但表1仍在一定程度反映了當(dāng)前嗜水氣單胞菌耐藥現(xiàn)狀。

表1 2018年韓國地區(qū)水產(chǎn)源嗜水氣單胞菌對(duì)常見抗生素的耐藥率[12-14]Table 1 Antimicrobial resistance rate of Aeromonas hydrophila in in South Korea in 2018[12-14]

2 嗜水氣單胞菌耐藥機(jī)制

2.1 獲得性耐藥

細(xì)菌耐藥機(jī)制包括固有耐藥性和獲得耐藥性。固有耐藥性由細(xì)菌染色體上耐藥基因引起，細(xì)菌對(duì)某些抗生素不敏感，具有典型的種屬特異性，研究報(bào)道[15]氣單胞菌對(duì)青霉素具有固有抗性，其細(xì)胞壁最外層由疏水性脂多糖形成，阻止一些未修飾青霉素的擴(kuò)散，此耐藥性為細(xì)菌所固有，與抗菌藥物的使用無關(guān)。

獲得性耐藥指通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及整合子等介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移以及染色體突變方式而使細(xì)菌獲得新的基因，從而具有耐藥性，獲得性耐藥是細(xì)菌耐藥主要因素。多項(xiàng)研究[16-17]表明，水環(huán)境可充當(dāng)抗生素抗性基因儲(chǔ)庫，細(xì)菌通過質(zhì)粒等可移動(dòng)元件介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移從環(huán)境中其他耐藥菌獲得抗藥基因，導(dǎo)致復(fù)雜表型出現(xiàn)，甚至多重耐藥 (Multi-drug resistance，MDR) 發(fā)生。并且，近期Collignon等[18]研究顯示耐藥菌株和耐藥基因的傳播可能是耐藥性擴(kuò)散的主要因素。Fu等[19]研究發(fā)現(xiàn)在水族箱中引入攜帶自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒編碼抗生素抗性基因 (ARG) 的供體后，斑馬魚內(nèi)臟中15%的菌群通過RP4介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移獲得ARG。Hossain等[20]通過PCR檢測抗菌藥物耐藥基因發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)粒介導(dǎo)的耐喹諾酮類菌株中耐藥基因qnrS最常見，占比73.85%。Alcaide等[21]通過PCR檢測喹諾酮耐藥決定區(qū) (QRDR) 靶位突變情況，發(fā)現(xiàn)33株氣單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性與QRDR區(qū)DNA促旋酶gyrA和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶parC基因突變有關(guān)。

2.2 主動(dòng)外排泵作用

由細(xì)菌中膜定位泵蛋白組成的外排系統(tǒng)負(fù)責(zé)排出各種外源和內(nèi)源性物質(zhì)，與細(xì)菌抗生素耐藥密切相關(guān)。Hernould等[22]首次報(bào)道了嗜水氣單胞菌存在引起內(nèi)源性多重耐藥的外排泵機(jī)制。Chenia等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌的藥敏試驗(yàn)中添加外排泵抑制劑PAβN后，萘啶酸耐藥性減少2倍，證實(shí)外排泵在嗜水氣單胞菌耐藥中起到重要作用。同樣，Pu等[24]利用體內(nèi)熒光成像和高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在β-內(nèi)酰胺類抗生素處理下，TolC等多種藥外排基因表達(dá)量顯著增加，由于外排活性增強(qiáng)，細(xì)菌內(nèi)藥物積累量降低而產(chǎn)生耐藥性；試驗(yàn)結(jié)果證明，外排抑制劑和抗生素共同作用可有效減少耐藥性形成。

另外，有研究發(fā)現(xiàn)[25-26]活性氧自由基 (ROS)在細(xì)菌耐藥及抗生素殺菌方面發(fā)揮重要作用。非致死濃度的抗生素作用下產(chǎn)生的ROS 會(huì)通過影響MarR (Multiple antibiotic resistance repressor)-MarA (Multiple antibiotic resistance activator) 激活藥物外排泵，通過SoxR (Superoxide response transcriptional regulator)-SoxS (Superoxide response transcription factor) 途徑啟動(dòng)細(xì)菌應(yīng)激保護(hù)機(jī)制以及通過促進(jìn)SOS DNA 損傷修復(fù)系統(tǒng)誘導(dǎo)耐藥突變，從而產(chǎn)生耐藥性。而致死濃度的抗生素作用產(chǎn)生的ROS則會(huì)參與抗生素殺菌并減少耐藥菌產(chǎn)生。

2.3 細(xì)胞膜滲透性改變

革蘭氏陰性菌耐藥菌株難以防控主要是因?yàn)槠渚哂胁粚?duì)稱雙層外膜，疏水抗生素如氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類通過新陳代謝的功能依賴性擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜[27]。然而，目前識(shí)別小分子滲透性的方法較為欠缺，嚴(yán)重限制了對(duì)抗生素通過外膜滲透相關(guān)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，這也是革蘭氏陰性菌耐藥性機(jī)制研究需要填補(bǔ)的空白。Joris等[28]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于H2O2條件下，細(xì)菌通過周質(zhì)中蛋白質(zhì)內(nèi)紐帶 (外膜和內(nèi)膜之間的空隙) 結(jié)構(gòu)的變化來打開或關(guān)閉特定間隙，并改變對(duì)活性氧物質(zhì)及β-內(nèi)酰胺類抗生素?cái)z取的敏感性。同時(shí)還證實(shí)通過改變外膜孔蛋白通道調(diào)節(jié)細(xì)菌膜滲透性可影響細(xì)菌毒力特征及抗生素耐受性。另外嗜水氣單胞菌有S層，由蛋白或糖蛋白亞單位組成，規(guī)則排列于細(xì)胞表面，耐藥菌合成此類物質(zhì)過多，分子間距變小同樣可能是藥物受阻和表面結(jié)構(gòu)變化的原因之一。

2.4 抗生素原位降解和酶修飾

嗜水氣單胞菌可降解或修飾抗生素，以產(chǎn)生耐藥性。Vilacosta等[29]通過監(jiān)測ARG、營養(yǎng)素、磺胺類抗生素及其降解產(chǎn)物濃度以研究水生系統(tǒng)中細(xì)菌對(duì)磺胺類抗生素的主要耐受機(jī)制。研究結(jié)果顯示，在試驗(yàn)前4周，磺胺類抗生素被生物膜很好地降解；添加高濃度抗生素后，生物膜中ARG豐度急劇下降，但用低濃度抗生素處理時(shí)未觀察到此現(xiàn)象；在污染水域添加高濃度磺胺類抗生素 (較低ARG豐度)，其降解速度更快，這表明抗生素原位降解和ARG是微生物群體采用的兩種互補(bǔ)抗性策略，原位降解在高濃度抗生素添加中發(fā)揮作用，而ARG擴(kuò)散在相對(duì)較低的抗生素濃度下更為重要。

細(xì)菌還可通過酶將化學(xué)基團(tuán)添加到抗生素分子上的易受攻擊部位，使之產(chǎn)生位阻使抗生素不能與靶蛋白結(jié)合，從而產(chǎn)生抗生素耐藥性。過去的研究[30]表明，C類β-內(nèi)酰胺酶可使嗜水氣單胞菌對(duì)頭孢類抗生素產(chǎn)生耐藥性；另外，氨基糖苷類抗生素具有很多暴露的羥基和酰胺基團(tuán)，易被修飾，氨基糖苷類鈍化酶使得細(xì)菌對(duì)所修飾的抗生素具有高水平耐藥性。常見的氨基糖苷類鈍化酶有乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，分子動(dòng)力學(xué)研究表明這3種酶均可與氨基糖苷類藥物結(jié)合，因?yàn)槠浠钚晕稽c(diǎn)模擬了核糖體結(jié)合分裂的目標(biāo)環(huán)境[31]。

3 耐藥性防控措施

細(xì)菌耐藥性的傳播和加劇使其對(duì)人類的生存健康和生產(chǎn)生活造成極大危害。世界衛(wèi)生組織(WHO)、歐盟食品安全局(EFSA)以及美國疾病預(yù)防中心 (CDC)、美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、美國農(nóng)業(yè)部 (USDA) 等均強(qiáng)調(diào)削減和預(yù)防微生物耐藥性傳播為當(dāng)今疾病預(yù)防和公共安全的重點(diǎn)研究內(nèi)容。目前，在使用抗生素或抗菌藥物的基礎(chǔ)上尋求新的方法以控制細(xì)菌耐藥性是未來的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

3.1 天然活性替代藥物使用

目前，益生菌、生物肽、噬菌體、溶菌酶等廣泛用于傳統(tǒng)抗生素替代品以控制耐藥菌產(chǎn)生。世界衛(wèi)生組織 (WHO) 定義益生菌是一定數(shù)量可對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益作用、活的微生物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，益生菌主要通過促進(jìn)消化酶、抑制致病微生物、促生長因子和增強(qiáng)宿主免疫等途徑維持水產(chǎn)品健康。Yi等[32]研究發(fā)現(xiàn)益生菌BacillusvelezensisJW對(duì)嗜水氣單胞菌等各種魚類致病細(xì)菌具有抗菌活性，且JW菌株喂養(yǎng)的魚在嗜水氣單胞菌感染后存活率顯著提高。Bustillo等[33]研究發(fā)現(xiàn)，完整的Hipposin生物肽中含有parasin和buforinⅡ(BF2) 序列，這兩種已知的抗菌肽通過不同的抗菌機(jī)制起作用。其中parasin通過誘導(dǎo)膜透化殺死細(xì)菌，且此作用與其N-末端結(jié)構(gòu)域的存在有關(guān)；而buforinⅡ通過進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)核酸互作損傷細(xì)菌。Le等[34]研究發(fā)現(xiàn)噬菌體可有效抑制氣單胞菌的生長，對(duì)抗多重耐抗生素的氣單胞菌株也具有廣泛活性，證明使用噬菌體可作為有效的生物治療方法來控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中氣單胞菌敗血癥 (MAS) 的發(fā)生。

中藥具有抗病菌、抗病毒及提高免疫力等作用，具備抗生素作用的同時(shí)又克服了化學(xué)藥的缺陷。Dong等[35]研究發(fā)現(xiàn)中藥活性成分厚樸酚可通過抑制氣單胞菌溶素編碼基因aerA在低濃度下的轉(zhuǎn)錄，抑制嗜水氣單胞菌的溶血活性；活性試驗(yàn)結(jié)果表明，厚樸酚可顯著降低通道鯰魚因嗜水氣單胞菌感染引起的死亡率。植物化學(xué)物質(zhì)也具有殺菌、抑菌活性，且在濃度低于抑制細(xì)菌生長的濃度下也能夠抑制毒力因子。Syahidah等[36]通過薄層色譜-生物自顯影方法測定蔞葉提取物的抑菌作用，結(jié)果顯示羥基沙蒿素和丁子香酚具有顯著的抗菌活性，蔞葉的提取物或其化合物可以作為用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病管理的有效天然抗菌劑的替代來源。另外，β-葡聚糖也可作為抗生素替代物防止水產(chǎn)品細(xì)菌性感染疾病的發(fā)生，Jung-Schroers等[37]研究發(fā)現(xiàn)以添加β-葡聚糖的飼料喂養(yǎng)感染嗜水氣單胞菌的鯉魚，其杯狀細(xì)胞上填充的粘蛋白減少，粘液明顯從杯狀細(xì)胞釋放，這可以保護(hù)性抵抗致病菌，防止鯉魚腸道感染。另外，Yildirim-Aksoy等[38]研究報(bào)道，殼聚糖 (CS) 及其衍生物殼聚糖寡糖乳酸 (COL) 均可按照侵襲過程對(duì)嗜水氣單胞菌表現(xiàn)出抗菌活性，即從阻礙細(xì)菌吸附開始，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分的泄漏至最終細(xì)胞凋亡。總之，綠色養(yǎng)殖是未來發(fā)展趨勢，也是我國大力推進(jìn)的重要方向。

3.2 聯(lián)合用藥延緩耐藥性發(fā)生和提升藥敏性

某種藥物的抗性菌株通常對(duì)其他藥物表現(xiàn)出抗性或易感性，稱為交叉耐藥或超敏感性現(xiàn)象[39-40]，抗生素之間的超敏感現(xiàn)象為聯(lián)合用藥提供思路。有研究表明[41-42]，對(duì)氨基糖苷類如阿米卡星 (AMK) 等具有抗性的大腸桿菌菌株對(duì)其他類型的藥物表現(xiàn)出更高敏感性，包括DNA復(fù)制抑制劑喹諾酮類、細(xì)胞壁合成抑制劑β-內(nèi)酰胺類等；相反，對(duì)這些抗生素具有抗性的菌株也顯示出對(duì)氨基糖苷類的高度易感性。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，抗生素抗性之間的權(quán)衡機(jī)制是由質(zhì)子動(dòng)力(PMF) 在細(xì)胞膜上的變化所引起，氨基糖苷類抗性菌株中PMF降低可導(dǎo)致多藥外排泵AcrAB活性降低，進(jìn)而對(duì)其他藥物更敏感；另一方面，在對(duì)喹諾酮類和氯霉素等各種藥物具有抗性的菌株中，抗性是由AcrAB的活性增加引起，AcrAB活化電子傳輸系統(tǒng) (ETS) 以維持跨質(zhì)膜的質(zhì)子平衡，ETS的激活導(dǎo)致對(duì)氨基糖苷類藥物的高度易感性。同時(shí)使用這些藥物組合可以抑制耐藥性的發(fā)展。由此，抑制電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)或干擾質(zhì)子動(dòng)力形成的化學(xué)物可能會(huì)抑制耐藥性的出現(xiàn)及發(fā)展。

中藥單體與抗生素聯(lián)合，既可提高治療效果、降低耐藥菌的產(chǎn)生，又可保護(hù)環(huán)境、減少藥物殘留，彌補(bǔ)了中藥和抗生素單味用藥的不足。Bandeira等[43]研究了5種植物化學(xué)物質(zhì) (香芹酚、檸檬醛、丁子香酚、芳樟醇和百里酚) 單獨(dú)使用及與氟苯尼考或土霉素組合對(duì)銀鯰分離細(xì)菌的抗菌活性。棋盤分析 (Checkerboard assay) 結(jié)果顯示，芳樟醇與氟苯尼考或土霉素聯(lián)用對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗作用呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，且這些植物化學(xué)物質(zhì)均可抑制由細(xì)菌引起的生物膜形成和溶血。盧靜等[44]的研究也表明，沒食子酸和槲皮素對(duì)嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌具有顯著的抑制作用，二者與恩諾沙星、諾氟沙星、氟苯尼考等抗生素聯(lián)合應(yīng)用具有相加或協(xié)同作用，有助于降低抗生素的用量及殘留。上述研究成果均為控制嗜水氣單胞菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的危害提供新的思路和方向，也是未來水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖的主要趨勢。

3.3 改善養(yǎng)殖的水域環(huán)境

水生環(huán)境是水產(chǎn)品耐藥性出現(xiàn)和傳播的重要背景。越來越多的證據(jù)表明，水生系統(tǒng)可作為耐藥菌株和基因的潛在儲(chǔ)存庫，可重新進(jìn)入臨床或人體，即使在抗生素不存在的情況下也會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜表型的出現(xiàn)；此外，水生系統(tǒng)充當(dāng)了孵化器，為耐藥菌和基因傳播提供適宜條件。改善養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)、建立一個(gè)環(huán)境友好的水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)是防控耐藥性發(fā)生的重要手段。Borgia等[45]研究表明魚類長期暴露于0.004%、0.007%、0.01%和0.013%的電子工業(yè)廢水中，其非特異性及特異性免疫應(yīng)答能力均呈劑量依賴模式顯著降低。Ying等[46]在中國臺(tái)灣西南部建立了一個(gè)基于陸地、農(nóng)場規(guī)模的多營養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖 (IMTA) 系統(tǒng)，將魚類、貝類與海藻共培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，IMTA系統(tǒng)中抗磺胺類藥物表型菌株與初始海水中的數(shù)量相當(dāng)，而傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中表現(xiàn)出更高的磺胺抗性。此外，IMTA系統(tǒng)可更好地維持細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的完整性，代表一種維持海洋環(huán)境可持續(xù)性、具有潛在價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)。采用最佳飼養(yǎng)條件，如控制飼料率、水溶氧、養(yǎng)殖密度和溫度等可有效預(yù)防魚類細(xì)菌性疾病的發(fā)生；另外，魚類飲食也至關(guān)重要，保證蛋白質(zhì)的充足供應(yīng)以最大限度促進(jìn)生長，并輔加維生素和微量元素用于控制疾病和調(diào)節(jié)魚類的抗御能力，抵抗感染。

4 總結(jié)及展望

抑制耐藥菌的產(chǎn)生及傳播已成為全球性關(guān)注的熱點(diǎn)問題。當(dāng)前，緩解耐藥性的方法主要聚焦于使用噬菌體、新型綠色天然藥物研發(fā)、限制抗生素使用或優(yōu)化聯(lián)合用藥方案等以增強(qiáng)現(xiàn)有抗生素殺菌效果。然而，目前新型抗菌藥物的研制速度遠(yuǎn)比不上耐藥菌產(chǎn)生速度，且持續(xù)開發(fā)新型藥物極具挑戰(zhàn)和難度；另外，替代藥物的開發(fā)應(yīng)用仍停留在實(shí)驗(yàn)研究階段，且價(jià)格昂貴的替代藥物不適宜推廣應(yīng)用。同時(shí)，相對(duì)于養(yǎng)殖環(huán)境，水體環(huán)境更為開放，防控難度更大。探究耐藥成因、耐藥機(jī)制以及藥物聯(lián)用的潛在協(xié)同作用，優(yōu)化給藥方案，延緩或削減現(xiàn)有及新型抗生素耐藥性發(fā)生，這在短期內(nèi)具有重大意義。