柱前手性衍生化-反相高效液相色譜法拆分布洛芬對映異構(gòu)體

梅雪嬌，盧定強，冷柏榕，嚴相平*

1南京工業(yè)大學藥學院，南京211816；2南京工業(yè)大學江蘇省藥物研究所，南京211816

布洛芬（ibuprofen）為α-甲基-4-（2-甲基丙基）苯乙酸，是一種非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥。布洛芬由于其消炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用效果好，不良反應小，已在全世界廣泛使用。在結(jié)構(gòu)上，布洛芬分子中側(cè)鏈上有一個手性碳原子，因此，存在一對光學活性對映異構(gòu)體。現(xiàn)代藥理實驗證明，右旋布洛芬的藥理活性明顯優(yōu)于左旋體[1]。

布洛芬在體內(nèi)有明顯的藥理活性差異，其異構(gòu)體的分離檢測具有重要的意義。國內(nèi)外報道的關于布洛芬異構(gòu)體的分離檢測方法有多種，如手性HPLC色譜柱直接分離法、手性流動相添加劑法、TLC薄層色譜分析法、柱前衍生化試劑法[2-4]。由于手性色譜柱分離成本高；手性流動相添加劑法中添加劑的消耗量大；薄層色譜分析法不能準確定量分析；而在之前所報道的關于布洛芬柱前衍生化的方法中，試驗步驟復雜，操作較為繁瑣。

N′N-羰基二咪唑（簡稱CDI）是咪唑的衍生物，是一種重要的醫(yī)藥中間體，具有較強反應活性，可與羧基、氨基、羥基等官能團進行反應[5-10]；（R）-（+）-1-（1-萘基）乙胺（R-NEA）是一種重要的手性芳香胺類化合物，可作為手性衍生化試劑，增強布洛芬衍生產(chǎn)物的紫外吸收。本文利用CDI作為活化劑活化布洛芬的羧基基團，再用R-NEA作為衍生化試劑，對活化后的布洛芬進行柱前衍生，并用C18柱分離。本法操作簡單、經(jīng)濟可行、重現(xiàn)性良好、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定。

1 儀器與試藥、試劑

1.1 儀器

島津LC-2010A型高效液相色譜儀；UV檢測器；Lcsolution色譜工作站；Sartorius BT25S電子分析天平；GL-88B渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

（S）-（+）布洛芬對照品（純度99.9%，批號101203-201201，中國食品藥品檢定研究院）；（R）-（-）布洛芬對照品（純度99.9%，批號101405-201601，中國食品藥品檢定研究院）；1，1′-羰基二咪唑（CDI，國藥集團化學試劑有限公司）；R-（+）-1-（1-萘基）乙胺（R-NEA）（純度99%，Alfa Aesar）；布洛芬原料藥（批號：170101、170102、170103，國內(nèi)A公司生產(chǎn)）。磷酸、乙腈為色譜純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸（68∶32）；流速：1.0mL·min-1；波長：225 nm；進樣量：20μL；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

布洛芬對照貯備液的配制：分別精密稱取10mg（S）-（+）-布洛芬對照品和10 mg（R）-（-）布洛芬對照品，置同一20mL量瓶中，加乙腈制成0.5mg·mL-1的布洛芬對照貯備液備用。

布洛芬對照溶液的配制：取布洛芬對照貯備液1.0 mL于10 mL量瓶中，加乙腈制成0.05 mg·mL-1布洛芬對照溶液。

樣品溶液的配制：精密稱取10 mg樣品，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解定容。

活化劑溶液的配制：精密稱取CDI 37.5 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈制成0.375 mg·mL-1的溶液，注意臨用新配[13]。

R-NEA溶液的配制：精密稱取R-NEA 100mg，置10 mL量瓶中，加乙腈制成10 mg·mL-1的溶液。

2.3 衍生化方法

將布洛芬對照溶液、樣品溶液200μL與活化劑溶液200μL，振蕩10s充分混合后，室溫放置20min，經(jīng)過活化反應后，加入R-NEA溶液100μL，振蕩10 s充分混合后在80℃下反應2h。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

取布洛芬對照溶液，按“2.3”項下方法進行衍生化反應，精密吸取20μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。（R）-（-）布洛芬/（S）-（+）-布洛芬的非對映異構(gòu)體色譜峰的保留時間分別為25.6min和27.9min。分離度3.045，按（R）-（-）布洛芬衍生物峰計算理論塔板數(shù)2 621。結(jié)果表明，該方法分離效果好，專屬性強。色譜圖見圖1。

圖1 由R-NEA衍生的（±）-布洛芬的色譜圖

2.5 線性關系考察

精密吸取布洛芬對照貯備液0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分別置于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，得濃度為0.005、0.025、0.05、0.10、0.25 mg·mL-1的（S）-（+）-布洛芬/（R）-（-）布洛芬溶液。按“2.3”項下方法進行衍生化反應，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以布洛芬溶液濃度（X）為橫坐標，布洛芬衍生物峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，分別得（S）-（+）-布洛芬衍生物和（R）-（-）布洛芬衍生物的回歸方程（n=6）為：Y=5.23×107X+1.17×105（r=0.9997）和Y=5.60×107X+1.33×105（r=0.9997）。（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬濃度在0.005～0.25mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關系。

2.6 檢測限和定量限

?。⊿）-（+）-布洛芬衍生化溶液及（R）-（-）布洛芬衍生化溶液，適量稀釋，在20μL進樣量下，當信噪比（S/N）為3時，測得（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物的檢測限（LOD）分別為0.010μg·mL-1和0.015μg·mL-1；當信噪比（S/N）為10時，測得（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物的定量限（LOQ）分別為0.045μg·mL-1和0.05μg·mL-1。

2.7 進樣精密度試驗

精密吸取“2.5”項下0.05 mg·mL-1的（S）-（+）-布洛芬/（R）-（-）布洛芬衍生物溶液20μL注入液相色譜儀，連續(xù)平行進樣6次，照“2.1”色譜條件進行分析，記錄峰面積并計算相對標準偏差（RSD）值。（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物峰面積的RSD分別為0.86%和0.90%，結(jié)果表明，本法進樣精密度良好。

2.8 重復性試驗

按“2.3”項的方法平行配制6份（S）-（+）-布洛芬/（R）-（-）布洛芬溶液，精密吸取20μL注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件進行分析，記錄峰面積并計算含量和RSD值。（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物峰面積的RSD分別為0.73%和0.86%，結(jié)果表明，本法重復性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.3”項下方法操作，（±）-布洛芬溶液衍生化后分別于0、2、4、6、8、24、48 h進樣，考察（±）-布洛芬衍生化溶液放置穩(wěn)定性，在研究期間使用相同的流動相，結(jié)果48 h內(nèi)，（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物峰面積的RSD分別為0.50%和0.96%，結(jié)果表明，（±）-布洛芬衍生化溶液在室溫條件下48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 回收率試驗

精密稱取（S）-（+）-布洛芬對照品10 mg共9份，分為3組分別加入8、10、12 mg的（R）-（-）-布洛芬對照品，置200 mL量瓶中加乙腈溶解定容；同樣，精密稱?。≧）-（-）-布洛芬對照品10 mg共9份，分為3組分別加入8、10、12 mg的（S）-（+）-布洛芬對照品，置200 mL量瓶中加乙腈溶解定容，回收率溶液與布洛芬對照溶液按“2.3”項下方法進行衍生化反應，按“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積并計算加樣回收率和RSD值，結(jié)果（R）-（-）-布洛芬和（S）-（+）-布洛芬的平均回收率分別為100.2%、99.10%，RSD分別為1.06%、1.43%。結(jié)果表明，本法回收率良好。見表1、表2。

表2 （S）-（+）-布洛芬回收率試驗結(jié)果

2.11 樣品測定

取3批樣品，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.3”項下方法制備樣品衍生化溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，170101、170102和170103共3批樣品測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果（%）

3 討 論

3.1 衍生化試劑的選擇及原理

CDI與酸的反應低毒，反應條件溫和，轉(zhuǎn)化率好。旋光純手性試劑R-NEA，具有較強的紫外吸收，R-NEA作為衍生化試劑，可增強布洛芬衍生產(chǎn)物的紫外吸收，反應溫和。該方法相比于其他衍生化方法操作步驟簡單，衍生化試劑價格便宜。原理見圖2。

3.2 衍生化條件的優(yōu)化

3.2.1 CDI對衍生化效率的影響 CDI與羧基的活化反應溫和且過量的活化劑不會影響衍生化反應。將過量的活化劑與布洛芬室溫下分別活化5、10、15、20 min后進行衍生化反應，發(fā)現(xiàn)15 min以后產(chǎn)物峰面積未有明顯變化。為保證其充分活化，選擇最佳試驗活化時間20 min。為使衍生化反應完全，活化劑和萘乙胺必須過量，過量的活化劑和萘乙胺與衍生物能很好的分離，不影響布洛芬異構(gòu)體的分析。配制CDI與布洛芬物料比分別為1.91∶1、4.77∶1、9.54∶1、19.07∶1進行反應，室溫下活化20 min后，加入過量R-NEA，80℃反應2 h后，結(jié)果表明，當CDI與布洛芬的物料比為4.77∶1~19.07∶1時，衍生物峰面積沒有變化，為確保布洛芬被充分活化，故CDI與布洛芬的最佳物料比為5∶1。

3.2.2 R-NEA比例對衍生化效率 過量的RNEA胺可以保證反應充分進行，為避免R-NEA的浪費，取CDI與布洛芬物料比為5∶1活化后，RNEA與布洛芬物料比12∶1、30∶1、60∶1、120∶1進行反應，結(jié)果顯示，R-NEA與布洛芬的物料比為60∶1~120∶1時，反應產(chǎn)物峰面積沒有變化，故R-NEA與布洛芬的最佳物料比為60∶1。

3.2.3 反應溫度和時間對衍生化效率的影響取“2.4”項下配制的（±）-布洛芬溶液200μL加CDI溶液50μL，活化20 min后，加入R-NEA 100μL，分別在20℃、40℃、60℃、80℃、90℃下反應2 h，試驗證明溫度越高反應速率越快，故以80℃為最佳反應溫度，見圖3。另取布洛芬溶液500μL加CDI溶液200μL，活化20 min后，加入R-NEA 100μL，在80℃下分別反應30min、1、2、4、6h，試驗證明2 h以后峰面積沒有變化，反應完全，故選擇最佳試驗時間2h，見圖4。

圖2 使用CDI作為活化劑，用R-NEA衍生布洛芬對映體

4 小 結(jié)

本實驗采用柱前衍生化的方法，實現(xiàn)了布洛芬對映異構(gòu)體之間的分離，精確度高、專屬性強，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定，操作簡單，生成的衍生物可用普通C18柱分離，解決了手性柱難以解決的問題，可用于布洛芬對映異構(gòu)體的分離和光學純度的質(zhì)量監(jiān)控，在藥物質(zhì)量控制方面有很大的意義。

圖3 反應溫度對衍生化的影響

圖4 反應時間對衍生化的影響