內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE-1/XBP-1參與調(diào)控肝癌進(jìn)展的機(jī)制研究

歧紅陽 王云溪 王志民 吳鳳麗 王啟明

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)合成的場(chǎng)所，是1個(gè)具有分泌功能并能參與多種生化反應(yīng)的膜性細(xì)胞器，主要功能是包括蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)修飾和加工，脂類分泌，維持鈣穩(wěn)態(tài)等[1-2]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)缺氧、營養(yǎng)缺乏、能量不足及氧化應(yīng)激等不利因素時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂、鈣穩(wěn)態(tài)失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)過量聚積未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，進(jìn)而刺激細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的發(fā)生[3-4]。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過久則最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝癌組織和細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移程度明顯相關(guān)，可通過調(diào)節(jié)IRE1/XBP、ATF6(Activating Transcription Factor 6)或PERK(PKR-like ER Kinase)信號(hào)通路來參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[5-6]。本研究主要通過觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生前后正常肝細(xì)胞 LO2、高分化肝癌細(xì)胞株HepG2 及高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721 細(xì)胞內(nèi)IRE1/XBP1信號(hào)通路的變化，來探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的IRE1/XBP1信號(hào)通路與肝癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與ERS誘導(dǎo)

正常LO2肝細(xì)胞、高分化HepG2肝癌細(xì)胞株及高轉(zhuǎn)移能力SMMC-7721肝癌細(xì)胞株細(xì)胞購買于上海生命科學(xué)研究所。采用DMEM+10%胎牛血清、37 ℃、5%CO2復(fù)蘇細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代后換液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長。LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞給予150 mmol/l無水乙醇處理48 h，棄去無水乙醇后用PBS清洗兩次，收獲細(xì)胞備用。

1.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

無水乙醇處理后，制備成LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞懸液，并接種于96孔板中過夜培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基后依加入CCK8試劑10 μl，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，在450 nm波長處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3 Hoechst 33258 染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變

無水乙醇處理后，LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞更換培養(yǎng)液后制備成細(xì)胞懸液，并接種于6孔板中過夜培養(yǎng)，4%多聚甲酵固定細(xì)胞20 min。PBS洗2遍加Hoechst 33258染色液室溫孵育10 min。PBS清洗后封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 Real-Time PCR檢測(cè)ERS介導(dǎo)IRE1/XBP mRNA表達(dá)含量

收集無水乙醇處理后，Trizol法提取肝癌LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞中的總RNA，按照說明書操作，實(shí)驗(yàn)采用閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold,CT)值相對(duì)定量法，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR操作，計(jì)算不同樣本之問的IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12和Bcl-2 mRNA相對(duì)百分比。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.5 WesternBlot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

收集無水乙醇處理后，Trizol法提取肝癌LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞中的總蛋白，并測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度。將各組肝癌LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞蛋白樣品加入到10%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳并轉(zhuǎn)膜，封閉40 min加入孵育一抗IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12和Bcl-2和二抗。用ECL顯色液進(jìn)行顯色，并對(duì)各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描，得出相應(yīng)的蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

CCK8檢測(cè)結(jié)果可知，無水乙醇誘導(dǎo)LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，細(xì)胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

2.2 Hoechst33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生

Hoechst33258染色法結(jié)果可知，無水乙醇誘導(dǎo)LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，細(xì)胞凋亡明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 IRE1/XBP 信號(hào)通路mRNA表達(dá)含量

采用Real-time PCR法測(cè)得結(jié)果可知，無水乙醇誘導(dǎo)LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12 mRNA表達(dá)含量顯著升高，其中細(xì)胞內(nèi)mRNA含量表達(dá)的高低次序?yàn)镾MMC-7721、HepG2 和LO2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表達(dá)含量顯著降低，細(xì)胞內(nèi)mRNA含量表達(dá)的高低次序?yàn)長O2、HepG2 和SMMC-7721細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果圖

2.4 IRE1/XBP信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平

用WesternBlot法測(cè)得結(jié)果可知，無水乙醇誘導(dǎo)LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12 蛋白表達(dá)含量顯著升高，其中細(xì)胞內(nèi)蛋白含量表達(dá)的高低次序?yàn)镾MMC-7721、HepG2 和LO2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bcl-2 蛋白表達(dá)含量顯著降低，細(xì)胞內(nèi)蛋白含量表達(dá)的高低次序?yàn)長O2、HepG2 和SMMC-7721細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見圖3。

圖3 WesternBlot檢測(cè)蛋白表達(dá)含量圖

3 討論

肝癌是1種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率較高，且呈逐年上升的趨勢(shì)。肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，通常與機(jī)體脂肪性肝炎、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染等慢性炎癥相關(guān)。這些致病因素可通過誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和基因突變等而誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象[7-8]。近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療肝癌的研究熱點(diǎn)。參與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激蛋白包括CHOP、GRP78和XBP-1等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶用于提示ERS的發(fā)生。X-盒-結(jié)合蛋白-1(X box-binding protein-1，XBP-1)的表達(dá)上調(diào)可作為ERS的主要標(biāo)志[9-10]， XBP-1通過調(diào)控參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白陪襯分子和降解蛋白來發(fā)揮其蛋白質(zhì)的折疊能力。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)可有效刺激具有蛋白激酶和核糖核酸酶活性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的肌醇酶 1( inositolrequiring1,IRE1) 二聚化，并招募TRAF2以及ASK1共同形成IRE-1-TRAF2-ASKl復(fù)合物，啟動(dòng)JNK下游凋亡信號(hào)；并可將XBP1-U 剪接成具有高度轉(zhuǎn)錄活性的 XBP1-S，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊的相關(guān)基因表達(dá)[11-12]。生長停滯及DNA損傷誘導(dǎo)基因153(CHOP)作為ERS凋亡途徑被激活的主要標(biāo)志之一[13-14]。CHOP 的表達(dá)在正常細(xì)胞的情況下非常少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，PERK、ATF6 轉(zhuǎn)錄的大量誘導(dǎo)時(shí)時(shí)CHOP 的表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平上顯著增加，CHOP的表達(dá)被上調(diào)從而加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生，引起細(xì)胞分裂周期停滯及DNA 損傷，并抑制抗凋亡相關(guān)基因 BCL-2和增強(qiáng)凋亡相關(guān)蛋白Caspase12表達(dá)激活的Caspase-12移位到細(xì)胞質(zhì)逐步激活Caspase-9和Caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)中顯示無水乙醇誘導(dǎo)LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡明顯升高，說明大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以刺激肝癌細(xì)胞的凋亡發(fā)生。同時(shí)，無水乙醇誘導(dǎo)LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，LO2、HepG2、和SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12 mRNA和蛋白表達(dá)含量顯著升高，其中細(xì)胞內(nèi)mRNA和蛋白含量表達(dá)的高低次序?yàn)镾MMC-7721、HepG2 和LO2細(xì)胞；Bcl-2 mRNA表達(dá)和蛋白含量顯著降低，其中細(xì)胞內(nèi)mRNA和蛋白含量表達(dá)的高低次序?yàn)長O2、HepG2 和SMMC-7721細(xì)胞說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE-1、XBP-1和CHOP被IRE-1/XBP-1信號(hào)通路激活，進(jìn)而引發(fā)凋亡蛋白Caspase12釋放，促進(jìn)和加速肝癌細(xì)胞的死亡，且隨著肝癌細(xì)胞惡性程度的增高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及IRE-1/XBP-1信號(hào)通路表達(dá)更為明顯。綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后LO2、 HepG2 和SMMC-7721 細(xì)胞中IRE-1/XBP-1的表達(dá)水平顯著升高，有效參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖發(fā)展，可為治療肝癌提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為未來臨床治療肝癌的定向靶點(diǎn)提供有效的基礎(chǔ)。