小麥肉桂醇脫氫酶基因（TaCAD1）全長cDNA序列及生物信息學(xué)分析

盧雯瑩 葛昌斌 曹燕燕 黃杰 喬冀良 張振永 王君 齊雙麗 廖平安

摘 要：小麥（Triticum aestivum）是世界三大主糧之一，倒伏嚴(yán)重制約了小麥產(chǎn)量的提高。小麥肉桂醇脫氫酶基因（TaCAD1）是小麥木質(zhì)素合成的關(guān)鍵基因，小麥體內(nèi)木質(zhì)素含量越高，莖稈強(qiáng)度越高，抗倒伏能力隨之增強(qiáng)。為了探明小麥肉桂醇脫氫酶基因的生物學(xué)功能，對TaCAD1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：TaCAD1基因cDNA序列全長1311bp，包含1個(gè)長度為1083bp的開放閱讀框（ORF），編碼360個(gè)氨基酸。TaCAD1蛋白等電點(diǎn)（pI）為5.74，分子量為38625.45 Da，其不穩(wěn)定系數(shù)為23.91，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。推導(dǎo)的TaCAD1蛋白為疏水性蛋白，不存在跨膜區(qū)，可能位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件主要為無規(guī)卷曲。TaCAD1蛋白在進(jìn)化過程中較為保守，與節(jié)節(jié)麥、大麥、高羊茅、黑麥草、短花藥野生稻CAD蛋白的一致性達(dá)94.81%。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究TaCAD1在小麥抗倒伏過程中的作用及小麥抗倒伏的分子育種提供參考。

關(guān)鍵詞：小麥;肉桂醇脫氫酶;木質(zhì)素;抗倒伏;生物信息學(xué)分析

中圖分類號 S512 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）11-0016-05

Full-length cDNA Sequence and Bioinformatics Analysis of Cinnamyl Alcohol Delivering Enzyme Gene （TaCAD1） in Triticum aestivum

LU Wenying? ?GE Changbin? ?CAO Yanyan? ?HUANG Jie? ?QIAO Jiliang? ?ZHANG Zhenyong? ?WANG Jun

QI Shuangli? ?LIAO Pingan

（Luohe Academy of Agricultural Science， Luohe 462300， China）

Abstract： Wheat（Triticum aestivum） is one of the world's three major staple foods， and wheat lodging has severely restricted the increase in wheat production. The wheat cinnamyl alcohol dehydrogenase gene （TaCAD1） is a key gene for wheat lignin synthesis. The higher the lignin content in wheat， the higher the stalk strength and the enhanced lodging resistance. In order to ascertain the biological function of wheat cinnamyl alcohol dehydrogenase gene， this paper conducts bioinformatics analysis on the amino acid sequence encoded by TaCAD1 gene. Bioinformatics analysis showed that the full-length cDNA sequence of TaCAD1 was 1311 bp， including an open reading frame （ORF） of 1083 bp in length， encoding 360 amino acids. The isoelectric point （pI） of TaCAD1 protein is 5.74， the molecular weight is 38，625.45 Da， and its instability coefficient is 23.91， which is a stable protein. The deduced TaCAD1 protein is a hydrophobic protein， there is no transmembrane region， and may be located in the cytoplasm. The secondary structure of the protein is mainly random coils. The TaCAD1 protein is relatively conservative in the evolutionary process， and it is 94.81% consistent with the CAD protein of Jiejie wheat， barley， tall fescue， ryegrass， and short anther wild rice. This study provides new ideas for further exploring the role of TaCAD1 in the process of wheat lodging resistance and molecular breeding of wheat lodging resistance.

Key words： Wheat; Cinnamyl alcohol dehydrogenase; Lignin; Lodging resistance; Bioinformatics Analysis

小麥作為三大主要糧食作物之一，在世界廣泛種植，其播種面積和產(chǎn)量在各類糧食作物中均居首位，目前世界1/3的人口是以小麥為主食。我國是重要的小麥生產(chǎn)大國之一，小麥產(chǎn)量、消費(fèi)量居于世界前列。近年來，我國小麥生產(chǎn)發(fā)展迅速，但倒伏與高產(chǎn)間的矛盾日益突出。小麥發(fā)生倒伏的主要位置是莖稈[1]，嚴(yán)重倒伏的小麥種植區(qū)域可能導(dǎo)致產(chǎn)量減少80%左右[2]。

木質(zhì)素是一類復(fù)雜的酚類聚合體，在植物體內(nèi)所占比重較高，是構(gòu)成植物次生細(xì)胞壁的重要成分之一。木質(zhì)素能夠通過自身的交織作用加厚細(xì)胞壁，進(jìn)而加強(qiáng)植物莖稈強(qiáng)度，起到抗壓作用[3]。木質(zhì)素在小麥體內(nèi)含量的多少與小麥莖稈的抗倒伏特性存在一定關(guān)系[4]。Welton的研究表明，若減弱小麥莖稈的機(jī)械強(qiáng)度，小麥倒伏容易發(fā)生，且小麥體中木質(zhì)素含量隨之降低[5];若小麥莖稈機(jī)械強(qiáng)度增加，小麥抗倒伏能力增強(qiáng)，小麥體中木質(zhì)素含量相應(yīng)升高[6]。

木質(zhì)素的沉積主要發(fā)生在細(xì)胞生長完成、次生壁加厚的特定時(shí)期[7]。其在植物體內(nèi)的生物合成過程復(fù)雜[8]，大致分為三部分：莽草酸途徑、苯丙烷途徑和木質(zhì)素的特異合成途徑[9]。肉桂醇脫氨酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）催化肉桂醛還原成相應(yīng)的肉桂醇，是木質(zhì)素合成途徑最后一步的關(guān)鍵酶[10]。Ma[11]從小麥中分離出1個(gè)可以編碼CAD基因的cDNA——TaCAD1，TaCAD2和TaCAD4可能不具有酶活性[12]。TaCAD1基因在莖稈中高表達(dá)，葉片中表達(dá)量次之，根中幾乎不表達(dá);抗倒伏小麥品種mRNA的表達(dá)豐度、酶活性均高于不抗倒伏的小麥品種[11]。

1 材料和方法

1.1 小麥肉桂醇脫氫酶基因的cDNA序列搜索 搜索GenBank中注冊的小麥CAD基因（TaCAD1）的全長cDNA序列（GU563724），將其開放閱讀框翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.2 TaCAD1蛋白的生物信息學(xué)分析 使用ExPASy服務(wù)器中ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）得到小麥肉桂醇脫氫酶TaCAD1的等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、平均疏水性和分子量等理化性質(zhì);ProtScale在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測氨基酸序列親/疏水性預(yù)測圖;通過SignalP-5.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）對小麥肉桂醇脫氫酶進(jìn)行相關(guān)信號肽的預(yù)測與分析;應(yīng)用在線軟件工具PSORT II Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測亞細(xì)胞定位;用ExPASy服務(wù)器中TMHMM Server v. 2.0在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）獲得小麥肉桂醇脫氫酶蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;使用NPS軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。利用DNAMAN 8.0軟件，對TaCAD1蛋白的氨基酸序列與其他同源物種進(jìn)行同源性比對分析，在MEGA 6.0軟件的支持下，構(gòu)建TaCAD1與不同植物CAD蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。運(yùn)用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件工具，對TaCAD1蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模。在NCBI官方網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中能夠預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）的幫助下，分析TaCAD1蛋白序列是否具有典型的CAD基因家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaCAD1基因cDNA序列的ORF 小麥TaCAD1基因的cDNA序列全長1311 bp，包含1個(gè)長度為1083bp的開放閱讀框（ORF），可編碼360個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 TaCAD1蛋白一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) 用ExPASy服務(wù)器中ProtParam得到TaCAD1蛋白序列的物理化學(xué)性質(zhì)，見表1。表1顯示，小麥肉桂醇脫氫酶編碼360個(gè)氨基酸，分子量為38625.45 Da;等電點(diǎn)為5.74，判斷為堿性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)Ⅱ?yàn)?3.91，小于40，分類為穩(wěn)定蛋白。該蛋白質(zhì)中共包含20種氨基酸，含量最高的為纈氨酸（Val），所占比例為13.1%。

用ExPASy服務(wù)器中ProtScale在線軟件獲得氨基酸序列親/疏水性預(yù)測圖（圖5），結(jié)果表明TaCAD1蛋白的親水性平均系數(shù)（GRAVY）為0.011，多肽鏈中具有最低分值（-2.211）的是位于第216位的賴氨酸（K），親水性最強(qiáng);具有最高分值（2.700）的是位于第95位的甘氨酸（G），疏水性最強(qiáng)。疏水氨基酸（正值）稍多于親水氨基酸（負(fù)值），推測小麥肉桂醇脫氫酶基因編碼氨基酸序列對應(yīng)的蛋白質(zhì)為疏水性蛋白。

2.3 TaCAD1蛋白亞細(xì)胞定位 使用應(yīng)用在線軟件工具PSORT II Prediction預(yù)測TaCAD1蛋白亞細(xì)胞定位的結(jié)果（表2）顯示：該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)的概率為0565，位于細(xì)胞核的概率為0.130，位于線粒體基質(zhì)的概率為0.130。因此，推斷該蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大。

2.4 TaCAD1蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析 應(yīng)用SignalP-5.0軟件預(yù)測小麥肉桂醇脫氫酶基因所編碼的蛋白質(zhì)的信號肽，結(jié)果如圖3，該蛋白信號肽預(yù)測值為0.037，表明TaCAD1蛋白不存在信號肽區(qū)域，推測其可能為非分泌型蛋白。

TMHMM Serverv. 2.0在線工具輸入氨基酸序列預(yù)測小麥肉桂醇脫氫酶蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)果顯示（圖4），跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測圖無峰值，證明TaCAD1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，可能為非跨膜蛋白，且主要位于膜外區(qū)域。綜合上述信號肽分析和跨膜結(jié)構(gòu)域分析，推測該蛋白既不屬于分泌蛋白，也不能認(rèn)為是膜蛋白。該結(jié)論與亞細(xì)胞定位分析所顯示的TaCAD1蛋白可能位于細(xì)胞質(zhì)中的預(yù)測結(jié)果相吻合。

2.5 TaCAD1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用在線軟件NPS預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（表3，圖5），結(jié)果顯示TaCAD1主要由α-螺旋（Alpha helix）、延伸鏈（Extended strand）、無規(guī)卷曲（Random coil）3種結(jié)構(gòu)組成，其中無規(guī)卷曲是TaCAD1蛋白二級結(jié)構(gòu)最主要的結(jié)構(gòu)元件，占53.61%;α-螺旋和延伸鏈分別占23.33%和23.06%，無β-折疊。

2.6 TaCAD1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用SWISS-MODEL在線軟件工具對TaCAD1蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模，在RasTop軟件下對以上模型做相應(yīng)處理，構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖如圖6。由三維結(jié)構(gòu)圖不難發(fā)現(xiàn)，TaCAD1蛋白主要由無規(guī)卷曲構(gòu)成，這與前面對TaCAD1蛋白二級結(jié)構(gòu)所預(yù)測的結(jié)果一致。

2.7 TaCAD1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和功能預(yù)測 對TaCAD1蛋白進(jìn)行Protein Blast分析以判斷其可能存在的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見圖7。TaCAD1蛋白屬PLN02514超基因家族，含有PLN02514保守結(jié)構(gòu)域。

2.8 TaCAD1蛋白同源性分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 應(yīng)用DNAMAN 8.0軟件，對TaCAD1與節(jié)節(jié)麥、大麥、高羊茅、黑麥草、短花藥野生稻CAD的蛋白序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖8）顯示，TaCAD1蛋白與節(jié)節(jié)麥、大麥、高羊茅、黑麥草、短花藥野生稻的CAD氨基酸序列一致性高達(dá)94.81%。

利用Blastp同源搜索，構(gòu)建了TaCAD1與不同植物CAD蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，TaCAD1與高羊茅、黑麥草CAD編碼蛋白的同源性最高（圖9）。

3 結(jié)論與討論

肉桂醇脫氫酶是小麥莖稈木質(zhì)素生物合成途徑最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶之一。本研究通過NCBI搜索得到1個(gè)小麥肉桂醇脫氫酶基因（TaCAD1）cDNA序列，該序列全長1311 bp，包含1個(gè)長度為1083bp的開放閱讀框，編碼氨基酸個(gè)數(shù)為360個(gè)。木質(zhì)素是一種通過β-O-4、β-β、β-5、5-5等共價(jià)鍵連接形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子聚合物，甲氧基是木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中特征官能團(tuán)之一，因此其理化性質(zhì)比較穩(wěn)定。小麥TaCAD1推導(dǎo)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為23.91，是穩(wěn)定蛋白，符合木質(zhì)素理化性質(zhì)穩(wěn)定這一特性。TaCAD1蛋白分子量為38625.45 Da，等電點(diǎn)（pI）為5.74。此外，TaCAD1蛋白在進(jìn)化過程中較為保守，與節(jié)節(jié)麥、大麥、高羊茅、黑麥草、短花藥野生稻CAD蛋白的一致性達(dá)94.81%。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，TaCAD1蛋白與高羊茅和黑麥草CAD蛋白同源性最高。本研究獲得小麥肉桂醇脫氫酶（TaCAD1）全長cDNA序列及蛋白功能預(yù)測結(jié)果，將為下一步驗(yàn)證該基因功能奠定了理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步深入研究TaCAD1基因在小麥抗倒伏育種中的作用提供重要參考。

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基金項(xiàng)目：國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系漯河綜合試驗(yàn)站建設(shè)項(xiàng)目（CARS-3-2-26）。

作者簡介：盧雯瑩（1994—），女，河南漯河人，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：小麥遺傳育種。

通訊作者：廖平安（1964—），男，湖北鄂州人，研究員，研究方向：小麥育種。? 收稿日期：2021-12-14