復(fù)合菌固體發(fā)酵降解木質(zhì)素的條件優(yōu)化

文婷 管維++周國(guó)英

摘要：以降解率和選擇系數(shù)為主要指標(biāo)，采用單因素優(yōu)化、均勻設(shè)計(jì)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發(fā)酵降解竹材木質(zhì)素條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，復(fù)合菌適宜的降解條件為酒石酸銨0.2 g/L、葡萄糖 14 g/L、Ca2+0.8 mmol/L、Mn2+0.6 mmol/L、接種量6%、含水量50%、溫度32 ℃、pH值5.0，固體發(fā)酵時(shí)間25 d時(shí)，竹材木質(zhì)素降解率為60.29%，選擇系數(shù)為12.79。

關(guān)鍵詞：復(fù)合菌；固體發(fā)發(fā)酵；木質(zhì)素；降解率；選擇系數(shù)

中圖分類號(hào)： S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0506-03

收稿日期：2015-10-28

基金項(xiàng)目：湖南省科技重大專項(xiàng)（編號(hào)：2011FJ1006）。

作者簡(jiǎn)介：文婷（1985—），女，湖南衡陽人，碩士，主要從事微生物選育及發(fā)酵工程研究。E-mail：282637170@qq.com。

通信作者：周國(guó)英，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事林業(yè)微生物研究。E-mail：gyzhou2118@163.com。

我國(guó)竹質(zhì)資源豐富，竹纖維具有綠色環(huán)保、吸濕透氣、天然抗菌和抗紫外線等特性，具有極大的市場(chǎng)潛力和附加值。竹纖維中的木質(zhì)素嚴(yán)重影響了竹纖維產(chǎn)業(yè)化開發(fā)進(jìn)程，而微生物降解木質(zhì)素是解決這一問題的有效途徑之一。因此，本研究以木質(zhì)素降解率和選擇系數(shù)為主要指標(biāo)，采用單因素優(yōu)化、均勻設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)，對(duì)白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發(fā)酵降解木質(zhì)素條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高木質(zhì)素的降解率和選擇專一性，為實(shí)現(xiàn)微生物固體發(fā)酵降解竹材木質(zhì)素產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）由中南林業(yè)科技大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、篩選并保藏。

1.1.2試劑與培養(yǎng)基

固體平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、pH值6、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素B1 8 mg、蒸餾水1 L，于121 ℃，0.1 MPa濕熱滅菌 30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5g、維生素B1 8 mg、蒸餾水1 L，于121 ℃，01 MPa濕熱滅菌30 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：竹粉（40目）15.0 g、料液比1 g ∶[KG-*3]3 mL，合成培養(yǎng)液[1]，拌勻，于121 ℃，0.1 MPa濕熱滅菌30 min。

1.1.3儀器

HZQ-C型恒溫振蕩器、HPS-280型生化培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；AR2140型電子天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；UV-1600紫外/可見分光光度計(jì)、北京瑞利分析儀器公司。

1.2方法

1.2.1制備種子液

用打孔器取直徑為8 mm的白腐菌菌落1塊于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、裝液量為400 mL/L、150 r/min 搖床培養(yǎng)3 d。

1.2.2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液按10%接種量（菌懸液濃度0.1億CFU/mL）接種至已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28 ℃、濕度80%的恒溫箱中靜置培養(yǎng)30 d。

1.2.3樣品木質(zhì)素含量的測(cè)定采用Klason法[2-3]測(cè)定木質(zhì)素含量。

1.2.4樣品纖維素含量的測(cè)定參考董榮瑩等的方法[4]測(cè)定纖維素含量。

1.2.5木質(zhì)素降解選擇性系數(shù)木質(zhì)素降解選擇性系數(shù)=木質(zhì)素降解率/纖維素降解率。

1.2.6固體發(fā)酵降解木質(zhì)素培養(yǎng)基組分的確定

保持固體培養(yǎng)基其他組分不變，依次改變培基的氮源、碳源和金屬離子種類，等量接種白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）菌懸液進(jìn)行固體發(fā)酵。

確定最佳氮源、碳源和金屬離子后，利用DPS 9.50軟件進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)[5]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及試驗(yàn)可行性確定考察因素范圍，對(duì)篩選出的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，然后通過二次多項(xiàng)式逐步回歸分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立回歸方程，通過指標(biāo)最大預(yù)測(cè)值確定發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的適合配比，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.7確定固體發(fā)酵降解木質(zhì)素的培養(yǎng)條件

采用優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基，以接種量、含水量、初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等因素為對(duì)象，通過正交試驗(yàn)來確定最佳的固體發(fā)酵培養(yǎng)條件，如表1所示。

1.2.8最佳發(fā)酵條件的驗(yàn)證

將白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）分別按照優(yōu)化前后的降解條件進(jìn)行固體發(fā)酵，分別測(cè)定竹材木質(zhì)素的降解率及選擇系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1固體發(fā)酵降解木質(zhì)素的培養(yǎng)基

2.1.1碳源

分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為1.0%的不同碳源，以葡萄糖為碳源時(shí)，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）的降解能力明顯優(yōu)于蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉，對(duì)木質(zhì)素的降解率達(dá)到了40.21%，選擇性系數(shù)為5.26；以竹粉為碳源時(shí)，木質(zhì)素降解率最低，為20.69%（表2），這可能是因?yàn)槟举|(zhì)素本身并不能充當(dāng)碳源[6]，自身的降解更依賴于培養(yǎng)基中新增加的底物碳源。因葡萄糖易于利用，既能提供菌株生長(zhǎng)發(fā)育所需的碳源，又能提供促進(jìn)菌株生長(zhǎng)發(fā)育和降解竹材木質(zhì)素所需的能量，因此選擇葡萄糖為碳源。

2.1.2氮源

分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為0.5 g/L的不同氮源。由表3可見，以酒石酸銨為氮源時(shí)，發(fā)酵后木質(zhì)素降解能力最高，降解率為41.91%，選擇系數(shù)為6.16。這說明添加酒石酸銨時(shí)，復(fù)合菌（HY-YY-ZYS）的降解能力優(yōu)于添加其他幾種氮源。其中以酵母膏作氮源時(shí)，木質(zhì)素降解率為3831%，略低于酒石酸銨，但明顯高于其他3種氮源，且選擇系數(shù)為4.36。由于酒石酸銨是木質(zhì)素降解菌發(fā)酵工業(yè)中最常用的無機(jī)氮源，價(jià)格便宜，而且是合成木質(zhì)素降解酶系中的重要氮源，能誘導(dǎo)該白腐菌種產(chǎn)木質(zhì)素降解酶系，綜合考慮效果與原料成本，因此選擇酒石酸銨為氮源。

2.1.3金屬離子

分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為 0.5 mmol/L 的金屬離子Fe3+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+。由表4可見，Mn2+和Ca2+有利于菌種生長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用，木質(zhì)素降解率分別為43.58%、42.19%，大于其他金屬離子，選擇系數(shù)分別為7.26、6.78，均高于其他金屬離子?？赡苡捎诮饘匐x子中Mn2+是酶的輔酶或激活劑[7-8]；Ca2+能影響細(xì)胞膜的通透性，既能促進(jìn)菌體的基礎(chǔ)代謝，又能影響許多代謝產(chǎn)物的生物合成，因此選用Mn2+和Ca2+作為金屬離子組合，添加到培養(yǎng)基中進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中各組分之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察培養(yǎng)基中碳源、氮源及金屬離子的含量對(duì)木質(zhì)素降解率及選擇系數(shù)的影響，以尋求培養(yǎng)基中各組分的最佳配比。采用4因素15水平，對(duì)篩選出的碳源、氮源及金屬離子組分進(jìn)行優(yōu)化（表5）。

采用DPS 9.50軟件，對(duì)各因素水平對(duì)木質(zhì)素降解率的影響結(jié)果，進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得到方程：y=1508-2.68x1+3.85x2+25.01x3+21.92x4+0.40x12-011x22-4.59x32-85.96x42。

相關(guān)系數(shù)r=0.928 9，F(xiàn)=4.861 3，P=0.035 1，剩余標(biāo)準(zhǔn)差s=2.096 2，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)為0.876 4，查表F0.05（4，10）=3.24，F(xiàn)>F0.05（4，10），回歸方程顯著。

根據(jù)回歸方程求ymax，當(dāng)x1=0.2 g/L、x2=14 g/L、x3=08 mmol/L、x4=0.6 mmol/L時(shí)，ymax=46.18，預(yù)測(cè)區(qū)間為[43.50，51.68]。根據(jù)優(yōu)化條件，進(jìn)行3次固體發(fā)酵降解竹材木質(zhì)素試驗(yàn)驗(yàn)證，最終平均結(jié)果為46.29，選擇系數(shù)為1072，試驗(yàn)結(jié)果均在預(yù)測(cè)范圍內(nèi)，且有明顯提高。

2.2固體發(fā)酵降解木質(zhì)素的培養(yǎng)條件

根據(jù)表1設(shè)計(jì)正交表，考察5個(gè)因素4個(gè)水平，找出木質(zhì)素最佳降解條件（表6）。按照優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，將白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）按正交表所列的試驗(yàn)需要接種到竹材固體培養(yǎng)基上，然后測(cè)定木質(zhì)素降解率（表7）。

由表7可見，因素C（溫度）有顯著性差異，5個(gè)因素對(duì)降解率的影響由大到小依次為C>D>B>E>A；由表6可見，因素C的關(guān)系為C3>C2>C1>C4，因此當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，復(fù)合菌可以達(dá)到降解木質(zhì)素的最適合狀態(tài)；因素D（pH值）的關(guān)系為D3>D2>D4>D1，當(dāng)固體發(fā)酵初始pH值為5時(shí)，木質(zhì)素降解的效果最適合；因素B（含水量）的關(guān)系為B3>B2>B4>B1，當(dāng)含水量為50%時(shí)，復(fù)合菌可以達(dá)到降解木質(zhì)素的最適合狀態(tài)；因素E（時(shí)間）的關(guān)系為E4>E3>E2>E1，當(dāng)固體發(fā)酵時(shí)間在35 d時(shí)，木質(zhì)素降解率最大，由于在固體發(fā)酵30 d之后木質(zhì)素降解率變化不明顯，因此為了節(jié)約時(shí)間[CM（25]，選擇了E2，即當(dāng)發(fā)酵25 d時(shí)，木質(zhì)素降解率為最適合固[CM）]

體發(fā)酵時(shí)間；而因素A（接種量）的關(guān)系為A2>A3>A4>A1，即當(dāng)接種量為6%時(shí)，木質(zhì)素降解率最適合。

綜合分析，選擇的最優(yōu)組合為A2B3C3D3E2，即當(dāng)復(fù)合菌（HY-YY-ZYS）在固體發(fā)酵條件為接種量6%、含水量50%、溫度32 ℃、pH值5、固體發(fā)酵時(shí)間25 d時(shí)，木質(zhì)素降解效率最好。

2.3最佳降解條件的驗(yàn)證

將復(fù)合菌（HY-YY-ZYS）按照優(yōu)化前后的降解條件固體發(fā)酵，分別測(cè)定竹材木質(zhì)素降解率及選擇系數(shù)。結(jié)果表明，在原始條件下，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質(zhì)素降解率為38.54%，選擇系數(shù)為3.64；經(jīng)過降解條件優(yōu)化后，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質(zhì)素降解率為6029%，選擇系數(shù)為12.79，降解率增加了21.75百分點(diǎn)，選擇系數(shù)增加了9.15，降解時(shí)間縮短5 d，竹材木質(zhì)素降解率、選擇系數(shù)，生產(chǎn)效率明顯提高，且降低了生產(chǎn)成本。

3結(jié)論與討論

白腐菌降解木質(zhì)素主要是在次生代謝期間產(chǎn)木質(zhì)素降解酶，從而達(dá)到降解木質(zhì)素的作用。影響木質(zhì)素降解酶生物合成的培養(yǎng)基成分主要因素有碳源、氮源、金屬離子、初始pH值、誘導(dǎo)劑和表面活性劑等，為菌株?duì)I造一個(gè)有利于木質(zhì)素降解酶系形成和運(yùn)行的發(fā)酵環(huán)境，是生物降解木質(zhì)素研究的重要內(nèi)容[9-12]。本研究以降解率和選擇系數(shù)為主要指標(biāo)，采用單因素優(yōu)化方法結(jié)合均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發(fā)酵降解竹材木質(zhì)素培養(yǎng)基條件進(jìn)行了優(yōu)化：酒石酸銨0.2 g/L、葡萄糖14 g/L、Ca2+ 0.8 mmol/L、Mn2+ 0.6 mmol/L 時(shí)，降解率為46.29%，選擇系數(shù)為10.72。

白腐菌固體發(fā)酵降解木質(zhì)素培養(yǎng)條件主要因素有接種量、氧氣濃度、溫度、含水量等[13]。本研究以降解率和選擇系數(shù)為主要指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發(fā)酵降解竹材木質(zhì)素培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)組合為A2B3C3D3E2，即當(dāng)復(fù)合菌（HY-YY-ZYS）的固體發(fā)酵條件為接種量6%、含水量50%、溫度32 ℃、pH值=5，固體發(fā)酵時(shí)間25 d時(shí)，木質(zhì)素降解率最高。將復(fù)合菌（HY-YY-ZYS ）分別按照優(yōu)化前后的降解條件固體發(fā)酵，分別測(cè)定竹材木質(zhì)素降解率及選擇系數(shù)，進(jìn)行最佳降解條件的驗(yàn)證。結(jié)果表明，在原始條件下，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質(zhì)素降解率為38.54%，選擇系數(shù)為3.64；經(jīng)過降解條件優(yōu)化后，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質(zhì)素降解率為60.29%，選擇系數(shù)為12.79，降解率增加了21.75百分點(diǎn)，選擇系數(shù)增加了9.15，降解時(shí)間縮短5 d，竹材木質(zhì)素降解率、選擇系數(shù)、生產(chǎn)效率均得到了明顯提高，且降低了生產(chǎn)成本。

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