多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選抗感膠囊提取工藝

朱廣平　戴雨晨　劉順　倪文澎

摘要：目的 優(yōu)化抗感膠囊提取工藝。方法 采用單因素考察結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以方中金銀花和連翹的有效成分綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A的含量和浸膏得率為綜合評分指標(biāo)，考察溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對抗感膠囊水提工藝的影響，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果 最優(yōu)提取工藝為：加12倍量水，回流提取2次，每次提取1.5 h。結(jié)論 本研究優(yōu)選的提取工藝簡單、穩(wěn)定可行，對抗感膠囊的生產(chǎn)工藝制定具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：抗感膠囊；綠原酸；木犀草苷；連翹酯苷A；綜合評分法；提取工藝

中圖分類號：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0077-05

Abstract： Objective To optimize the extraction technology of Kanggan Capsules. Methods Single factor test combined with orthogonal test design was used， and the contents of chlorogenic acid， cynaroside and forsythoside A in Lonicerae Japonicae Flos and Forsythiae Fructus in Kanggan Capsules and extract yields were taken as comprehensive evaluation indexes to examine the effects of solvent dosage， extraction time and extraction times on the extraction technology of Kanggan Capsules. Validation test was conducted. Results The optimal extraction technology was as follows： 12 times of water extracted twice under reflux for 1.5 h each time. Conclusion The optimal extraction technology is simple， stable and feasible， which has certain guiding significance for the preparation of Kanggan Capsules.

Keywords： Kanggan Capsules； chlorogenic acid； cynaroside； forsythoside A； comprehensive evaluation method； extraction technology

抗感合劑為江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由金銀花、連翹等12味藥組成，既有辛涼透邪清熱之效，又有芳香辟穢解毒之功，可疏散風(fēng)熱、清利咽喉、清熱解毒、宣肺止咳，用于風(fēng)熱感冒引起的發(fā)熱、頭痛、咳嗽、鼻塞、流涕、咽痛等，臨床應(yīng)用10余年療效顯著。但合劑在使用中存在攜帶不便、順應(yīng)性不好等問題。膠囊具有質(zhì)量穩(wěn)定、劑量準(zhǔn)確、順應(yīng)性好且便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，故將抗感合劑改劑型為膠囊。為了提高有效成分含量，本試驗(yàn)采用單因素與正交試驗(yàn)法，以綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A含量及浸膏率為綜合評價(jià)指標(biāo)，采用綜合評分法優(yōu)化抗感膠囊提取工藝。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，含四元泵（G1311A）、柱溫箱（G1316A）、DAD檢測器（G1314A）、工作站（Chemstation）；Kromasil 100-5-C18色譜柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm，編號M05CLA25）；10萬分之一電子分析天平（BP-211D型，德國Sartorius）；萬分之一電子天平（AX224ZH/E，美國OHAUS Corp）；DW調(diào)溫電熱器（2000 mL，上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司）；電熱套（5000 mL，上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司）；KQ-1000E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；移液器（1000 ?L，德國Eppendorf）。

組方藥物金銀花、連翹、拳參、板藍(lán)根、綿馬貫眾、升麻、薄荷、苦杏仁、荊芥、桔梗、川芎、甘草，均購自安徽井泉中藥飲片有限公司，批號分別為20170801、20171001、20170801、20170601、20171001、20170801、20171001、20171001、20170801、20170601、20170501、20170801。綠原酸（批號Y24J7K16726）、木犀草苷（批號Y26A9H59973）、連翹酯苷A（批號Y04J8H39276）對照品，均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。乙腈、甲酸為色譜純（科龍化工試劑廠），水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含量測定

2.1.1 色譜條件

流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min[1]221。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密量取適量綠原酸對照品，用50%甲醇定容，制成濃度為193.8 ?g/mL對照品貯備液。精密量取上述貯備液1 mL于10 mL棕色瓶中，用50%甲醇定容，即得濃度為19.38 ?g/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取1/10處方量藥物飲片，加水浸泡提取后過濾，濾液濃縮成100 mL提取液，備用。取制備好的提取液1 mL于50 mL棕色瓶中，超聲15 min，用50%甲醇定容，0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備

精密吸取缺金銀花和拳參的提取液1 mL，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.1.5 專屬性試驗(yàn)

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，色譜圖見圖1。陰性對照色譜圖中，在綠原酸相同保留時(shí)間處未見相關(guān)吸收峰，表明其對測定無干擾，方法專屬性良好。

2.1.6 線性關(guān)系考察

精密量取綠原酸對照品10.24 mg，置于5 mL容量瓶中，定容至刻度，取該對照品液及稀釋2、4、6、8、10倍的對照品溶液分別進(jìn)樣，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=25.032X+1949，r=0.999 7，綠原酸的線性范圍為204.8～2048 ?g/mL。

2.1.7 金銀花飲片中綠原酸含量測定

精密稱定金銀花粉末（過4號篩），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，得金銀花飲片中綠原酸含量為1.9%，符合藥典規(guī)定（不得少于1.5%）。

2.2 木犀草苷含量測定

2.2.1 色譜條件

流動相A為乙腈、B為0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脫（0～15 min，10%～20%A；15～30 min，20%A；30～40 min，20%～30%A），檢測波長為350 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min[1]221。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密量取木犀草苷對照品適量，用70%乙醇定容，制成濃度為201.2 ?g/mL對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1 mL，置10 mL棕色瓶中，用70%乙醇定容，即得21.02 ?g/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取1/10處方量藥物飲片，加水浸泡提取后過濾，濾液濃縮成100 mL提取液，備用。取制備好的提取液1 mL于50 mL容量瓶中，超聲15 min，用70%乙醇定容，0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

精密吸取缺金銀花的提取液1 mL，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn)

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，色譜圖見圖2。陰性對照色譜圖中，在木犀草苷保留時(shí)間處未見相關(guān)吸收峰，表明其對測定無干擾，方法專屬性良好。

2.2.6 線性關(guān)系考察

精密量取木犀草苷對照品3.91 mg，置于5 mL容量瓶中，定容至刻度。取該對照品溶液及稀釋20、40、60、80、100倍的對照品溶液分別進(jìn)樣，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=32.244X-109.17，r=0.999 9，結(jié)果表明，木犀草苷的線性范圍為7.82～782 ?g/mL。

2.2.7 金銀花飲片中木犀草苷含量測定

精密稱定金銀花粉末（過4號篩），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，進(jìn)樣測定，得金銀花飲片中木犀草苷含量為0.27%，符合藥典規(guī)定（不得少于0.050%）。

2.3 連翹酯苷A含量測定

2.3.1 色譜條件

流動相：乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85）；檢測波長：330 nm，柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min[1]170。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密量取連翹酯苷A對照品適量，用70%甲醇定容，制成419.2 ?g/mL對照品貯備液，精密量取對照品貯備液1 mL，置于10 mL棕色瓶中，用70%甲醇定容，即得濃度為41.29 ?g/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取1/10處方量藥物飲片，加水浸泡提取后過濾，濾液濃縮成100 mL提取液，備用。取制備好的提取1 mL于50 mL容量瓶中，超聲15 min，用70%甲醇定容，0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備

精密吸取缺連翹的提取液1 mL，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3.5 專屬性試驗(yàn)

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖3。陰性對照色譜圖中，在連翹酯苷A相同保留時(shí)間處未見相關(guān)吸收峰，表明其對測定無干擾，方法專屬性良好。

2.3.6 線性關(guān)系考察

精密量取連翹酯苷A對照品12.045 mg，置5 mL容量瓶中，定容至刻度。取該對照品溶液和稀釋2、4、6、8、10倍的6份對照品溶液分別進(jìn)樣，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=15.811X+424.48，r=0.999 4，結(jié)果表明連翹酯苷A的線性范圍為240.9～2409 ?g/mL。

2.3.7 連翹飲片中連翹酯苷A含量測定

精密稱定連翹粉末（過5號篩），按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，測定，得連翹飲片中連翹酯苷A含量為4.2%，符合藥典規(guī)定（不得少于0.25%）。

2.4 浸膏率測定

精密吸取樣品提取液5 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，置于105 ℃烘箱中，干燥至恒重，取出，移至干燥器內(nèi)，冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。以干燥品計(jì)算供試品的浸膏得率。浸膏率（%）=固含物質(zhì)量（g）÷加入供試品溶液體積（mL）×100%。

2.5 單因素考察

2.5.1 溶劑用量

在其他煎煮條件固定的情況下，分別加6、10、15倍量水，按上述方法測定煎液中綠原酸的含量。結(jié)果顯示，溶劑用量為10倍時(shí)，綠原酸含量最高；溶劑用量不足10倍量時(shí)，溶劑用量越少含量越低；溶劑用量高于10倍量時(shí)，溶劑用量越高含量越低。因此，綜合單因素考察結(jié)果，選擇8、10、12倍量溶劑進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5.2 提取時(shí)間

在其他煎煮條件固定的情況下，分別提取30、90、150 min，按上述方法測定煎液中綠原酸的含量。結(jié)果顯示，提取時(shí)間在90 min以內(nèi)，提取時(shí)間越長，綠原酸含量越高；當(dāng)提取時(shí)間為150 min時(shí)，綠原酸含量甚至低于提取30 min時(shí)。綜合考慮單因素考察結(jié)果，選擇正交試驗(yàn)提取時(shí)間為60、90、120 min。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.6.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期單因素考察結(jié)果，選擇浸膏率、綠原酸含量、木犀草苷含量、連翹酯苷A含量為考察指標(biāo)，以溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，篩選水提工藝條件。因素與水平見表1。

2.6.2 正交試驗(yàn)及結(jié)果

根據(jù)“2.6.1”項(xiàng)下設(shè)計(jì)方案做正交試驗(yàn)，得9份樣品，按上述方法分別測定3個(gè)指標(biāo)成分綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A的含量。另取9份制備好的供試品，按“2.4”項(xiàng)下方法測定浸膏率。

用多指標(biāo)試驗(yàn)全概率法[2-3]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，設(shè)Bi為第i號試驗(yàn)，Aj為第j個(gè)指標(biāo)，i=1，2，3，…，n，j=1，2，3，…，k，且A1，A2，A3，…，An互不相容，設(shè)各指標(biāo)的重要程度之比為A1∶A2∶A3，…，Ar=M1∶M2，…，Mr，則：

由直觀分析結(jié)果可知，以綜合評分為考察指標(biāo)，各因素的影響順序?yàn)锽>C>A；由方差分析結(jié)果可知，各因素對提取工藝均無顯著影響（P>0.05）。結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，同時(shí)根據(jù)生產(chǎn)節(jié)能、省時(shí)的實(shí)際需要，確定優(yōu)選工藝為A3B2C2，即用12倍量的水提取2次，每次1.5 h。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按抗感膠囊處方比例稱取處方藥物飲片3份，按優(yōu)選的提取工藝條件平行制備3份樣品。按上述方法分別測定浸膏率、綠原酸含量、木犀草苷含量、連翹酯苷A含量，結(jié)果見表4，RSD分別為1.14%、0.29%、1.63%、0.65%，表明優(yōu)選出的抗感膠囊水提工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

中藥復(fù)方制劑成分多樣，采用多指標(biāo)進(jìn)行綜合評分可有效避免復(fù)方制劑質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。相對于單一指標(biāo)成分，多指標(biāo)成分評價(jià)更能反映復(fù)方的整體性、復(fù)雜性和有效性[4]。多指標(biāo)綜合評分法中權(quán)重系數(shù)的賦予是綜合評分是否科學(xué)合理的表現(xiàn)[5-6]?？垢心z囊方中君藥為金銀花和連翹。綠原酸為金銀花的主要有效成分，故權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3；木犀草苷含量次之，權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.1。連翹酯苷A是連翹的主要成分，權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3。中藥浸膏質(zhì)量的優(yōu)劣對中藥制劑成型工藝及制劑成品的質(zhì)量具有重要作用[7]，因此權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，本研究優(yōu)選出的抗感膠囊提取工藝條件比較合理。

本試驗(yàn)僅選取主要指標(biāo)成分，未能全面研究復(fù)方中藥味的成分。另外，尋找簡便、準(zhǔn)確的多指標(biāo)含量測定方法亦可為本復(fù)方的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-05-10）

（修回日期：2018-06-22；編輯：陳靜）