竹節(jié)參HPLC指紋圖譜的建立及7種成分測(cè)定

伍紅年譚詩(shī)涵王元清雷雅婷劉瑞連嚴(yán)建業(yè)?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；4.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

竹節(jié)參又名白三七、竹節(jié)七、竹節(jié)人參等，系五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicusC.A.Mey 的干燥根莖，收載于2015年版 《中國(guó)藥典》一部，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補(bǔ)虛強(qiáng)壯之功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，竹節(jié)參具有保護(hù)心肌功能、促進(jìn)免疫、抗腫瘤、抗驚厥、抗應(yīng)激和抗氧化等藥理作用；已報(bào)道的化學(xué)成分有皂苷類(lèi)、糖類(lèi)、多炔類(lèi)、氨基酸、揮發(fā)油無(wú)機(jī)元素及核苷類(lèi)［2-3］。

然迄今為止，關(guān)于竹節(jié)參相關(guān)質(zhì)量控制研究主要集中于皂苷［4］、多糖［5］及揮發(fā)性［6］成分，尚未見(jiàn)對(duì)核苷類(lèi)成分質(zhì)量控制相關(guān)的研究報(bào)道。核苷類(lèi)成分具有廣泛的生理活性，是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善細(xì)胞代謝、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、抗血小板凝集、抗心律失常和抗驚厥等作用［7］，與竹節(jié)參藥效具有一定關(guān)聯(lián)性；吳兵等［3］在對(duì)竹節(jié)參進(jìn)行化學(xué)成分研究中，首次從中分離得8種核苷類(lèi)成分；張?jiān)艿龋?］認(rèn)為核苷可能是補(bǔ)益中藥的共同物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)三七、人參等6種常用的補(bǔ)益藥進(jìn)行研究，結(jié)果表明均含有核苷類(lèi)。因此核苷可作為竹節(jié)參藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

指紋圖譜作為1種多組分復(fù)雜樣品的有效質(zhì)量控制方法，能夠反映出待測(cè)樣品的整體性、特征性［9］，結(jié)合同時(shí)測(cè)定多種成分的含有量，被廣泛應(yīng)用于中藥材和中成藥的質(zhì)量研究中［10-11］。本研究采用HPLC 法建立了竹節(jié)參核苷類(lèi)成分的指紋圖譜，結(jié)合聚類(lèi)與主成分分析進(jìn)行分類(lèi)分析，并測(cè)定其中7種主要成分的含有量，以期為竹節(jié)參質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Waters e2695 型高效液相儀、Waters 2489 UV檢測(cè)器、Empower 3 色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Waters公司）；LE204E／02 型電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；Option R7 utra AN 超純水系統(tǒng)（英國(guó) Elga Lab Waters 公司）；eppendorf 5424R 高速冷凍離心機(jī)；KQ-5200DV 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。乙腈色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。次黃嘌呤（批號(hào)wkq16091402）、尿苷（批號(hào) wkq16083105）、脫氧尿苷（批號(hào) wkq17011101）、肌苷（批號(hào) wkq16090505）、腺苷（批號(hào)wkq16092103）、胸腺嘧啶核苷（批號(hào)wkq16090903）、鳥(niǎo)苷（批號(hào) wkq16090703）均購(gòu)買(mǎi)于四川省維克奇生物科技有限公司，含有量均≥98%；10 批不同產(chǎn)地竹節(jié)參樣品，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)龔力民副教授鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicusC.A.Mey 的干燥根莖，見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.01% 甲酸水（B），梯度洗脫（0～15 min，0% A；15～20 min，0%～1%A；20～25 min，1%～3%A；25～55 min，3% A；55～60 min，0% A）；體積流量0.8 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 分別取次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、鳥(niǎo)苷、肌苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷對(duì)照品適量，精密稱定，加超純水制成每1 mL分別含次黃嘌呤 5.60 μg、尿苷 77.59 μg、脫氧尿苷 5.52 μg、肌苷 21.79 μg、鳥(niǎo)苷 80.00 μg、腺苷36.41 μg、胸腺嘧啶核苷 14.00 μg 的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取樣品粉末（過(guò)40 目篩）約 1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入 0.1% 氨水 10 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取（40 kHz、250 W）90 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.1% 氨水補(bǔ)足減失質(zhì)量，13 000 r／min 離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 空白溶液制備 0.1%氨水溶液。過(guò)濾，進(jìn)樣，記錄色譜圖。見(jiàn)圖1，空白無(wú)干擾。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品（S10），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，以尿苷為參照峰，測(cè)得16 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 介于0.04%～0.30% 及 0.87%～2.99% 之間，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品（S10），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 6 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 介于0.05%～0.61%及0.86%～2.71%之間，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（S10），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12 h 在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 介于 0.10%～0.89% 及 2.00%～2.88% 之間，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立 吸取S1～S10 供試品溶液及混合對(duì)照品溶液各10 μL，進(jìn)樣后得到10 批樣品的HPLC 指紋圖譜，見(jiàn)圖2。將所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A”進(jìn)行分析，獲得對(duì)照指紋圖譜R，共得到16 個(gè)共有峰，將所得對(duì)照指紋圖譜與對(duì)照品比對(duì)可知，確定了其中7 個(gè)有峰，分別為次黃嘌呤（5 號(hào)峰）、尿苷（8 號(hào)峰）、脫氧尿苷（10 號(hào)峰）、肌苷（11 號(hào)峰）、鳥(niǎo)苷（12 號(hào)峰）、腺苷（13 號(hào)峰）和胸腺嘧啶核苷（15 號(hào)峰）。各批樣品中尿苷的峰面積較大，分離度較好，因此確定其為參照峰S 計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2～3。

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of ten batches of samples

2.4 相似度分析 將10 批竹節(jié)參色譜圖與對(duì)照指紋圖譜相比較，各批次樣品的相似度在0.723～0.978，表明各批次竹節(jié)參樣品的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，從圖2 可以看出不同產(chǎn)地竹節(jié)參的化學(xué)成分基本一致，各成分在量上存在差異。表4 表明，樣品 S2與S3 相似度相對(duì)較低，而其他產(chǎn)地樣品相似度則較高。

2.5 聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析是通過(guò)將觀察對(duì)象依據(jù)某些特征加以歸類(lèi)，從而建立樣本與樣本之間的相似關(guān)系或親疏關(guān)系的一種探索性數(shù)據(jù)分析手段，目前已廣泛應(yīng)用于中藥鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類(lèi)等方面［12］。采用 SPSS 19.0 軟件，以 10 個(gè)不同產(chǎn)地的竹節(jié)參藥材的16 個(gè)共有峰的峰面積為變量，選用組間聯(lián)接法，Euclidean 距離為測(cè)度，進(jìn)行聚類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖3。表明，當(dāng)類(lèi)間距離范圍為 15～25 時(shí)，竹節(jié)參藥材可分為3 類(lèi)，其中S4（四川大涼山）、S5（湖南石門(mén)）、S7（貴州貴陽(yáng)）、S8（湖北神農(nóng)架）、S9 與 S10（湖北恩施）為Ⅰ類(lèi)；S1（云南麗江）與S6（江西吉安）為Ⅱ類(lèi)；S2（四川樂(lè)山）與S3（四川雅安）為Ⅲ類(lèi)。結(jié)果表明，竹節(jié)參藥材的指紋圖譜與其地理位置，外界環(huán)境具有一定的相關(guān)性，但不絕對(duì)相關(guān)。

表2 10 批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks of ten batches of samples

表3 10 批樣品共有峰相對(duì)峰面積Tab.3 Relative peak areas of common peaks of ten batches of samples

表4 10 批樣品相似度Tab.4 Similarities of ten batches of samples

2.6 主成分分析 為進(jìn)一步探討不同產(chǎn)地竹節(jié)參之間的差異，在聚類(lèi)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。以10 個(gè)不同產(chǎn)地的竹節(jié)參藥材的16 個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0，對(duì)共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行主成分分析。主成分個(gè)數(shù)提取原則為主成分的特征值大于1 的前m個(gè)主成分，表5 表明，前4 個(gè)主成分的特征值大于1，即 5.652、3.996、2.004、1.459，對(duì)方差的貢獻(xiàn) 率 分 別 為 35.328%、24.976%、12.525%、9.117%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為 81.946%。表 7 表明，竹節(jié)參的多個(gè)成分可以簡(jiǎn)化為4 個(gè)主成分；圖4 表明前4 個(gè)成分較陡，剩余的其他成分之間比較平緩。因前3 個(gè)主成分的特征值相對(duì)較大，故取前3 個(gè)主成分的得分作不同產(chǎn)地竹節(jié)參藥材主成分三維分布圖，見(jiàn)圖5。表明，S4、S5、S7、S8 和 S9 與 S10為Ⅰ類(lèi)；S1 與 S6 為Ⅱ類(lèi)；S2 與 S3 為Ⅲ類(lèi)；其結(jié)果與聚類(lèi)分析一致。

圖3 10 批樣品聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.3 Dendrogram of ten batches of samples

表5 主成分的初始特征值和貢獻(xiàn)率Tab.5 Initial eigenvalue and contribution rate of princilal component

圖4 各樣品主成分分析碎石圖Fig.4 PCA scree plot of various samples

2.7 含有量測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察 取混合溶液 1、4、8、12、16、20 μL，在 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表 6。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取 “2.2.1”混合對(duì)照品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測(cè)得次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷峰面積RSD 分別為0.41%、0.39%、0.42% 、0.37%、0.39% 、0.36% 、0.48% ，表 明儀器精密度良好。

圖5 不同產(chǎn)地樣品主成分3D 得分圖Fig.5 3D PCA score of samples from different growing areas

表6 各成分線性關(guān)系Tab.6 Linear relationships of various constituents

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品（S10）6 份，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷峰面積的 RSD 分別為 2.13%、2.26%、2.77%、2.88%、2.80%、2.41%、2.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（S10），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷峰面積RSD 分別 為 2.28%、2.44%、2.92%、2.20%、2.81%、2.43%、2.87%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn) 取 “2.3.3”項(xiàng)下已測(cè)知核苷含有量的樣品6 份，每份約0.5 g，精密稱定，精密加入次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷各對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷的回收率分別為 98.66%（RSD = 2.69%）、96.90%（RSD =2.92%）、93.34%（RSD=2.97%）、94.86%（RSD=2.82%）、98.60%（RSD=2.73%）、92.74%（RSD=2.66%）、97.95%（RSD=2.31%）。

2.7.6 樣品含有量測(cè)定 吸取 “2.2.1”、“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和S1～S10 供試品溶液各10 μL，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（μg／g， n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（μg／g， n=3）

2.8P值分析 為了探究各產(chǎn)地之間的質(zhì)量波動(dòng)，引用1 個(gè)易于計(jì)算和可見(jiàn)的參數(shù)（P值），對(duì)不同產(chǎn)地的藥竹節(jié)參藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算公式為其中Ci表示給定化合物的測(cè)定濃度，而Ci表示10 個(gè)不同產(chǎn)地竹節(jié)參的平均濃度。P值越接近1，批間的一致性越好。一般來(lái)說(shuō)，在0.75～1.25 的范圍內(nèi)的值是可以接受的［13］，見(jiàn)圖 6，從中觀察到3 個(gè)異常值，即峰5（次黃嘌呤）、峰10（脫氧尿苷）和峰11（肌苷）。異常值是導(dǎo)致竹節(jié)參樣品質(zhì)量波動(dòng)的重要因素。表明次黃嘌呤、脫氧尿苷、肌苷在樣品中存在較大的波動(dòng)，對(duì)竹節(jié)參的質(zhì)量有較大影響。

圖6 不同產(chǎn)地樣品7種成分Box-chart 圖Fig.6 Box chart of seven compounds of samples from different growing areas

3 討論

3.1 條件優(yōu)化 由于核苷類(lèi)成分極性較大，且有些核苷類(lèi)成分（如次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷）在水中的溶解度較差，在堿性溶劑中溶解度較好［14-15］，所以考察了不同極性與不同pH 的提取溶劑（超純水、10% 甲醇水、20% 甲醇水、10% 乙醇水、0.1% 氨水、1%氨水、1%醋酸水、0.1%醋酸水）；不同提取方式（超聲、回流）；不同提取時(shí)間（30、45、60、90、120 min）對(duì)提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用0.1%氨水提取效率優(yōu)于其他，且結(jié)果穩(wěn)定；超聲提取和回流提取的效果無(wú)明顯差異，但超聲提取法處理簡(jiǎn)單，重復(fù)性好；提取時(shí)間90 min 較適宜；因此選擇0.1%氨水超聲提取90 min 為供試品溶液的制備方法。

鑒于核苷類(lèi)成分為偏堿性的水溶性成分，本實(shí)驗(yàn)考察了各種流動(dòng)相后發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.01% 甲酸水流動(dòng)相時(shí)分離度較好，峰形對(duì)稱；比較柱溫對(duì)峰形的影響，考察了25、30、35 ℃ 3種不同溫度，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫的升高與降低，對(duì)其峰形都有較大影響，其中30 ℃下影響最小，選為本實(shí)驗(yàn)柱溫；在其他色譜條件一致的情況下，分別對(duì)0.5、0.8、1 mL／min 3種體積流量進(jìn)行考察，結(jié)果表明0.8 mL／min最好。

3.2 結(jié)果分析 本研究選取不同產(chǎn)地竹節(jié)參藥材作為研究對(duì)象，建立了HPLC 指紋圖譜及7種指標(biāo)性成分含有量測(cè)定的方法，完成了在同一色譜圖下對(duì)竹節(jié)參核苷類(lèi)成分定性及定量分析的雙重目的。由10 批樣品指紋圖譜可知，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間差異較小，而相對(duì)峰面積差異則較大，表明不同產(chǎn)地竹節(jié)參樣品中化學(xué)成分在量上存在較大差異。綜合相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析和 PCA 分析結(jié)果，將四川大涼山、湖南石門(mén)、貴州貴陽(yáng)、湖北神農(nóng)架和恩施聚為Ⅰ類(lèi)；云南麗江、江西吉安聚為Ⅱ類(lèi)；四川樂(lè)山和雅安聚為Ⅲ類(lèi)。為了進(jìn)一步了解不同產(chǎn)地竹節(jié)參藥材中核苷類(lèi)成分的含有量的差異來(lái)源，對(duì)竹節(jié)參樣品多指標(biāo)性成分進(jìn)行定量分析，并結(jié)合1個(gè)易于計(jì)算和可見(jiàn)的參數(shù)P進(jìn)行分析，得到次黃嘌呤、脫氧尿苷、肌苷在樣品中存在較大的波動(dòng)，對(duì)竹節(jié)參的質(zhì)量有較大影響。本實(shí)驗(yàn)建立了竹節(jié)參核苷類(lèi)指紋圖譜研究方法，該方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，能夠較好地識(shí)別竹節(jié)參中核苷類(lèi)化學(xué)成分，監(jiān)測(cè)指標(biāo)性成分含有量的同時(shí)，又對(duì)樣品整體進(jìn)行了表征，對(duì)評(píng)價(jià)竹節(jié)參的質(zhì)量具有參考意義。