煙曲霉YSITB I菌株篩選及其降解木質(zhì)纖維中木質(zhì)素研究

袁俊超等

摘要：天牛幼蟲腸道菌群具有分解木質(zhì)纖維的功能。本研究以木質(zhì)纖維為唯一碳源，從天牛幼蟲腸道中篩選出三株對(duì)木纖維具有降解能力的菌株，對(duì)其中的煙曲霉YSITB I菌株降解木纖維中木質(zhì)素能力及降解條件進(jìn)行研究，并對(duì)三種菌株降解木纖維中木質(zhì)素的協(xié)同作用進(jìn)行了初步觀察。結(jié)果顯示，煙曲霉YSITB I菌株具有較好的木質(zhì)素降解作用，在30 ℃、pH值6.8條件下，對(duì)構(gòu)樹木質(zhì)纖維中木質(zhì)素的降解率可達(dá)56.9%；枯草芽孢桿菌YSITBII和煙曲霉YSITB I協(xié)同作用可提高木質(zhì)素降解效率至64.8%；煙曲霉YSITB I 15d降解木纖維效率高于40%。煙曲霉對(duì)木質(zhì)纖維的降解作用達(dá)到甚至高于模式菌-黃包原毛平革菌，降解木纖維程度較高，用于木質(zhì)纖維脫木質(zhì)素或秸稈降解漚肥具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)素；天牛幼蟲；pH；溫度；協(xié)同性；煙曲霉菌；漚肥

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4164-04

天牛成蟲在樹木表皮上蛀槽或鉆洞產(chǎn)卵，卵孵化出幼蟲后即蛀入樹干，最初在樹皮下取食，待齡期增大后，即鉆入木質(zhì)部，在樹干內(nèi)越冬，通常可在樹干內(nèi)生活3～4個(gè)月甚至1～2年，以蛀食木質(zhì)部為生。其消化腸道是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，棲息著大量的微生物。這些微生物對(duì)宿主起著非常重要的作用，其中某些種類可能具有分解木質(zhì)纖維中的木質(zhì)素的能力[1-3]。本項(xiàng)目擬從天牛幼蟲腸道菌群中分離篩選具木質(zhì)素降解功能的菌株，探討其降解木質(zhì)素作用條件、降解效率以及影響因素，用于木質(zhì)纖維的再利用脫木質(zhì)素或廢棄木材和秸稈等的降解[4，5]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料 天牛幼蟲：2014年3月采自湖北咸寧蔡家?guī)X林場(chǎng)楊樹樹干。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）YSITB I菌株、枯草芽孢桿菌YSITB Ⅱ菌株、蠟樣芽孢桿菌YSITB Ⅲ菌株，由本試驗(yàn)分離篩選自天牛幼蟲腸道。黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）（CICC14076），由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存中心提供。木纖維是構(gòu)樹根提取黃酮后的殘?jiān)?，脫脂脫蛋白，低溫烘干，粉碎，淺黃色粉末。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。木纖維液體培養(yǎng)基：構(gòu)樹木纖維0.500 0 g，KH2PO4 0.215 0 g，（NH4）2SO4 0.216 0 g，MgSO4 0.007 3 g，CaCl2 0.015 0 g，加去離子水溶解至50 mL。木纖維固體培養(yǎng)基：在木纖維液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入4.5 g瓊脂，加熱融化。每種培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 木質(zhì)素（GR荷蘭DUCHEFA公司）、蒽酮（AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、溴乙酰（AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)有限公司UV759），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71）

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、純化及篩選 取天牛幼蟲一條，以75%的乙醇清洗，顯微鏡下取出腸道，加2 mL無(wú)菌水勻漿，梯度稀釋至10-8，分別取10-6、10-7、10-8三個(gè)梯度勻漿懸液200 μL涂布于木纖維固體培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次。37 ℃培養(yǎng)，隔天觀察。取各種不同單菌落再涂布于木纖維固體培養(yǎng)基上，在同樣條件下進(jìn)行2次純化培養(yǎng)。選擇生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，觀察各菌落對(duì)木質(zhì)纖維的降解作用。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察及鑒定 對(duì)生長(zhǎng)較好的3種主要菌株進(jìn)行菌落、菌絲及菌細(xì)胞觀察，真菌做ITS序列鑒定，細(xì)菌做16S序列鑒定。

1.2.3 煙曲霉YSITB I菌株降解木纖維觀察 選取其中生長(zhǎng)較好的1種菌株（編號(hào)為YSITB I，經(jīng)鑒定為煙曲霉）作進(jìn)一步降解木纖維作用觀察。取直徑約5 mm 煙曲霉YSITB I菌落1個(gè)，加2 mL滅菌水充分震蕩制成菌懸浮液。每30 mL木纖維液體培養(yǎng)基中接入200 μL菌懸液，橡膠塞塞緊，設(shè)為試驗(yàn)組。另取30 mL木纖維液體培養(yǎng)基，接入200 μL無(wú)菌水，作為空白對(duì)照組，每組平行接種3瓶，在恒溫空氣搖床30 ℃、100 r/min下培養(yǎng)。觀察記錄菌落生長(zhǎng)及木纖維降解情況。

1.2.4 煙曲霉YSITB I菌株降解木質(zhì)素條件選擇 溫度按1.2.3中試驗(yàn)方法和用量接種煙曲霉YSITB I，分別在10 ℃（室外）、15 ℃（室內(nèi)）、30 ℃、40 ℃、50 ℃共5個(gè)溫度條件下培養(yǎng)，每隔3 d取出200 μL培養(yǎng)液，用硫酸-蒽酮法[6]檢測(cè)溶液還原糖含量，共觀察15 d。最后，培養(yǎng)液過(guò)濾、洗滌、烘干，得木纖維殘?jiān)Q重，用溴乙酰法[7-9]測(cè)量木質(zhì)素含量。以黃孢原毛平革菌作對(duì)照進(jìn)行同樣的培養(yǎng)和處理。按下式計(jì)算木質(zhì)素降解率。

木質(zhì)素降解率=殘?jiān)心举|(zhì)素總量/原料中木質(zhì)素總量×100%

天牛幼蟲腸道液pH約6.5，觀察不同pH對(duì)煙曲霉降解木質(zhì)素的影響。以NaH2PO4-Na2HPO4緩沖系配制木纖維液體培養(yǎng)基，pH分別調(diào)為5.9、6.2、6.5、6.8、7.1，按1.2.3中試驗(yàn)方法和用量接種煙曲霉YSITB I，按以上取樣方法進(jìn)行檢測(cè)。以黃孢原毛平革菌作對(duì)照進(jìn)行同樣的培養(yǎng)和處理。

1.2.5 煙曲霉YSITB I菌株與兩種細(xì)菌菌株的協(xié)同降解木質(zhì)素作用 將煙曲霉YSITB I與枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌按下述方式組合，接種至30 mL木纖維液體培養(yǎng)基中，按1.2.3中試驗(yàn)方法處理培養(yǎng)。按1.2.4.取樣方法進(jìn)行檢測(cè)。組合①，200 μL的煙曲霉YSITB I菌液；組合②，100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+100 μL的枯草芽孢桿菌菌液；組合③，100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+100 μl的蠟樣芽孢桿菌菌液；組合④，100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+50 μL的枯草芽孢桿菌菌液+50 μL的蠟樣芽孢桿菌菌液。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

以木纖維固體培養(yǎng)基從天牛幼蟲腸道中分離篩選出3株長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株（圖1），分別為YSITB I、YSITB II和YSITB III。YSITB I：棉花樣，開始為白色，2～3 d后轉(zhuǎn)為綠色，數(shù)日后變?yōu)樯罹G色，呈粉末狀。YSITB II：圓點(diǎn)狀，乳白色，菌落大小不一，向上凸起。YSITB III：菌落較大，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或蠟狀，邊緣放射狀擴(kuò)散。圖2a為菌絲在木纖維上的生長(zhǎng)情況，菌絲包裹木纖維顆粒生長(zhǎng)，基部伸入纖維顆粒內(nèi)部，第二天開始出現(xiàn)孢子囊，孢子囊呈燒瓶狀，小梗單層，由多列菌絲排列成柵欄狀，頂端有鏈形分生孢子，分生孢子球形，有小棘，呈綠色，如圖2b所示。經(jīng)ITS序列鑒定，YSITB I為煙曲霉，YSITBⅡ和Ⅱ和YSITBⅢ經(jīng)16S序列鑒定，分別為枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。圖3是煙曲霉YSITB I的進(jìn)化樹。

2.2 煙曲霉YSITB I降解木纖維觀察

圖4a示煙曲霉YSITB I在木纖維液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)形成的菌絲團(tuán)，培養(yǎng)至第二天時(shí)菌絲團(tuán)直徑可達(dá)6 cm，纖維顆粒被菌絲包裹，溶液變得澄清透明，基本見(jiàn)不到明顯的木纖維顆粒；空白木纖維培養(yǎng)基在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)明顯變化，如圖4b。

2.3 煙曲霉YSITB I在不同條件下對(duì)木纖維的降解作用

2.3.1 溫度的影響 由表1可知，在考察的溫度范圍內(nèi)，煙曲霉YSITB I對(duì)木纖維中木質(zhì)素的降解率先隨溫度升高而增大，30 ℃時(shí)達(dá)到最大降解率45.1%，隨后隨溫度升高降解作用減小。黃孢原毛平革菌在溫度為15 ℃時(shí)，木質(zhì)素的最大降解率為39.2%，煙曲霉YSITB I對(duì)木質(zhì)素的最大降解率比黃孢原毛平革菌高出5.9個(gè)百分點(diǎn)。

對(duì)纖維素的降解作用以培養(yǎng)液中還原糖的變化表示，如圖5所示。溫度在30 ℃和40 ℃時(shí)，培養(yǎng)液中還原糖的含量較低，這應(yīng)是兩種作用的共同結(jié)果，一方面菌株生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的酶降解纖維素和半纖維素等物質(zhì)使糖含量不斷升高，另一方面菌株生長(zhǎng)不斷消耗糖，其一階段糖的生產(chǎn)量高于糖的消耗量，培養(yǎng)液中糖含量不斷增加，至第九天二者達(dá)到平衡，之后隨著菌株不斷生長(zhǎng)，糖消耗量超過(guò)糖的生產(chǎn)量，培養(yǎng)液中糖含量下降。50 ℃時(shí)培養(yǎng)液中還原糖含量隨時(shí)間逐漸下降，這可能提示較高溫時(shí)，酶活性下降。低溫時(shí)糖含量變化沒(méi)有明顯趨勢(shì)。

2.3.2 pH的影響 由表2可知，煙曲霉YSITB I在pH 6.8時(shí)，木質(zhì)素降解率最大，達(dá)56.9%，接近黃孢原毛平革菌的最大降解率60.3%，其他pH條件下，木質(zhì)素降解效率相差不明顯。培養(yǎng)液中還原糖含量的變化如圖6所示，總體上呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，至第九天達(dá)最大值，其中pH 6.8和pH 7.1時(shí)，還原糖含量較低，明顯低于其它pH條件下的含量。

2.4 不同菌株對(duì)木質(zhì)素的協(xié)同降解作用

由表4可知，煙曲霉YSITB I+枯草芽孢桿菌協(xié)同降解木質(zhì)素的效率達(dá)64.8%，比煙曲霉YSITB I單獨(dú)降解木質(zhì)素效率高出18.6個(gè)百分點(diǎn)，也明顯高于其他兩種組合的降解率，說(shuō)明煙曲霉YSITB I與枯草芽孢桿菌組合對(duì)木質(zhì)素的降解具有一定的協(xié)同性。但這種作用需要做進(jìn)一步觀察研究。煙曲霉YSITB I+蠟樣芽孢桿菌協(xié)同降解對(duì)含菌絲體木纖維的降解率為41.0%，比煙曲霉YSITB I單獨(dú)降解木質(zhì)纖維高出1個(gè)百分點(diǎn)，也明顯高于其他兩種組合的降解率。說(shuō)明煙曲霉YSITB I與蠟樣芽孢桿菌對(duì)木纖維的降解具有一定的協(xié)同性。但這種協(xié)同作用是否與應(yīng)用漚肥有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

3 討論

本試驗(yàn)篩選出的煙曲霉是天牛幼蟲腸道微生物菌群之一。煙曲霉是一種腐生真菌，是人類肺部的主要真菌病原體[10]。近來(lái)，許多微生物學(xué)家和環(huán)保學(xué)家正在研究利用煙曲霉對(duì)色素的降解作用和利用煙曲霉菌絲的吸附作用[11]治理污水。霉菌能降解色素、石油等有機(jī)物污染物主要是因?yàn)榉置诘拿竅12，13]的作用。黃孢原毛平革菌是降解木質(zhì)素的模式菌，但近些年來(lái)被用作降解色素[14]。煙曲霉也含有降解色素的酶，煙曲霉曾被用作降解植物細(xì)胞壁[15]，細(xì)胞壁含有豐富的木質(zhì)素[2]。綜上所述，煙曲霉能降解木質(zhì)素具有一定的依據(jù)。

溫度和pH條件是菌種生長(zhǎng)的不可缺少的因素。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)煙曲霉木質(zhì)素降解率的測(cè)定，得出了30 ℃為煙曲霉的最適溫度，6.8 pH為最適酸堿度，符合普遍真菌的生長(zhǎng)溫度和pH值。

4 結(jié)論

為尋找木質(zhì)素降解菌，本研究從天牛幼蟲腸道中分離出3種可利用木纖維作碳源的菌株，其中煙曲霉YSITB I具有明顯的降解木質(zhì)素作用，在pH 6.8、溫度30 ℃條件下，對(duì)木纖維中木質(zhì)素的降解率可達(dá)56.9%。煙曲霉+枯草芽孢桿菌的協(xié)同降解木質(zhì)素作用要好于煙曲霉單獨(dú)對(duì)木質(zhì)素的降解作用，其降解木質(zhì)素效率要高出18.6個(gè)百分點(diǎn)；煙曲霉YSITB I+蠟樣芽孢桿菌協(xié)同降解木纖維的效率達(dá)41.0%。通過(guò)煙曲霉和黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)素兩個(gè)因素的影響下的陽(yáng)性對(duì)照，在誤差允許的范圍內(nèi)，煙曲霉對(duì)木質(zhì)素的降解作用和黃孢原毛平革菌的基本持平。所以煙曲霉用于木質(zhì)纖維脫木質(zhì)素或秸稈降解漚肥具有很好的應(yīng)用前景。

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