宋麗麗 張永良 張志平 王光路 楊旭 張靖楠

摘要：以白腐菌P. chrysosporium為對(duì)象，采用連續(xù)傳代馴化的方法提升菌體對(duì)煙堿的耐受度.通過(guò)比較人工陳化與液體發(fā)酵對(duì)煙梗中木質(zhì)素的降解效率，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明，馴化后的白腐菌P. chrysosporium可有效定植于煙梗上，在34 ℃，接種量6%的最適發(fā)酵條件下液體發(fā)酵24 h，煙梗中木質(zhì)素含量為1.93%，降解了23.11%，

與人工陳化3個(gè)月煙梗木質(zhì)素降解情況相當(dāng)，總糖和葡萄糖含量分別增加10.84%和4.86%，在一定程度上消除了蛋白質(zhì)燃燒產(chǎn)生的不良?xì)馕?，改善了煙梗燃燒時(shí)產(chǎn)生的木質(zhì)氣.

關(guān)鍵詞：煙梗;白腐菌;木質(zhì)素;液體發(fā)酵;連續(xù)傳代馴化

中圖分類號(hào)：TS49文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.005

文章編號(hào)：2096-1553（2019）01-0036-07

0 引言

煙梗是煙葉的重要組成部分，通過(guò)梗葉分離，可得到占煙葉總重25%左右的煙梗[1].我國(guó)是煙草大國(guó)，每年通過(guò)打葉復(fù)烤產(chǎn)生大量的煙梗，但目前這部分煙草副產(chǎn)物的綜合利用程度較低[2-3].煙梗中總糖和煙堿含量較低，而纖維素和木質(zhì)素等細(xì)胞壁物質(zhì)含量高，造成了糖堿比的失調(diào)，燃吸時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性和雜氣，澀口，香氣量少[4].因此，改善煙梗及其制品的內(nèi)在品質(zhì)，提高梗絲的香氣、吃味和梗絲填充值成為煙草工業(yè)研究的熱點(diǎn).

煙草中的木質(zhì)素是由芥子醇、香豆醇和松柏醇等苯丙烷衍生物單體構(gòu)成的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜、無(wú)定型且具有生物多態(tài)性的生物大分子，它填充在半纖維素和纖維素的空隙之間且緊密結(jié)合，共同形成了細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)[5-6].木質(zhì)素作為生物質(zhì)的三大主要成分之一，在熱解時(shí)會(huì)產(chǎn)生甲基酚、二甲基酚和兒茶酚等有害物質(zhì).減少煙草薄片中的木質(zhì)素含量既有利于減少煙草薄片燃燒時(shí)產(chǎn)生的有害物質(zhì)，也能改善煙草薄片的吸味[7-8].同時(shí)，煙梗中糖堿比失調(diào)造成的吸食品質(zhì)不佳也限制了煙梗在卷煙中的添加比例[9].利用微生物的方法對(duì)煙梗進(jìn)行發(fā)酵是提高煙梗利用價(jià)值的一條有效途徑.微生物能夠通過(guò)直接或間接利用煙葉或煙梗中的果膠、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和微量元素等，分解代謝合成出不同種類的生物酶，而生物酶能夠催化底物分子內(nèi)部某些化學(xué)鏈的斷裂，加速底物大分子的降解和某些有害物質(zhì)的分解，進(jìn)而通過(guò)特定微生物的吸收、利用、轉(zhuǎn)化，形成一系列有益小分子化合物，在煙草行業(yè)減毒加香方面具有廣闊的應(yīng)用前景[10-11].

白腐菌是對(duì)木質(zhì)素具有較強(qiáng)降解能力的一類真菌，它能夠通過(guò)分泌木質(zhì)素降解酶系對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行降解或改性，從而降低木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)屏障，使大分子化合物（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素）降解為低分子物質(zhì).利用白腐菌這一特性可對(duì)秸稈等草類原料進(jìn)行固體發(fā)酵處理，進(jìn)而對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行選擇性降解[12-13].利用白腐菌降解煙梗中的木質(zhì)素，不僅能夠降低煙梗在抽吸時(shí)產(chǎn)生的刺激性及木質(zhì)氣，而且可以將大分子化合物改性降解，使小分子化合物有效釋放，對(duì)改善煙氣香味有著潛在的貢獻(xiàn)[14].遲建國(guó)[15]利用白腐菌降低煙葉中木質(zhì)素的含量，達(dá)到了降低卷煙煙氣雜氣、提升卷煙吸食品質(zhì)的目的.劉志昌等[16]使用經(jīng)白腐菌Coriolus versicolor T42處理后的煙梗制備重組煙葉，并將其添加至卷煙中，卷煙的香氣、雜氣、刺激性和協(xié)調(diào)性都得到了明顯改善.白腐菌由于具有選擇性降解木質(zhì)素的特性，在改善煙梗品質(zhì)和提高煙梗利用率方面有極大的應(yīng)用潛力.黃孢原毛平革菌（P. chrysosporium）是白腐菌的模式菌株，在污水處理、土壤修復(fù)以及降解木質(zhì)素方面均有廣泛的應(yīng)用[6]，但對(duì)煙梗木質(zhì)素降解和品質(zhì)改善等的研究還鮮有涉及.鑒于此，本研究利用白腐菌模式菌株黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium）降解煙梗中的木質(zhì)素，參照人工陳化煙梗木質(zhì)素的降解情況，選擇適宜的白腐菌液體發(fā)酵煙梗條件，以快速降低煙梗中木質(zhì)素的含量，達(dá)到改善煙梗內(nèi)在品質(zhì)、提升煙梗利用率、降低卷煙生產(chǎn)成本的目的.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

白腐菌P. chrysosporium，來(lái)源于鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4 ℃條件下斜面保存.

煙梗，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供，自然晾干后存放.

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：土豆200 g/L，蔗糖20 g/L，121 ℃下滅菌20 min.

馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基）：土豆200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃下滅菌20 min.

煙梗培養(yǎng)基：將煙梗粉碎后過(guò)40目篩，稱取10 g置于250 mL三角瓶中，加入100 mL蒸餾水121 ℃下滅菌30 min.

儀器：UV-1800雙光速紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn);SW-CJ-1D凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn);LRH-1500F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn);QYC-2012C恒溫?fù)u床，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn);Agilent7820A高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn);MS205DU分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn);AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀，德國(guó)SEAL公司產(chǎn);PHS-3C 型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白腐菌P.chrysosporium馴化

由于煙梗中的煙堿對(duì)微生物有毒害作用，會(huì)抑制其生長(zhǎng)，因此采用逐級(jí)連續(xù)傳代馴化法對(duì)初始菌株進(jìn)行馴化，得到可以在高濃度煙堿條件下生長(zhǎng)的白腐菌P. chrysosporium菌種.具體馴化過(guò)程見(jiàn)表1.

1.2.2 煙梗人工陳化

將經(jīng)過(guò)馴化的白腐菌P. chrysosporium制成孢子懸液（7.50×108個(gè)/mL），均勻噴灑于煙梗表面，控制煙梗濕度為65%，將煙梗置于鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工陳化（室內(nèi)溫度10～35 ℃，相對(duì)濕度 40%～70%），陳化過(guò)程中注意通風(fēng)和防蟲(chóng).分別在陳化 0個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月時(shí)取樣，進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分分析.

1.2.3 煙?；瘜W(xué)成分測(cè)定

按照煙草化學(xué)成分測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定煙梗中總糖、葡萄糖、總氮、煙堿[17-19].煙梗中纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定方法參照美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室NREL制定的標(biāo)準(zhǔn)[20].有機(jī)酸測(cè)定采用王瑞新的方法[21].水溶液pH值采用pH計(jì)法測(cè)定[22].

1.2.4 白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵煙梗

將白腐菌P. chrysosporium斜面菌種接種于PDB培養(yǎng)基，在30 ℃，150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，在無(wú)菌條件下接種6 mL種子液于煙梗培養(yǎng)基中，于30 ℃下培養(yǎng).

1.2.5 不同發(fā)酵條件下煙梗木質(zhì)素含量的測(cè)定

1.2.5.1 發(fā)酵時(shí)間 吸取6 mL種子液加入煙梗培養(yǎng)基中，將接種白腐菌P. chrysosporium后的煙梗培養(yǎng)基于30 ℃下培養(yǎng)40 h，每隔4 h取樣1次，測(cè)定煙梗木質(zhì)素含量.

1.2.5.2 培養(yǎng)溫度

吸取6 mL種子液加入煙梗培養(yǎng)基中，將接種白腐菌P. chrysosporium后的煙梗培養(yǎng)基分別置于25 ℃，28 ℃，31 ℃，34 ℃，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定煙梗木質(zhì)素含量.

1.2.5.3 接種量 分別吸取2 mL，4 mL，6 mL和8 mL種子液加入煙梗培養(yǎng)基中，接種量為2%，4%，6%和8%，在最適溫度下培養(yǎng)24 h，測(cè)定煙梗木質(zhì)素含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種馴化結(jié)果

馴化處理前后煙梗培養(yǎng)基上菌種直徑變化情況見(jiàn)表2.由表2可知，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性培養(yǎng)后，白腐菌P. chrysosporium在含有煙梗培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度發(fā)生明顯變化.經(jīng)過(guò)馴化后，白腐菌P. chrysosporium在含0.1 %煙梗的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度顯著提高，不僅延遲期明顯縮短，而且生長(zhǎng)速率加快.馴化前白腐菌P. chrysosporium需要72 h菌絲直徑生長(zhǎng)至1.5 cm，而馴化后只需要24 h直徑就可以達(dá)到相同長(zhǎng)度，培養(yǎng)時(shí)間明顯縮短.因此，經(jīng)過(guò)馴化后的菌種可以在煙梗培養(yǎng)基上較快生長(zhǎng)，適合快速處理煙梗以降解其木質(zhì)素.

2.2 煙梗人工陳化結(jié)果

經(jīng)過(guò)人工陳化后煙梗的化學(xué)成分會(huì)發(fā)生較大的變化，經(jīng)不同陳化時(shí)間的煙梗，其化學(xué)成分含量的變化見(jiàn)表3.由表3可知，煙梗木質(zhì)素含量隨著陳化時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)下降趨勢(shì).經(jīng)過(guò)3個(gè)月的陳化，煙梗中總糖含量降低14.58%，葡萄糖含量降低17.61%，木質(zhì)素含量降低 21.31%，纖維素含量降低1.44%，有機(jī)酸含量增加7.21%，而煙堿和總氮含量基本沒(méi)有變化.這與隨著人工陳化過(guò)程中煙葉pH值的降低、有機(jī)酸含量逐漸增加[11]的研究結(jié)果一致.說(shuō)明人工陳化過(guò)程中白腐菌P. chrysosporium和煙梗中土著微生物菌群消耗利用掉煙梗中的糖類物質(zhì)，同時(shí)木質(zhì)素也有較大程度的降解，人工陳化過(guò)程對(duì)煙梗中各成分發(fā)生較大改變有一定影響.

2.3 白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵煙梗木質(zhì)素含量變化情況

圖1為白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵后的煙梗.由圖1可知，利用白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵煙梗后，煙梗顏色及質(zhì)地發(fā)生一定程度的變化.發(fā)酵24 h，煙梗中的木質(zhì)素降解了19.12%，發(fā)酵40 h后，木質(zhì)素含量進(jìn)一步減少，同原料相比降解了24.26%，但是發(fā)酵40 h煙梗失去了本色.同煙梗人工陳化過(guò)程相比，白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵24 h煙梗中木質(zhì)素的含量與人工陳化3個(gè)月相當(dāng)，說(shuō)明白腐菌液體發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)對(duì)煙梗中木質(zhì)素的快速降解.

煙梗的人工陳化和液體發(fā)酵都可以在一定程度上降解煙梗中木質(zhì)素的含量，但是降解效率相差很大.人工陳化過(guò)程中，煙梗在較高的水分含量下會(huì)發(fā)生一定程度的霉變，降低煙梗的實(shí)用性，其間還要防止蟲(chóng)蛀的影響，如果加工不慎就會(huì)出現(xiàn)資源浪費(fèi)的現(xiàn)象.而液體發(fā)酵可以快速降解木質(zhì)素的含量，且發(fā)酵周期較短，故選擇液體發(fā)酵來(lái)降解木質(zhì)素的研究更有價(jià)值.

2.4 白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵煙梗不同條件測(cè)試與優(yōu)選

白腐菌P. chrysosporium的生長(zhǎng)過(guò)程及產(chǎn)酶條件受到多種環(huán)境條件的影響[5]，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和接種量是影響煙梗中木質(zhì)素降解速率的重要因素，選擇適合的條件進(jìn)行煙梗生物處理，將會(huì)大大提高發(fā)酵效率.

2.4.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響

發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響煙梗木質(zhì)素的降解速率，在30 ℃，接種量6%條件下，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，煙梗中木質(zhì)素在發(fā)酵過(guò)程的前24 h快速降解，在24 h時(shí)煙梗中木質(zhì)素含量為 2.03%，降解了19.12%，24 h后煙梗中木質(zhì)素含量逐漸趨于平穩(wěn)，白腐菌降解木質(zhì)素為次級(jí)代謝反應(yīng)[5]，而本研究中白腐菌P. chrysosporium經(jīng)馴化后對(duì)煙梗的降解速率增快，縮短了發(fā)酵時(shí)間.因此，選擇24 h作為最適發(fā)酵時(shí)間.

2.4.2 發(fā)醇溫度對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響

發(fā)酵溫度影響菌種的生長(zhǎng)速率，同時(shí)木質(zhì)素降解酶的活力高低也受到溫度的影響，因此適宜的發(fā)酵溫度是影響木質(zhì)素降解的重要因素.在接種量6%條件下發(fā)酵24 h，考察發(fā)酵溫度對(duì)煙梗中木質(zhì)素含量的影響，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，在低于34 ℃條件下，木質(zhì)素的降解速率隨發(fā)酵溫度的增加而增加，34 ℃下發(fā)酵24 h后，木質(zhì)素含量為1.93%，降解率了23.22%.當(dāng)超過(guò)34 ℃時(shí)，由于白腐菌P. chrysosporium生長(zhǎng)受到抑制，煙梗中的木質(zhì)素降解速率下降.因此，選擇最適發(fā)酵溫度為34 ℃.

2.4.3 接種量對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響

在34 ℃條件下發(fā)酵24 h，考察接種量對(duì)煙梗中木質(zhì)素含量的影響，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，在接種量小于6%條件下，隨著接種量的增加，木質(zhì)素的降解速率加快，煙梗中木質(zhì)素含量分別為2.29%，2.14%，1.93%，對(duì)應(yīng)降解率為8.76%，14.74%，23.11%.當(dāng)接種量超過(guò)6%后，木質(zhì)素的降解速率反而有所下降，為22.71%.從節(jié)約成本考慮，選擇適宜的接種量為6%.

2.5 白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵后煙?；瘜W(xué)成分變化分析

在發(fā)酵溫度34 ℃，接種量6%條件下，白腐菌P.chrysosporium發(fā)酵煙梗24 h后，煙梗中化學(xué)成分變化如表4所示.由表4可知，白腐菌液體發(fā)酵后，總糖和葡萄糖含量分別增加 10.84% 和4.86%，這是因?yàn)闊煿０l(fā)酵過(guò)程中微生物需要消耗部分基質(zhì)以供自身生長(zhǎng)需要，即通過(guò)從固形物中降解大分子底物（如纖維素）生成部分糖，因此總糖和葡萄糖含量增加.總糖含量的提高可以在一定程度上消除蛋白質(zhì)燃燒產(chǎn)生的不良?xì)馕?，?duì)煙梗的品質(zhì)起到平衡作用.木質(zhì)素的含量減少23.11%，可明顯降低煙梗在燃燒時(shí)產(chǎn)生的木質(zhì)氣，提高煙草薄片的吸味.總氮和煙堿含量并未發(fā)生明顯變化，有機(jī)酸含量增加，與煙梗人工陳化3個(gè)月時(shí)間化學(xué)成分情況一致.

3 結(jié)論

本研究以馴化后的白腐菌P. chrysosporium處理煙梗，利用液體發(fā)酵法降解煙梗中的木質(zhì)素，相較于人工陳化煙梗，白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵周期短，對(duì)木質(zhì)素的降解率較高.通過(guò)優(yōu)選發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量，確定了P. chrysosporium降解煙梗木質(zhì)素的最適發(fā)酵條件：在34 ℃，6%接種量下發(fā)酵24 h.該條件下液體發(fā)酵煙梗中木質(zhì)素含量為1.93%，降低了23.11%，總糖和葡萄糖含量分別增加10.84%和4.86%，在一定程度上消除了蛋白質(zhì)燃燒產(chǎn)生的不良?xì)馕?，改善了煙梗燃燒時(shí)產(chǎn)生的木質(zhì)氣.本研究可為煙草廢棄物高效生物轉(zhuǎn)化、提升煙梗利用效率、加快煙草副產(chǎn)物資源化綜合利用，提供參考和依據(jù).

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