金錢草組織培養(yǎng)及其快速繁殖研究

楊冬業(yè) 張麗珍 韋雅芳

摘要[目的]建立金錢草莖段組織培養(yǎng)再生體系。[方法]于4、5月取當(dāng)年生金錢草莖段為外植體，MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)、增殖、生根過程的影響。[結(jié)果]MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.20～0.50mg/L適合金錢草不定芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為100%;MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.10～0.20mg/L適合繼代增殖培養(yǎng);1/2MS+IBA0.50mg/L+NAA0.1～0.5mg/L適合不定根誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高達(dá)100%;組培苗移植到盛有腐殖質(zhì)花盆中，成活率為100%。[結(jié)論]該研究可為金錢草野生種質(zhì)資源保存和優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞金錢草;組織培養(yǎng);再生

中圖分類號(hào)S503.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0090-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

金錢草（LysimachiachristinaeHance.）為報(bào)春花科珍珠菜屬植物，分布于云南、廣西、四川、貴州、河南、湖北、湖南、江蘇、陜西、江西、安徽、浙江等地。金錢草味苦、酸、微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經(jīng)。清熱解毒，利尿排石，活血化瘀，用于治療肝、膽結(jié)石，膽囊炎，黃疸型肝炎，泌尿系結(jié)石，水腫，跌打損傷，毒蛇咬傷及藥物中毒[1-3]。近年來，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)金錢草在利膽排石方面進(jìn)行了大量臨床應(yīng)用。對(duì)金錢草在排石、利膽利肝、抗炎、抗氧化等多方面的藥理作用進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)金錢草對(duì)腎結(jié)石和膽結(jié)石都有防治作用，對(duì)治療肝膽系統(tǒng)的炎癥更顯優(yōu)勢(shì)[4-6]。傳統(tǒng)上金錢草繁殖以分株繁殖和種子繁殖為主，亦可扦插繁殖。近年來由于過度的采摘利用，金錢草野生資源幾乎枯竭，目前金錢草雖然可以采用種子或扦插進(jìn)行人工繁殖栽培，但繁殖率低且苗勢(shì)退化現(xiàn)象嚴(yán)重。植物組織培養(yǎng)是指以離體植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并誘導(dǎo)其增殖、分化，建立無性繁殖體系，或獲取人類所需要的植物細(xì)胞產(chǎn)物的技術(shù)過程。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)擴(kuò)大繁殖金錢草是一條較好的解決途徑。采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，可以保持金錢草品種優(yōu)勢(shì)，避免由于種子繁殖引起雜種分離，并有助于對(duì)金錢草抗真菌、抗細(xì)菌、抗蟲等基因工程研究的順利進(jìn)行。筆者利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，建立金錢草無性繁殖體系，以期為金錢草人工選育及工廠化育苗提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)于2016年3月—2018年6月在桂林師范高等?？茖W(xué)校分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。金錢草由廣西植物研究所提供，取4、5月金錢草新生枝條為材料進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。截取粗壯、生長(zhǎng)良好的金錢草植株，剪去帶柄葉片，用洗潔精清洗腋芽和莖干，自來水沖洗清洗液的泡沫，再用自來水流動(dòng)沖洗2h。在無菌超凈臺(tái)上，將金錢草莖干剪成帶有莖節(jié)小段，置于無菌三角瓶中，0.1%升汞消毒10min，無菌蒸餾水清洗2～3次，接種到金錢草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中均添加3%蔗糖和0.8%瓊脂。置于（25±1）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，觀察并記錄其生長(zhǎng)情況，分化率=發(fā)芽外植體數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.2

繼代增殖培養(yǎng)。當(dāng)金錢草側(cè)芽長(zhǎng)至2～3cm時(shí)，可轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，置于（25±1）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，定期觀察并記錄生長(zhǎng)情況。

1.2.3

生根培養(yǎng)。取生長(zhǎng)良好、莖節(jié)間均勻、高度3～4cm的苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。截取生長(zhǎng)良好的組培苗2～3cm，轉(zhuǎn)接到附加有不同濃度IBA的1/2MS誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，置于（25±1）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，觀察并記錄其生長(zhǎng)情況。

1.2.4

移栽。當(dāng)組培苗植株不定根長(zhǎng)至3～5cm時(shí)，打開瓶塞，煉苗2～3d，再移植到盛有腐殖質(zhì)的花盆中，前3d進(jìn)行遮陰，注意保濕，觀察統(tǒng)計(jì)組培苗生長(zhǎng)情況及成活率。

2結(jié)果與分析

2.1金錢草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

以金錢草嫩莖段為外植體誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，建立金錢草高效繁殖再生體系。將金錢草外植體接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，第8天觀察到個(gè)別外植體莖節(jié)處出現(xiàn)不定芽，20d后觀察到不定芽長(zhǎng)至1cm左右（圖1），30d后觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

從表1可以看出，不同濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比對(duì)金錢草外植體不定芽誘導(dǎo)的影響是不同的。低濃度細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)少數(shù)不定芽，而且不定芽生長(zhǎng)較快，誘導(dǎo)率較高;高濃度細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)較多不定芽，但容易出現(xiàn)愈傷組織，濃度越高愈傷組織越多。對(duì)照組沒有不定芽產(chǎn)生，說明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)金錢草莖段不定芽誘導(dǎo)是必需的。綜上所述，金錢草莖段最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.20～0.50mg/L，在此條件下能誘導(dǎo)出較多不定芽，且均為有效芽，莖干粗壯，莖節(jié)間距適中，葉片伸展翠綠，適合繼代增殖培養(yǎng)。

2.2金錢草繼代培養(yǎng)

當(dāng)金錢草側(cè)芽長(zhǎng)至2～3cm時(shí)，可轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，20d后觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

由表2可知，當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2～0.5mg/L+IBA0.02～0.05mg/L時(shí)，不定芽粗壯，高達(dá)3～4cm，葉片較大伸展，呈嫩綠色，適合用于生根培養(yǎng)（圖2）;當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.10～0.20mg/L時(shí)，增殖系數(shù)較高，有效不定芽為5～10個(gè)，適合用于增殖培養(yǎng)。

2.3金錢草生根培養(yǎng)

取生長(zhǎng)良好、莖節(jié)間均勻、高度3～4cm的苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，10d左右出現(xiàn)不定根，20d觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

由表3可知，金錢草不定根容易誘導(dǎo)，低濃度生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)出不定根，而且生長(zhǎng)良好（圖3）。當(dāng)向1/2MS培養(yǎng)基中添加0.50mg/LIBA+0.1～0.5mg/LNAA組合生長(zhǎng)素時(shí)，生根率高達(dá)100%，組培苗根系旺盛，有氣生根，多根毛，葉子深綠，植株健壯，適合移栽。

2.4移栽

當(dāng)組培苗植株不定根長(zhǎng)至3～5cm時(shí)，打開瓶塞，煉苗2～3d，再移植到盛有腐殖質(zhì)花盆中，移栽20d，成活率達(dá)100%（圖4）。

3討論

3.1外植體滅菌劑的選擇

取自自然界中的外植體，一般

帶有多種生長(zhǎng)迅速的微生物，其在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中會(huì)大量繁殖，使得培養(yǎng)基被感染，從而抑制培養(yǎng)物生長(zhǎng)。因此初代培養(yǎng)前必須對(duì)外植體進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。滅菌劑的選擇和處理時(shí)間的長(zhǎng)短取決于外植體對(duì)試劑的敏感性。對(duì)滅菌劑敏感的外植體，一般選用易分解的次氯酸鈉，滅菌時(shí)間不宜過長(zhǎng);而對(duì)滅菌劑不敏感的，一般選用毒性較強(qiáng)的升汞消毒，且滅菌時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。升汞溶液幾乎可以殺死自然界中大部分微生物，是所有滅菌劑中滅菌效果最好的。但是用升汞溶液滅菌也有缺點(diǎn)，就是溶液濃度過高或者滅菌時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)毒死幼嫩的外植體，濃度過低或滅菌時(shí)間短又不能殺死外植體表面的微生物，使得試驗(yàn)過程中培養(yǎng)基受到污染而發(fā)霉長(zhǎng)菌。該試驗(yàn)選用0.1%升汞溶液作為金錢草滅菌劑，滅

菌時(shí)間為10min。此處理方式，雖然也有極個(gè)別金錢草莖段被殺死和感染，但是絕大多數(shù)的金錢草莖段都未被污染，達(dá)到了很好的滅菌效果。

3.2外植體的增殖及繼代培養(yǎng)

外植體進(jìn)行無菌接種后，隨之而來的是外植體不定芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)分化。從外植體分化產(chǎn)生的叢生芽、不定芽數(shù)量少，達(dá)不到直接生產(chǎn)生根苗的階段，必須進(jìn)一步培養(yǎng)增殖，才能達(dá)到快速繁殖的目的。在適宜培養(yǎng)基和適宜培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)物或外植體能按幾何倍數(shù)增殖[7]。進(jìn)行多次增殖培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最初2次增殖培養(yǎng)，金錢草植株生長(zhǎng)速度較快，一般在20～25d就可以長(zhǎng)至5cm左右，植株粗壯、伸展、葉片翠綠，但增殖系數(shù)較低。隨后繼代增殖培養(yǎng)時(shí)，金錢草的生長(zhǎng)速度比較慢，60d才長(zhǎng)至5cm，但增殖系數(shù)較高。

3.3不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響

在進(jìn)行金錢草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)及不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，一般使用6-BA、NAA及IBA等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。適宜濃度的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配比有利于不定芽的形成及生長(zhǎng)[8]。但若細(xì)胞分裂素的濃度過高，會(huì)形成過多的不定芽，

從而使不定芽的長(zhǎng)勢(shì)受到抑制，結(jié)果使植株過于纖細(xì)、密集，小苗不能生長(zhǎng)，很難獲得健壯組培苗;若細(xì)胞分裂素的濃度過低，繁殖系數(shù)降低，利于植株生長(zhǎng)。在金錢草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)及不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度都在不斷地變換，從而使金錢草莖能夠快速增殖生長(zhǎng)。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加相同濃度的IBA和6-BA時(shí)，主要誘導(dǎo)出金錢草不定根，抑制不定芽生長(zhǎng)。IBA濃度過高時(shí)，組培苗的葉片縮皺而卷曲，不利于植株生長(zhǎng)。

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