許春平 曲利利 姜宇 馬宇平 孫斯文 王宣靜

摘要：為降低再造煙葉中的果膠含量，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解果膠的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，分析了酶解前后樣品的熱裂解產(chǎn)物，并將酶解后樣品抄造制絲添加至卷煙中進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解果膠的最佳反應(yīng)條件為酶活力3000 U/mL，高濃混合漿干重與粗酶液體積的料液比1GA6FA1，反應(yīng)溫度50 ℃，處理時(shí)間3 h.在此條件下果膠降解率達(dá)到最大，為28.63%，相對(duì)分子量由341 kDa減小到55 kDa.酶解后樣品裂解產(chǎn)物的組成和含量發(fā)生明顯變化，除醇類(lèi)物質(zhì)外，其他香味物質(zhì)酚類(lèi)、醛酮類(lèi)、酯類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)減少.將酶解后的樣品抄造制絲添加于卷煙中，香氣質(zhì)豐滿(mǎn)細(xì)膩，透發(fā)性、甜潤(rùn)感增強(qiáng)，刺激性減小，余味純凈舒適，吸食品質(zhì)得以改善，但勁頭略有不足.

關(guān)鍵詞：微紫青霉;果膠酶;再造煙葉;果膠降解率

中圖分類(lèi)號(hào)：TS41文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.004

文章編號(hào)：2096-1553（2019）01-0027-09

0 引言

果膠是構(gòu)成煙草細(xì)胞壁的主要物質(zhì)之一，在煙草中的含量約占5%～13%（若無(wú)特指，百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），它是以半乳糖醛酸為主鏈，并連接著2-吡喃型鼠李糖基的復(fù)合多糖類(lèi)物質(zhì)[1-3].這類(lèi)物質(zhì)在熱解時(shí)會(huì)產(chǎn)生甲醇，并進(jìn)一步氧化為甲醛、甲酸等，這些氧化產(chǎn)物會(huì)增加煙草燃吸時(shí)的刺激性，對(duì)煙草的內(nèi)在品質(zhì)和安全性產(chǎn)生不利影響[4-6]，對(duì)人體有害.因此，適當(dāng)降低煙葉中果膠的含量，對(duì)于提升煙葉品質(zhì)、降低卷煙危害，具有重要的意義.

煙草果膠降解通常采用生物酶解方法.施林燕[7]通過(guò)對(duì)煙梗絲施加復(fù)合酶，使煙梗絲中的果膠含量降低13.08%.于建軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)煙葉施加果膠酶后會(huì)使煙草香氣物質(zhì)含量增加29.94%，可能是由于施加果膠酶后使煙葉中總糖含量增加所致.于興偉等[9]采用固態(tài)發(fā)酵法用黑曲霉處理煙梗，發(fā)現(xiàn)煙草中果膠含量也明顯降低.馬東萍等[10]選用復(fù)合中性纖維素酶、酸性蛋白酶、復(fù)合果膠酶和中性脂肪酶配制成一種改性添加劑，這種改性添加劑可對(duì)煙梗中果膠、蛋白質(zhì)等大分子化合物進(jìn)行有效的生物降解和轉(zhuǎn)化，從而改善萃取液中的致香物質(zhì).柏婷[11]利用生物酶解技術(shù)和化學(xué)技術(shù)對(duì)果膠進(jìn)行降解.結(jié)果表明，當(dāng)果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，煙草中果膠含量由18.61%降低至 9.52%，且再造煙葉煙香較濃，刺激性明顯下降，感官品質(zhì)也得到明顯改善.然而，利用微紫青霉生產(chǎn)果膠酶并將其應(yīng)用于煙草果膠降解的報(bào)道則相對(duì)較少[12-14].鑒于此，本研究擬采用從煙田土壤中分離出的微紫青霉（Penicillium janthinellum）sw09菌株，根據(jù)該菌株高產(chǎn)果膠酶的特性，利用其粗酶液對(duì)造紙法再造煙葉混合漿料進(jìn)行果膠降解處理，并進(jìn)一步開(kāi)展化學(xué)分析和感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為煙葉品質(zhì)提升和卷煙危害成分降低研究提供參考和借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試材料：配方煙絲，河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供;高濃混合漿，取自河南煙草工業(yè)薄片有限公司工藝生產(chǎn)線(xiàn);果膠酶為由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選的微紫青霉sw09產(chǎn)出的粗果膠酶液，即發(fā)酵上清液.

試劑：3，5-二硝基水楊酸（DNS），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn);果膠標(biāo)準(zhǔn)品（酯化度67%～70%），Sigma＼|Aldrich公司產(chǎn);D-（+）-半乳糖醛酸一水化合物標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%）和0.15%的咔唑溶液，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn).

儀器：ATY124型電子分析天平，日本島津公司產(chǎn);Ultra3400型紫外分光光度計(jì)，北京普源精電科技有限公司產(chǎn);HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn);Agilent6890/5973型氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn);CDSPYROPROBE2000裂解儀，上海光譜儀器有限公司產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液的獲取

將活化后的微紫青霉sw09接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度分別為葡萄糖50 g/L，酵母浸粉3 g/L，KH2PO4 1 g/L，果膠2 g/L，pH=5）[15].發(fā)酵條件為：5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，攪拌速度150 r/min，通氣量2 V/（V·min），發(fā)酵溫度32 ℃，初始pH=5，發(fā)酵時(shí)間72 h.待發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心取上清液，即為果膠酶粗酶液[16].

1.2.2 微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液降解混合漿中果膠單因素試驗(yàn)

酶活的定義為：在45 ℃，pH=5條件下，1.0 mL酶液每min分解果膠產(chǎn)生1.0 μg 的D-半乳糖醛酸，即為一個(gè)酶活單位（1 U/mL）.通過(guò)單因素試驗(yàn)研究不同酶活力、酶解時(shí)間和反應(yīng)溫度條件下，微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液對(duì)混合漿中果膠含量的降解情況.

1.2.2.1 不同酶活力的粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)[17]

將不同酶活力的粗酶液（14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL，1000 U/mL，700 U/mL 和450 U/mL），以料液比（m（混合漿干重/g）GA6FAV（粗酶液體積/mL），下同）為1GA6FA3的比例均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解結(jié)束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測(cè)定各處理組樣品果膠含量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.2.2 不同酶解時(shí)間下粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)

將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下分別酶解0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h和3.0 h.待酶解結(jié)束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測(cè)定各處理組樣品果膠含量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.2.3 不同料液比降解果膠能力的試驗(yàn)

將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液，以不同料液比（1GA6FA1，1GA6FA3，1GA6FA5，1GA6FA7和1GA6FA9）均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解結(jié)束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測(cè)定各處理組樣品果膠含量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.2.4 不同反應(yīng)溫度下粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)

將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均勻噴施于10 g混合漿上，分別在30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃和55 ℃條件下酶解2.0 h.待酶解結(jié)束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測(cè)定各處理組樣品果膠含量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以果膠降解率為優(yōu)化目標(biāo)，對(duì)酶活力、酶解時(shí)間、料液比、反應(yīng)溫度等果膠降解條件進(jìn)行優(yōu)化.

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 果膠含量測(cè)定方法

分別稱(chēng)取5 g（精確至0.001 g）經(jīng)果膠酶處理前后的樣品進(jìn)行粉碎，過(guò)250目篩.然后參考劉玉佳等[18]的方法對(duì)樣品中的果膠含量進(jìn)行定量分析.

根據(jù)咔唑比色法測(cè)定果膠含量，以D-（+1）-半乳糖醛酸一水化合物為標(biāo)準(zhǔn)品.首先移取1 mL待測(cè)液于裝有6 mL濃H2SO4的試管，搖勻.在85 ℃水浴條件下加熱15 min.待試管冷卻后，加入0.3 mL 0.15%的咔唑無(wú)水乙醇溶液，搖勻，暗置30 min后在 530 nm下測(cè)吸光度值.根據(jù)咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和下列公式，計(jì)算待測(cè)液中果膠含量[19].

果膠含量=C×V×K×100/（W×106）

式中，C為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的果膠提取稀釋液的果膠含量/（μg·m-1），V為果膠提取液原液體積/ mL，K為果膠提取液稀釋倍數(shù)，W為樣品質(zhì)量/g，106為質(zhì)量單位換算系數(shù).

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組果膠含量的測(cè)定按照上述方法進(jìn)行，果膠降解率的計(jì)算公式如下：

Ei=（C0-Ci）/C0×100%

式中，Ei為果膠的降解率/%，C0為空白對(duì)照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度/（mg·mL-1），Ci為加酶處理的樣品中果膠水解生成的半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度/（mg·mL-1）[13].

1.3.2 果膠相對(duì)分子量的測(cè)定

在1.3.1中總果膠提取液中加入質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的活性炭進(jìn)行脫色，脫色完成后離心提取上清液進(jìn)行旋蒸，待旋蒸至原體積1/5后加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇用于沉淀果膠，靜置、離心得到果膠粗品后再?gòu)?fù)溶以Sevage法[18]除蛋白，再經(jīng)醇沉、離心、冷凍干燥得到果膠粉末.

用濃度為0.2 mol/mL的NaCl緩沖液平衡Sepharose CL-6B凝膠柱，每5 min收集一管洗脫液，洗脫速度為1.5 mL/min.用2 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（T-150，T-70，T-40，T-10）分別上樣，采用苯酚-硫酸法[20]在波長(zhǎng)490 nm處跟蹤顯色，峰值處為洗脫體積Ve，標(biāo)準(zhǔn)糖的分配系數(shù)Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo），其中Vt為柱床體積/mL，Vo為外水體積/mL.以Kav為橫坐標(biāo)，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對(duì)數(shù)（logM）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).在相同條件下測(cè)定酶解前后果膠的Ve/mL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其相對(duì)分子量.

1.3.3 熱裂解產(chǎn)物的測(cè)定

稱(chēng)取一定量酶解前后的樣品置于裂解裝置中，對(duì)裂解產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)測(cè)定.裂解條件參考郝輝等[13]的方法.試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值.

1.4 感官評(píng)價(jià)

在正交試驗(yàn)得到的最佳酶解條件下，對(duì)高濃混合漿進(jìn)行酶解，然后抄造切絲，按煙絲重量15%的比例與配方煙絲均勻混合后上機(jī)卷制.酶解處理后的樣品作為試驗(yàn)組，100 ℃煮沸滅活酶液處理后的樣品作為對(duì)照組，蒸餾水處理后的樣品作為空白組.

按照標(biāo)準(zhǔn)要求[21]，將處理前后的煙絲進(jìn)行卷制，然后在（22±2）℃，（60±5）%相對(duì)濕度的恒溫恒濕箱中平衡48 h后進(jìn)行感官評(píng)價(jià).

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1為酶活力、酶解時(shí)間、料液比和反應(yīng)溫度對(duì)果膠降解率的影響.由圖1可以看出，隨著酶活力的減小，樣品中果膠的降解率呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì).當(dāng)酶活力達(dá)到3000 U/mL后，進(jìn)一步增加酶活力對(duì)樣品果膠的降解率無(wú)明顯影響.因此選擇酶活力為14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL的粗酶液作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中酶活力的3個(gè)水平.果膠的降解率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大.當(dāng)酶解時(shí)間增加到2.5 h時(shí)，樣品中果膠的降解率達(dá)到最大值，接近28%.因此選擇酶解時(shí)間2.0 h，2.5 h和3.0 h作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中酶解時(shí)間的3個(gè)水平.料液比對(duì)樣品中果膠的降解率的影響不大，因此選擇料液比1GA6FA1，1GA6FA3，1GA6FA5作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中料液比的3個(gè)水平.隨反應(yīng)溫度的升高，樣品中果膠的降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí)，果膠的降解率達(dá)到最大值，接近28%.因此選擇溫度40 ℃，45 ℃和50 ℃作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中反應(yīng)溫度的3個(gè)水平.

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶活力（A），料液比（B），酶解溫度（C），反應(yīng)時(shí)間（D）4種因素設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)方案，試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2.

對(duì)表1中極差R值大小進(jìn)行比較可知，各個(gè)因素對(duì)降解率的影響由大到小依次為：反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度>酶活力>料液比.其中酶活力以3000 U/mL為最優(yōu)，料液比以1GA6FA1為最優(yōu)，酶解溫度以50 ℃為最優(yōu)，反應(yīng)時(shí)間以3.0 h為最優(yōu)，4種因素對(duì)果膠降解率的最優(yōu)組合為A3B1C3D3.在該最優(yōu)組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證，果膠的降解率達(dá)到最大28.63%.楊慧芳[22]以酶活 1 467.29 U/mL的青霉JXY-17發(fā)酵粗酶液在50 ℃條件下酶解煙梗12 h，果膠質(zhì)降低29.38%.與其結(jié)果相比，本研究的酶活力更高，降解效果相似，但酶解時(shí)間大大縮短，更適用于工業(yè)生產(chǎn).施林燕[7]以工業(yè)復(fù)合酶酶解煙梗絲4 h，果膠降解13.08%.與其結(jié)果相比，本研究的降解效果大大提升.

從表2可以看出，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的F值均大于F0.01（2，18）=6.01，說(shuō)明反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)果膠的降解率影響極顯著;酶活力和料液比的F值均大于F0.05（2，18）=3.55，但小于F0.01（2，18）=6.01，說(shuō)明酶活力和料液比對(duì)果膠的降解率影響顯著.

2.3 相對(duì)分子量的測(cè)定結(jié)果

以分配系數(shù)（Kav）為橫坐標(biāo)、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對(duì)數(shù)（logM）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖2所示.其線(xiàn)性回歸方程為

y=-5.485 8x+6.537 9R2=0.993 7

由此計(jì)算得出的高濃混合漿中果膠相對(duì)分子量為341 kDa，經(jīng)果膠酶處理后樣品中果膠的平均相對(duì)分子量明顯降低至55 kDa，說(shuō)明經(jīng)微紫青霉果膠酶處理后，樣品中果膠大分子得到有效降解.

2.4 樣品酶處理前后熱裂解產(chǎn)物分析

實(shí)驗(yàn)選擇300 ℃，600 ℃和900 ℃共3個(gè)溫度對(duì)高濃混合漿酶解前后的熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行裂解分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在裂解溫度為600 ℃時(shí)裂解物質(zhì)最多，裂解效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)僅列出熱裂解溫度為600 ℃的結(jié)果.根據(jù)官能團(tuán)不同，將檢測(cè)出的化合物分為7類(lèi)，分析結(jié)果見(jiàn)表3.

從表3可以看出，與原樣品相比，混合漿經(jīng)酶解后香氣組分和含量均發(fā)生了變化.其中，18種酚類(lèi)物質(zhì)總量由7.10%減少到0.63%，以苯酚、鄰甲酚、對(duì)甲酚的減少最為明顯，酚類(lèi)物質(zhì)含量的下降有助于減少雜氣的生成.果膠熱裂解生成乙酸[8]，酶解后的果膠含量降低，乙酸含量由12.71%減少到10.65%，減輕了煙氣吸味的刺激性.煙氣中酚類(lèi)物質(zhì)和羧酸類(lèi)物質(zhì)部分來(lái)自于果膠的分解，由于果膠被果膠酶酶解，導(dǎo)致裂解產(chǎn)物中酚類(lèi)物質(zhì)和羧酸類(lèi)物質(zhì)下降[23].酶解后含氮雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)總含量降低，由5.98%降至4.28%，其中煙堿由2.2%降低至1.88%，減少了有毒物質(zhì)的生成.酶解后醇類(lèi)物質(zhì)總量由2.51%增加到2.83%.酶解后樣品中醛酮類(lèi)含量由16.27%減少到15.45%，由于煙草熱裂解過(guò)程中產(chǎn)生的大部分揮發(fā)性羰基類(lèi)物質(zhì)是在纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等裂解之后的燃燒過(guò)程中形成的，因此果膠被降解，會(huì)導(dǎo)致煙草熱裂解后揮發(fā)性羰基類(lèi)物質(zhì)含量下降[24]，醛酮類(lèi)物質(zhì)含量下降有可能會(huì)影響卷煙的風(fēng)格特性，但是可以通過(guò)加香加料或者增加配方煙絲的用量進(jìn)行彌補(bǔ).

2.5 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

感官評(píng)吸結(jié)果見(jiàn)表4.由表4可知，將經(jīng)過(guò)微紫青霉產(chǎn)果膠酶處理的高濃混合漿抄造制絲加入卷煙后，卷煙香氣質(zhì)豐滿(mǎn)細(xì)膩，煙氣透發(fā)性更好，甜潤(rùn)感增強(qiáng)，刺激性減輕，也減少了煙氣中的雜氣，口感發(fā)澀程度減小且余味純凈舒適，吸食品質(zhì)得以改善，但勁頭略有不足.

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解高濃混合漿中果膠的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)酶解前后樣品的熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行了分析，并將酶解后樣品添加至卷煙中進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，得到如下結(jié)論.

1）微紫青霉酶降解高濃混合漿中果膠的最優(yōu)條件為：酶活力3000 U/mL，料液比1GA6FA1，酶解溫度50 ℃，處理時(shí)間3 h，此時(shí)樣品中果膠降解率為28.63%，果膠分子量由341 kDa降低至55 kDa.

2）酶解后樣品的熱裂解產(chǎn)物中，除醇類(lèi)外，其他香味物質(zhì)醛酮類(lèi)、酯類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)等的含量均減少.

3）將酶解后的高濃混合漿抄造制絲加入卷煙后，卷煙香氣質(zhì)豐滿(mǎn)細(xì)膩，煙氣透發(fā)性更好，甜潤(rùn)感增強(qiáng)，刺激性減輕，也減少了煙氣中的雜氣，口感發(fā)澀程度減小且余味純凈舒適，吸食品質(zhì)得以改善，但勁頭略有不足.

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