一種新型PET水解酶的結構與催化機制研究進展

靳玉瑞，李愛秀，張 力

(中國人民武裝警察部隊后勤學院基礎部數(shù)理教研室，天津 300309)

0 前言

PET是一種被廣泛應用的高分子芳香族聚酯，由取自原油的對苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)這2種單體通過酯鍵相連構成[1]。PET具有優(yōu)良的綜合性能，如質輕、強度大、耐高低溫、耐化學腐蝕、絕緣性好、透明度高等，其產品包括纖維級PET和非纖維級PET(如瓶類、薄膜和工程塑料等)，前者被應用于紡織業(yè)等，后者主要被應用于包裝、電子電氣、建筑、汽車等領域，其中包裝是PET最大的非纖應用市場，也是增速最快的領域。PET可單獨作為軟包裝材料，目前大部分瓶裝水、軟飲料都使用PET進行灌裝；PET還能與鋁、氧化硅或納米材料等復合以改善強度、阻隔性或微波透過性等，使其在食品、藥品、化妝品和日用化學品包裝等領域，得到更廣泛的應用。除民用以外，以PET為基材研制的多功能復合材料，還可用于軍用裝備元件的制造以及軍工產品的包裝等，如PET復合材料被用于火工品、引信、火炸藥等的內包裝，以及武器裝備尤其是大型、復雜武器裝備系統(tǒng)的封套包裝[2-4]。PET改性材料，因具有防靜電、防電磁、阻燃和高阻隔等功能，能有效保護軍工產品在儲存和運輸中的性能和安全。

2010年,我國 的PET 產量已達 29 000 kt，成為世界上最大的 PET 生產國和消費國。調查表明，PET 的消費量增長迅速，與此同時也產生了大量的 PET廢棄物，特別是PET包裝材料在使用后幾乎都成為廢料。PET作為一種芳香族聚酯，化學惰性強，且生物難降解，其廢棄物的積累給環(huán)境和生態(tài)帶來了嚴峻的壓力[5-6]。部隊在執(zhí)行搶險救災、海上維權等任務時，通常要攜帶大量物資前行，包括包裝食品、飲用水及武器裝備等，因此也將產生大量的PET廢棄物。如何經(jīng)濟環(huán)保地處理這些PET廢料，是軍地都急需解決的問題，故需要集合各方的技術和資源優(yōu)勢，通過深入融合共同探索解決方案。

近年來，生物降解法因兼具經(jīng)濟效益和環(huán)境友好性，利用此類方法處理塑料廢棄物成為一個重要的研究方向[7-8]。目前已發(fā)現(xiàn)一些能夠降解PET的生物酶(如角質酶和脂肪酶等)，但這些酶并非以PET為主要底物，且酶降解效率尚不能達到工業(yè)化的要求。2016年，Yoshida等[9]發(fā)現(xiàn)了一種將PET作為主要能量和碳源的細菌Ideonellasakaiensis201-F6，并分離到對PET降解起關鍵作用的水解酶PETase。該酶是目前對PET降解活性和底物專屬性最強的酶，這引起研究者們的極大興趣。在對PETase的研究中，解析其突出的PET降解活性需基于對其結構和催化機制的深刻理解。本文主要介紹了PETase的降解活性及相關影響因素，對PETase的晶體結構信息、底物結合模式和催化降解機制進行了總結，重點闡述了該酶發(fā)揮突出降解活性的關鍵結構特征，并對PETase生物降解的研究方向進行了展望。

1 PET的處理

目前對PET廢棄物的處理方法有填埋、焚燒和回收利用等。焚燒法是通過專用的焚燒爐燒掉廢舊塑料，在此過程中可回收熱能，但能量利用率較低，且會產生大量有毒物質。填埋法是將廢舊塑料集中用土掩埋，該方法簡單易行，但長期不能降解的塑料將成為永久垃圾，不僅占用土地資源，還會進一步污染土壤、地下水等[10]。相比傳統(tǒng)的填埋和焚燒，回收利用更加科學有效，能兼顧資源的循環(huán)利用和避免環(huán)境污染。利用機械加工進行物理回收要求廢棄物所含的雜質較少，且加工過程易造成制品的性能降低，一般只能降級使用[11]?；瘜W回收則是將PET解聚成對苯二甲酸二甲酯、TPA、和EG等，使其重新用于高品質化學品的合成，具有較好的經(jīng)濟效益。由于PET僅在非常強烈的化學條件(如強酸、高溫等) 下被降解再利用[12]，該方法對設備有很高的要求，同時會產生大量的廢水，這增加了處理成本，也阻礙了化學回收法的發(fā)展。

鑒于環(huán)境和資源的友好性，生物降解法處理塑料受到越來越多的關注。近年來研究者發(fā)現(xiàn)了一些具有PET水解活性的角質酶(cutinase)[13-14]、脂肪酶(lipase)[15-16]和酯酶(esterase)[17-18]等，其中以角質酶最有潛力，該類酶不僅降解活性更高，且沒有“帽子”結構而不像脂肪酶那樣需要脂水界面激活[19]。雖然生物降解的應用前景很好，但已發(fā)現(xiàn)的PET水解酶活性太低，盡管采用了多種策略去增強酶的活性，仍無法達到工業(yè)化的要求。2016年，Yoshida等[9]從I.sakaiensis中分離出一種特殊的PET水解酶PETase，該酶與具有PET水解活性的角質酶有很高的序列相似性(約50 %)，但它對PET的水解活性和選擇性均明顯高于其他PET水解酶。PETase的發(fā)現(xiàn)，是PET生物降解研究中的突破性進展，對PETase結構和機制的闡明將為PET乃至其他塑料的降解提供重要線索。

2 PETase的降解活性及相關影響因素

Yoshida等[9]發(fā)現(xiàn)I.sakaiensis能夠吸附于PET薄膜的表面，其分泌的PETase能將PET降解為主產物對苯二甲酸乙二醇酯單體(MHET)、次產物對苯二甲酸二乙二醇酯(BHET)和TPA，也可將BHET降解為MHET，PET及其產物的分子結構式如圖1所示。將PETase與其進化分枝上的3種PET水解酶(來自嗜熱放線菌的水解酶TfH[20]、來自枝葉堆肥元基因組的角質酶同系物LCC[21]和來自腐皮鐮刀菌的角質酶FsC[22])進行PET水解活性的比較，發(fā)現(xiàn)PETase與其他PET水解酶在底物的選擇性和水解活性上存在差異。在30 ℃，pH=7條件下，PETase對PET薄膜的水解活性分別是TfH、LCC和FsC的120、5.5和88倍，但對脂肪酶和角質酶的優(yōu)選底物對硝基苯酯的水解活性顯著低于TfH、LCC和FsC。盡管致密的高結晶度PET能顯著弱化酯鍵的酶解[23]，PETase對取自塑料瓶的高結晶度PET的活性也明顯高于TfH、LCC和FsC。PETase幾乎無法降解萘基酯，對該類物質的降解活性約為對硝基苯酯類的百萬分之一。但在PETase中分別引入S64M、W130F和N212F突變后，該酶對萘基酯表現(xiàn)出降解活性，其中以W130F突變酶的活性提高最為明顯。這可能因為突變型PETase的催化中心疏水性增加，且立體阻礙降低，使體積更大的疏水性萘基能順利進入酶的催化域凹槽中。Austin等[24]發(fā)現(xiàn)PETase對PET的生物基替代物2，5-呋喃二甲酸乙二醇酯(PEF)具有活性，但對脂肪族聚酯類的聚乳酸和聚丁二酸丁二醇酯均無活性。因此推測PETase主要是一種芳香族聚酯酶，并且可能對多種芳香族聚酯具有水解活性。

PETase具有一定的熱不穩(wěn)定性，其最適溫度范圍是25～35 ℃，在55 ℃時幾乎沒有活性，通過硫酸銨沉淀和戊二醛交聯(lián)法固定PETase后，酶的活性比溶液條件下有所下降，但其熱穩(wěn)定性增強，最適溫度范圍擴大到25～45 ℃，且在65 ℃時仍保留其最高活性的60 %[25]。可見PETase能在室溫時表現(xiàn)出很好的PET薄膜降解活性，而TfH、LCC和FsC的活性最佳溫度在50～70 ℃，因此在工業(yè)應用中PETase對溫度條件的要求可能更低。隨著酶濃度的增加，PETase相比TfH、LCC和FsC的活度比下降，表明PETase在低濃度下能更有效地降解PET[9]。

PETase對PET的水解活性還受到溶劑中其他組分的影響，如溶劑中鹽濃度在100～500 mmol/L的范圍內，PETase的酶活性與鹽濃度成正比，中等濃度的甘油(10 %～20 %)能夠提高酶的活性，而有機溶劑和洗滌劑(如乙醇、丙醇、吐溫20等)會降低酶活性。Furukawa等[26]將低結晶度的PET薄膜提前用陰離子表面活性劑處理1 h，然后加入PETase在30 ℃進行水解反應，發(fā)現(xiàn)酶在起初3 h的催化活性比不用陰離子表面活性劑處理的對照組提高了120多倍。這可能是因為PETase自身帶正電，經(jīng)陰離子表面活性劑處理后的PET薄膜帶負電，因此酶到達PET表面的量增加，進而降解效率提高。該課題組提出PETase表面陰離子區(qū)由位于底物結合口袋一側的Arg24、Arg61和Lys66構成，該區(qū)域對陰離子表面活性劑發(fā)揮作用至關重要。此外他們發(fā)現(xiàn)，0.023 %的十二烷基磺酸鈉(SDS)能顯著增加PETase對PET薄膜的降解活性，但Liu等[25]發(fā)現(xiàn)0.1 %的SDS能完全抑制PETase降解對硝基苯基丁酯，因此對于表面活性劑的影響還有待深入研究。另外，溶液的pH也會影響PETase活性的發(fā)揮，該酶在pH為6～10時有活性，其最適pH范圍是7～9，在pH=8時達到最佳活性。

3 PETase的晶體結構

目前蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)中收錄的PETase晶體結構僅有14個，有關信息如表1所示。其中PETase與配體的復合物晶體結構僅有2個，即R103G/S131A雙突變(DM)型PETase分別與對硝基酚(pNP)和HEMT的復合物晶體結構。PETase原型酶以及DM型PETase-HEMT復合物的晶體結構如圖2所示，配體pNP和HEMT的分子結構式如圖1所示。

表1 PDB數(shù)據(jù)庫中PETase的晶體結構信息Tab.1 Information of crystal structures of PETase from PDB

在不同的PETase晶體結構[24, 27-29]中，一個非對稱單元里曾發(fā)現(xiàn)1條或者3條肽鏈，而排阻色譜實驗表明該酶以單體發(fā)揮PET水解活性[28]。PETase屬于α/β-水解酶超家族，具有典型的ɑ/β-水解酶折疊，結構中心的β-片層(β1～β9)由α-螺旋(α1～α7)所包圍。PETase具有在不同PET水解酶之間嚴格保守的催化三聯(lián)體Ser131-His208-Asp177。這3個催化殘基分別位于β5、β7和β8后的loop環(huán)上，其中親核性Ser131位于高度保守的“親核肘”(nucleophilic elbow)處，同His208形成氫鍵并被其誘導極化，而堿性His208則被酸性Asp177所穩(wěn)定[27-28]。Han等[27]發(fā)現(xiàn)催化中心Met132和Tyr58的骨架NH基團形成一個氧陰離子洞，這也是超家族成員酯酶和脂肪酶的共同特征。此外，催化中心附近的Trp156在PETase的3條肽鏈中分別采取不同構象(“A”“B”和“C”構象)，而其他同源酶相應位置的Trp均采取“C”構象，未出現(xiàn)構象“擺動”，這可能是因為PETase的Trp156附近為Ser185，比其他同源酶相應位置的His空間位阻更小，允許Trp156采取多種構象。PETase的表面高度極化，帶正電(等電點為9.6)；而與其同源性很高的嗜熱放線菌角質酶TfCut2[13]，其表面散布著酸性和堿性殘基，因此更接近于電中性(等電點為6.3)。此外，PETase和TfCut2相比具有更寬的底物結合凹槽，前者凹槽的最寬處約為后者的3倍，該結構對于結晶度較高的芳香族聚酯與活性位點的結合可能是必要的[24]。

圖1 PETase水解反應產物和PETase復合物晶體結構中配體的結構Fig.1 Structures of PETase hydrolysis products and ligands in the crystal complexes of PETase

圖2 PETase原型酶和DM型PETase-HEMT的晶體結構Fig.2 Crystal structures of apo-form PETase and DM-form PETase-HEMT

目前，研究者還無法得到野生型PETase與配體的復合物晶體，可能是因為PETase的Arg103側鏈伸入Ser131附近的狹縫，從而阻礙底物進入結合位點。Han等成功得到含有R103G突變的DM型PETase，以及該酶分別與底物類似物HEMT和產物類似物pNP的復合物晶體結構。將DM型和野生型PETase的晶體結構進行比對，發(fā)現(xiàn)突變并未明顯改變蛋白的整體折疊(Cα的RMSD=0.144～0.2 ?)，因此可利用DM型PETase的復合物晶體結構來推測酶的底物結合模式以及催化機制。此外研究者還測定了多種突變型PETase的晶體結構，如S131A和R280A突變酶等，用以分析定點突變的氨基酸殘基是否對酶的底物結合位點及活性產生關鍵的影響[27-28]。

4 PETase的底物結合模式與催化降解機制

4.1 PETase的底物結合模式

在DM-HEMT和DM-pNP的復合物晶體結構中[27]，配體主要以疏水作用結合于PETase表面的淺顯凹槽中。HEMT的結合位點包含Ala131、His208、Trp156、Ile179、Trp130、Tyr58和Met132等氨基酸殘基，底物一端羰基鄰近Ala131，推測其在野生型PETase中會受到Ser131的親核進攻，同時羰基氧原子指向氧陰離子洞并與之形成氫鍵，而酯氧原子與His208側鏈形成氫鍵。Trp156采取“B”構象并與底物苯環(huán)形成T-型的π-π堆積作用，而其他氨基酸殘基則提供疏水作用。pNP與DM型PETase的相互作用殘基則明顯少于HEMT，只有Trp156、Ile179和Met132與底物形成了疏水作用。有趣的是，pNP和HEMT的位置發(fā)生了輕微變化，二者的苯環(huán)旋轉了約36 °，且pNP的苯環(huán)比HEMT遠離活性位點約2.3 ?，并與Trp156的吲哚環(huán)形成面對面的π-π堆積作用。

Joo等[28]與Han等[27]幾乎同時得到了PETase的晶體結構，但前者通過分子對接模擬了一個長底物2-羥乙基四羥乙基對苯二甲酸酯[2-HE(MHET)4]與PETase的結合模式。模擬得到的底物結合口袋是一個長而淺的L型表面凹槽，寬約25～29 ?，長約40 ?，其表面主要呈現(xiàn)疏水性。2-HE(MHET)4中的一個MHET單體結合于亞位點I，其他3個MHET單體分別結合于亞位點II的IIa、IIb和IIc區(qū)。其中酶的催化域包含于亞位點I中，該位點與MHET單體的結合模式與Han等[29]得到的HEMT結合模式相似。

4.2 PETase的催化降解機制

基于晶體結構分析、定點突變和分子模擬等技術，研究者初步得到了PETase的催化機制，如圖3所示。首先PETase的原酶形式為底物提供了一個可供結合的淺表凹槽，同時催化中心附近的Trp156呈現(xiàn)不同構象。當酶結合PET時，底物中與苯環(huán)相連的羰基指向底物結合凹槽的中心，并受到催化三聯(lián)體的親核進攻，同時氧陰離子洞使酯鍵發(fā)生極化并穩(wěn)定反應中間產物，而Trp156采取“B”構象并與PET的TPA基團形成T型π-π堆積作用。接下來的作用機制與經(jīng)典的角質酶催化機制相同，先形成酰基酶中間體，然后由水分子進行第二次親核進攻，從而解離酯鍵。最終得到的苯甲酸基團形成一個大平面，其構象發(fā)生旋轉從而與Trp156形成面對面的π-π堆積作用，使產物從原來可能較弱的T型π-π堆積作用位點被移走[27]。

圖3 PETase的催化降解機制[27]Fig.3 Catalytic mechanism of PETase[27]

5 PETase的關鍵結構特征

5.1 PETase與其他同源PET水解酶的結構差異

將PETase與其他多個同源的PET水解酶進行蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)底物結合位點的氨基酸殘基嚴格保守或者半保守，表明不同PET水解酶具有相似的底物相互作用[27]。但PETase與其他PET水解酶在底物結合位點處還存在細微的差異，這可能是PETase水解活性較高的原因：(1)PETase形成了2個分子內二硫鍵(DS1和DS2)，而其他同源酶只有1個二硫鍵(DS2)。共同保守的DS2
(cys244-Cys260)連接了酶C末端的α-螺旋和最后一個loop環(huán)，因其位于活性位點的反面，推測DS2不會直接影響酶的活性，但會影響其結構的穩(wěn)定性。PETase專有的DS1
(cys174-Cys210)連接著β7-α5環(huán)與β8-α6環(huán)，而這兩個環(huán)分別包含了催化三聯(lián)體中的Asp177和His208。分子動力學模擬表明，在室溫下PETase活性位點的柔性比其他耐熱同源酶更大，而這種柔性由DS1控制，DS1的消失將導致催化三聯(lián)體的不穩(wěn)定。將DS1連接的2個Cys突變?yōu)槠渌鸓ET水解酶的對應殘基Ala后，PETase的熱穩(wěn)定性和活性隨著DS1消失均明顯下降，因此說明DS1對PETase的熱穩(wěn)定性和活性都有重要意義[27-29]。(2)PETase中的β8-α6環(huán)比同源酶TfCut2多出3個殘基(Asn215、Ser216和Asn217)，該環(huán)的延伸促使亞位點II的IIa區(qū)與IIb、IIc區(qū)相連形成一個長凹槽，而同源酶中更短的環(huán)則阻礙了亞位點II長凹槽的形成，使該位點僅包含IIa區(qū)。PETase與TfCut2在活性位點I處的殘基相同，表明二者與第一個MHET的結合模式相似。但在亞位點II處，PETase中含有Trp130和Ser209，而TfCut2的對應位置為His169和Phe249，將PETase的這兩個殘基分別突變?yōu)門fCut2的相應殘基后，發(fā)現(xiàn)突變酶對PET和BHET的降解活性均顯著下降，表明Trp130和Ser209對PETase活性的發(fā)揮很關鍵，這種殘基差異可能導致TfCut2的IIa區(qū)更窄更深，而不利于第二個MHET與酶的結合[28]。

5.2 影響PETase活性的關鍵殘基

將PETase底物結合位點處的氨基酸殘基進行突變，多數(shù)情況下會降低酶的水解活性。將催化域三聯(lián)體中的Ser、His和Asp分別突變?yōu)锳la，則酶對PET薄膜和BHET幾乎完全失去活性，說明這3個殘基是酶催化反應的關鍵組成[28]。Tyr58、Thr59突變對PET降解為MHET的效率影響較小，但對MHET進一步降解為TPA的效率影響很大。值得注意的是，盡管PETase的Ser209被替換為Phe或Trp130被替換為His后，酶活性顯著降低[28]，但對PETase引入S209F/W130H雙突變后，酶對PET和PEF的降解活性均高于野生型[24]。Ma等[30]通過分子對接發(fā)現(xiàn)Ile179能與長底物對苯二甲酸乙二醇酯二聚體(2PET)形成疏水作用，以往研究發(fā)現(xiàn)I179A突變型PETase幾乎無水解活性，可能是因為破壞了Ile179的疏水作用。該課題組將Ile179突變?yōu)槭杷愿鼜娗覀孺湼L的Phe，設計的新酶能夠固定住PET的苯環(huán)，從而成功將酶的水解活性提高了2.5倍。

除與底物直接相互作用的氨基酸殘基，其他殘基也能對PETase的活性產生影響。在PETase的催化水解過程中，Trp156的構象“擺動”可能有利于底物的結合與產物的移走，而Trp156的構象與Ser185緊密相關，將Ser185突變?yōu)镻ETase同源酶的對應殘基His后，PETase的活性明顯降低，說明該酶的突出活性至少部分依賴于Ser185的存在[27]。同理，L88F通過穩(wěn)定活性位點的關鍵殘基Tyr58，使突變酶的水解活性提高了2.1倍[30]。位于結合位點IIc區(qū)末端的Arg251由于帶正電且結構凸出，阻擋了底物結合位點的延伸，將其突變?yōu)檩^小疏水殘基Ala后，發(fā)現(xiàn)酶對PET薄膜的水解活性在18 h和36 h分別提高了22.4 %和32.4 %。對R251A型PETase進行晶體結構測定，發(fā)現(xiàn)突變后酶結合位點的IIc區(qū)得到延伸，并出現(xiàn)疏水非突起的凹槽，更有利于容納PET底物[28]。將同樣位于底物結合凹槽邊緣的帶電Arg61突變?yōu)槭杷畾埢鵄la后，通過降低其周圍的帶電性，增強了疏水性PET同PETase的結合，使酶的水解活性提高了1.4倍[30]。

6 結語

PET作為當前產量最高的聚酯，在民用和軍用產品的制造及包裝中得到廣泛的應用。由于PET較難生物降解，產生的大量PET廢棄物給生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害。由于傳統(tǒng)的焚燒、填埋和回收方法具有較大的弊端，探索經(jīng)濟、環(huán)境友好的生物降解方法成為當下的研究趨勢，而重點是找到降解活性強并且應用條件易達到的生物酶，以便能夠工業(yè)化推廣。近年來發(fā)現(xiàn)的新型PET水解酶PETase，對PET底物具有很強的選擇性，且在常溫時的降解活性顯著高于其他PET水解酶。通過對PETase的生物降解研究進行總結，得出以下幾點啟示：

(1)PETase發(fā)揮出色水解活性的關鍵特征為其專屬的二硫鍵DS1和獨特的亞結合位點II，可將其作為參考標準用于潛在PET水解酶的篩選；

(2)酶底物結合位點處的殘基以及能穩(wěn)定結合位點空間結構的殘基，可能對維持酶的水解活性具有重要影響。此外，降低酶表面結合位點處的帶電性可作為酶結構改造的依據(jù)，通過增強酶與疏水性PET的結合，進而提高其水解活性；

(3)目前的PETase水解實驗主要以低結晶度的PET薄膜為底物，但許多PET廢棄物為高結晶度制品，這可能對PETase的有效降解構成挑戰(zhàn)，由于PET在較高溫度下結晶度下降，設計耐熱的PET水解酶可能有助于提高PET的降解效率；

(4)已發(fā)現(xiàn)的PETase底物包括PET、PEF和對硝基苯酯等，但該酶不能降解脂肪族聚酯，表明PETase可能是一種芳香族聚酯酶。PETase新底物的發(fā)現(xiàn)，以及通過酶結構的改造拓寬底物范圍(如萘基酯)，將提高PETase的應用價值；

(5)PETase水解活性的發(fā)揮與外界條件息息相關，探索適宜的溫度、濃度和添加劑等反應條件，或者提高酶對不利條件的耐性，將有助于推進該酶的工業(yè)化應用進程。