狐尾藻乙酸乙酯萃取部位總黃酮含量測定與抗氧化活性研究

陳春雅，毛玉玲，李澤寧，許益迪，潘奇獻(xiàn)，徐潤生

（浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院，浙江 紹興 311800）

0 前言

藻類是一種非常重要的植物資源。分布廣泛，成本低廉。不僅可以改善環(huán)境，而且廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、功能材料、合成工業(yè)等領(lǐng)域[1]。已有文獻(xiàn)報(bào)道目前用于食用的淡水藻類幾乎都具有一定的藥用價(jià)值。從藻類植物中提取的黃酮類物質(zhì)又稱生物類黃酮，泛指兩個(gè)苯環(huán)（A-環(huán)和B-環(huán)）通過中央三碳鍵相互連接而成的一系列C6-C3-C6化合物。主要是指以2-苯基色原酮為母核的化合物。天然的生物類黃酮多為其基本結(jié)構(gòu)的衍生物，多以糖苷形式存在。有防血栓、保護(hù)心腦血管作用，抗腫瘤、消炎抑菌；解除醇中毒、保肝護(hù)肝；清熱解毒、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨；調(diào)節(jié)免疫力等作用[2]。藻類資源的開發(fā)利用具有前瞻性的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

本次研究所用試劑均為分析純。

儀器：UV-2000紫外可見分光光度，AL104電子天平。

1.2 提取與濃縮

取干燥狐尾藻340 g，剪碎，用95%的乙醇提取三次，料液比為1∶9。將提取液進(jìn)行減壓抽濾。通過真空減壓濃縮裝置，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到8.2 g的墨綠色的浸膏。

浸膏在超聲波作用下分散到適量的水中，用沸程60℃～90℃石油醚進(jìn)行反復(fù)萃取，到石油醚層溶液顏色近為無色為止。合并石油醚萃取液，濃縮后得石油醚部位。

石油醚萃取后的水相用乙酸乙酯萃取，有機(jī)萃取液與水相體積比為3∶1，至乙酸乙酯層溶液顏色近為無色為止。合并乙酸乙酯萃取液，濃縮后得乙酸乙酯部位浸膏6.2 g。

1.3 分離

乙酸乙酯萃取部位，旋蒸成干粉。進(jìn)行硅膠（200～300目）柱色譜分離，采用濕法裝柱。以石油醚、乙酸乙酯按極性遞增進(jìn)行梯度洗脫。每100 mL收集一份，通過TLC檢識，合并相同流分。

1.4 總黃酮定性鑒別

通過鹽酸鎂粉反應(yīng)定性檢測是否含有黃酮類化合物，采用1-萘酚試劑檢測是否含有黃酮苷。觀察樣品溶液變色情況，觀察1-萘酚反應(yīng)結(jié)果是否為陽性。

1.5 總黃酮含量測定

本次實(shí)驗(yàn)總黃酮含量的測定采用Al（NO3）3-Na（NO）-NaOH比色法，在510 nm處進(jìn)行吸光度值測定。此法利用顯色反應(yīng)可避開其他成分的干擾。以蘆丁作對照品通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測得總黃酮含量。

（1）精密稱取0.0017 g蘆丁對照品，用70%的乙醇將其進(jìn)行溶解，并且使用10 mL容量瓶對其進(jìn)行定容，配制成為0.17 mg·mL-1濃度的對照品溶液。

（2）精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL 于 10 mL 容量瓶中，分別加入5 mL的70%乙醇溶液，再加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min，然后加入 1 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6 min，最后加入3 mL的4%氫氧化鈉溶液，用70%乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置15 min。把沒有添加任何標(biāo)準(zhǔn)液的試管作為空白對照，依照上述方法進(jìn)行配置，取潔凈的比色皿將上述試液倒入，并且在510 nm波長處測定其吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以對照品溶液濃度c（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）取黃酮類化合物浸膏，用電子天平稱取2.000 g，再分別用70%的乙醇浸泡在錐形瓶內(nèi)，并吸取一定量的樣品溶液于10 ml錐形瓶中，按上述方法于510 nm處測定樣品吸光度值重復(fù)三次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出各個(gè)樣品的總黃酮含量取平均值?？傸S酮含量用蘆丁當(dāng)量RE（Rutin equivalent）表示。

1.6 抗氧化活性的測定

1.6.1 清除DPPH自由基能力的測定

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.004 mg/mL的DPPH溶液。分別取2 mL不同濃度的樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，5000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用Ve作為陽性對照。

1.6.2 測定活性物質(zhì)對羥自由基的清除率

采用Fenton試劑[3]：過氧化氫/亞鐵鹽。H2O2與亞鐵離子反應(yīng)生成·OH自由基一般存活時(shí)間比較短，具有較高的反應(yīng)活性。當(dāng)在反應(yīng)體系中添加水楊酸，便能快速地捕捉·OH而產(chǎn)生紫色化合物（2，3-二羥基苯甲酸，該有色化合物在510 nm處有較大吸收峰，測其吸光度可表示羥自由基（·OH）的多少，吸光度與羥白由基（·OH）的量成正比。反應(yīng)體系中若加入羥自由基（·OH）清除劑后，被氧化的水楊酸減少則體系顏色變淺甚至消失，吸光度變小。

2 結(jié)果與討論

2.1 總黃酮定性鑒別結(jié)果

通過鹽酸-鎂粉定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品溶液即刻變成橙紅色，α-1萘酚實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陽性，說明有樣品中含有黃酮類化合物。

2.2 總黃酮含量測定結(jié)果

按照樣品總黃酮含量測定方法對樣品吸光度值進(jìn)行測定，記錄數(shù)值。

含量計(jì)算方程如下所示：

測試結(jié)果如表1。

表1 總黃酮含量

由上述數(shù)據(jù)可知狐尾藻乙酸乙酯部位總黃酮含量較高，具有很好的開發(fā)價(jià)值。目前的研究認(rèn)為紫外輻射、高光強(qiáng)、低溫、干旱、營養(yǎng)缺乏、高濃度CO2等因素均可能促進(jìn)黃酮的合成[4]，通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，獲得黃酮含量較高的狐尾藻具有十分重要的意義。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH抗氧化活性分析

DPPH自由基在517 nm波長附近有最大吸收峰，當(dāng) DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)后，517 nm波長處的吸收值 降低，其降低的程度與接收的電子（抗氧化劑清除自由基活性）呈定量關(guān)系，反應(yīng)進(jìn)程很容易通過分光光度計(jì)監(jiān)測。DPPH自由基清除計(jì)算公式一般為：

計(jì)算結(jié)果如表2所示。

表2 DPPH清除率

由表2數(shù)據(jù)可知，在一定濃度范圍時(shí)（0.01～0.2 mg/mL），樣品顯示出比對照品Ve更好的抗氧化效果。

2.3.2 羥基自由基抗氧化活性分析

羥基自由基清除率所用公式如下：

表3 樣品清除·OH自由基效果

由以上數(shù)據(jù)可知：濃度在0～0.2 mg/mL時(shí)，樣品具有較好的清除效果，即具有較好的抗氧化活性。

2.4 討論

狐尾藻乙酸乙酯部位中具有較高的總黃酮含量，在DPPH抗氧化活性分析及羥基自由基抗氧化活性分析結(jié)果中均體現(xiàn)出良好的清除自由基能力，即良好的抗氧化效果。

許多重要生命現(xiàn)象和疾病都與自由基有著直接或間接關(guān)系[5]。狐尾藻作為一種資源豐富，繁殖力強(qiáng)的植物，在治理污水、改善水域環(huán)境等方面具有良好的作用，而從另一個(gè)角度觀察，其本身所具有的開發(fā)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止如此，它所蘊(yùn)含的有機(jī)物潛力是巨大的，對其開發(fā)利用在多種領(lǐng)域具有十分重要的意義。我們不僅發(fā)現(xiàn)和拓寬了它的市場價(jià)值，也為以后的科學(xué)研究提供基礎(chǔ)。