鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A和他克莫司藥效的監(jiān)測方法進展

姚 婧，林榆杰

泰州市人民醫(yī)院，泰州225300

免疫抑制治療是器官移植術(shù)后抗排斥反應(yīng)的重要措施。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（Calcineurin inhibitors，CNIs）環(huán)孢素A（Ciclosporin A，CsA）和他克莫司（Tacrolimus，Tac）是器官移植術(shù)后最常用的免疫治療藥物，其應(yīng)用大大降低了移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生，提高了移植器官的生存率[1]。

盡管CNIs是移植藥物史上的重大發(fā)現(xiàn)，但是CNIs的治療窗窄，藥物代謝參數(shù)和藥效的個體差異大，長期應(yīng)用易產(chǎn)生毒副作用，如神經(jīng)系統(tǒng)毒性、移植后腫瘤以及各種代謝疾病。臨床上CNIs的劑量調(diào)整主要是使用治療藥物監(jiān)測（Treatment drug monitoring，TDM），監(jiān)測CNIs谷濃度結(jié)合患者臨床癥狀進行，但這種方法無法確定初始治療劑量，無法準確監(jiān)測患者實時藥效。為此，研究者不斷尋找更多的藥效靶標(biāo)，來評價CNIs的免疫抑制效果，以輔助CNIs的個體化給藥。本文就目前常用的CNIs藥效監(jiān)測方法作一綜述。

1 非特異性測定

CNIs藥效的測定方法可分為非特異性測定和特異性測定。非特異性的藥效參數(shù)是通用的，用于反映移植術(shù)后免疫系統(tǒng)的總體活性。優(yōu)點之一就是可以評估臨床聯(lián)合用藥時機體的整體免疫狀態(tài)。常見的非特異性藥效靶標(biāo)有：T細胞增殖水平、T細胞表面抗原、T細胞亞群、CD4+中ATP水平、抗HLA（human leukocyte antigen，人類白細胞抗原）抗體以及可溶性CD30（soluble CD30，sCD30）等。

目前臨床應(yīng)用的大部分免疫抑制劑都是通過抑制淋巴細胞增殖發(fā)揮作用。Barten MJ等[2]通過流式細胞術(shù)測定刺激后全血或PBMCs（peripheral blood mononuclear cells，外周血單個核細胞）中淋巴細胞的擴增，來比較不同濃度下CsA或Tac與霉酚酸酯聯(lián)用時免疫抑制效果。Kurata Y等[3]使用基于羧基二乙酸酯琥珀酰亞胺酯（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）的方法，測定66例服用CsA的腎移植患者的T細胞增殖水平，發(fā)現(xiàn)患者臨床表現(xiàn)如不良事件的發(fā)生與T細胞增殖的百分比有較好的相關(guān)性。

此外，Barten MJ等[2]還觀察到各免疫抑制劑聯(lián)用時增殖細 胞 核 抗 原 （Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、CD25、CD95或CD154等表達抑制增強。Stalder M等[4]通過流式細胞儀測定淋巴細胞增殖及淋巴細胞表面抗原CD25、CD71和CD154的表達，監(jiān)測腎移植患者的免疫狀態(tài)。

同時，T細胞亞群的分化是評估機體免疫狀態(tài)的常用方法。移植術(shù)后患者CD4+T細胞絕對計數(shù)過低易引起嚴重感染，而CD4+/CD8+過高則易導(dǎo)致排異反應(yīng)的發(fā)生[5]。劉偉等[6]聯(lián)合檢測肝移植術(shù)后患者的CD4+T細胞ATP水平和T淋巴細胞亞群，發(fā)現(xiàn)排異組受者外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞百分比及CD4/CD8均明顯升高。Martínez C等[7]測定異基因造血細胞移植術(shù)后的藥效學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞ATP水平的升高、CD8+T細胞升高及CD8+Treg細胞的降低與移植物抗宿主病顯著相關(guān)。

采用ImmuKnow技術(shù)檢測CD4+T細胞ATP水平，可以快速評估細胞的免疫功能。多項研究顯示，發(fā)生感染時，ATP濃度明顯下降，感染控制后恢復(fù)至感染前水平；發(fā)生排斥時，濃度升高，排斥控制后ATP濃度降至排斥前水平[6，8-10]。

Amirzargar MA等[11]認為，移植術(shù)后早期監(jiān)測HLA抗體、sCD30等生物標(biāo)記物有利于監(jiān)測腎移植后免疫反應(yīng)。由供體特異性HLA抗體（donor-specific human leukocyte antigen antibodies，DSA）引起的抗體介導(dǎo)的同種異體移植物損傷最近被認為是晚期移植物丟失的主要原因之一[12]。CNIs的應(yīng)用有利于阻止DSA的免疫學(xué)作用[13]。

sCD30被認為是反映機體免疫是否處于活化狀態(tài)的靶標(biāo)，可指示急性排斥反應(yīng)的發(fā)生[11，14]。研究證明，移植前后可溶性CD30的提高與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生和不良術(shù)后有關(guān)[15]。

綜上，這些非特異性的靶標(biāo)并不僅僅針對CNIs的藥效，它們反映的是機體的總體免疫狀態(tài)或細胞的免疫功能。這些靶標(biāo)的測定有利于監(jiān)測移植術(shù)后患者免疫抑制治療的藥效，促進CNIs的個體化用藥。

2 特異性測定

藥物的藥理作用決定了該藥物的藥效特異性監(jiān)測方法。對于CNIs，它主要是通過抑制T淋巴細胞內(nèi)的鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN）活性而發(fā)揮作用。CaN活性的下調(diào)抑制了NFAT（Nuclear factor of activated T-cells，活化T細胞核因子）的去磷酸化，使NFAT無法進入細胞核，從而使NFAT下游基因（如白介素-2、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α等）的轉(zhuǎn)錄和表達被抑制，產(chǎn)生免疫抑制作用。CNIs藥效通路上其主要的特異性藥效參數(shù)包括：CaN活性、NFAT核轉(zhuǎn)位、細胞因子釋放水平和細胞因子基因表達等。

2.1 CaN活性的直接測定

傳統(tǒng)的測定CaN活性的方法有：32P標(biāo)記肽的放射性同位素法、分光光度法、液相色譜法等。

Koefoed-Nielsen PB等[16]通過測定32P標(biāo)記肽的放射性同位素法測定CaN活性，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞中CaN活性的抑制程度與CsA血藥濃度呈負相關(guān)。同時也發(fā)現(xiàn)Tac和CsA產(chǎn)生的CaN活性抑制效果個體差異性較大。因此，CNIs的藥效測定對于了解CsA和Tac的個體敏感性是很有必要的。

Sanquer S等[17]通過分光光度法評估肺移植后最初2年內(nèi)CaN的活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶活性高于102 pmol·mg-1·min-1的上限或低于12 pmol·mg-1·min-1的下限時，排斥的風(fēng)險更高。

Carr L等[18]建立了一種液相色譜-多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-TandemMass Spectrometry，LCMRM-MS），通過測量合成的磷酸肽底物的去磷酸化來量化CaN活性。該方法適用于常規(guī)臨床劑量的藥物，有望于大規(guī)模用于臨床，以檢測CNIs治療患者的CaN活性。

2.2 NFAT核轉(zhuǎn)位測定

NFAT是參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子家族。對NFAT核轉(zhuǎn)位的抑制是CNIs藥效通路上的重要一環(huán)。Maguire O等[19]通過使用流式細胞儀的圖像分析系統(tǒng)，定量測定CD4+和CD8+T細胞中的NFAT1核轉(zhuǎn)位來評估NFAT的激活效應(yīng)，從而確定他克莫司介導(dǎo)的抑制效應(yīng)。體外實驗證實，他克莫司對NFAT1核轉(zhuǎn)位的抑制有劑量依賴性，體內(nèi)實驗（n=3）也發(fā)現(xiàn)，患者血漿和CD4+中的Tac濃度均與NFAT1核轉(zhuǎn)位的變化相反。這些均表明NFAT1核轉(zhuǎn)位可作為監(jiān)測Tac藥效的生物靶標(biāo)。

2.3 細胞因子釋放水平測定

CNIs通過抑制白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）等細胞因子的表達水平來抑制免疫反應(yīng)?？赏ㄟ^測定移植后患者血清或刺激之后PBMCs中的細胞因子水平，用來作為衡量CNIs藥效的間接指標(biāo)。Barten MJ等[20]發(fā)現(xiàn)，CNIs的血藥濃度水平與IL-2的產(chǎn)生緊密相關(guān)。然而，由于不同細胞所處周期不同，細胞因子的生存半衰期不同以及細胞因子表達上調(diào)、下調(diào)的變化，監(jiān)測細胞因子產(chǎn)生有一定的困難。

2.4 細胞因子mRNA表達測定

考慮到直接測定細胞因子水平的缺陷，研究人員通過測定細胞因子的mRNA表達來評估CNIs的免疫抑制效果。

Ha¨rtel C等[21]采用RT-PCR（Reverse Transcription PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR）測定全血中細胞因子的mRNA表達，用于監(jiān)測CsA的藥效。研究者發(fā)現(xiàn)，T細胞刺激后TNF-α的mRNA表達增加且代謝延緩，這表明炎癥因子mRNA表達的變化有望成為CsA個體效應(yīng)的敏感指標(biāo)。該研究團隊同時還測定了全血中IL-2 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)Tac單一療法的患者IL-2 mRNA表達可能與移植術(shù)后排斥相關(guān)[22]。

德國海德堡大學(xué)的Sommer C團隊建立了一種通過RT-PCR測定NFAT下游基因的表達水平，監(jiān)測移植患者CNIs藥效的方法[23]。在體外實驗中，在CsA劑量為20 ng·mL-1和200 ng·mL-1時，測定經(jīng)刺激后的PBMCs中NFAT各下游基因的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)IL-2、IFN-γ和GM-CSF（Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）三種細胞因子的mRNA表達變化最為敏感。進一步研究發(fā)現(xiàn)，每位個體患者的NFAT下游基因（IL-2，IFN-γ和GM-CSF）的相對表達（Residual gene expression，RGE）相互關(guān)聯(lián)[24]。RGE與CSA或Tac的劑量間有高度的個體間差異。相反，在治療方案穩(wěn)定的情況下，RGE的個體內(nèi)差異性相對較小。

3 CNI藥效監(jiān)測的臨床研究

盡管越來越多的CNIs藥效監(jiān)測方法在不斷出現(xiàn)，但至今為止未有一種方法大規(guī)模用于臨床常規(guī)監(jiān)測。臨床研究已經(jīng)證實CNIs藥物濃度和CaN的活性之間的關(guān)系，但關(guān)于CaN活性與移植后臨床結(jié)局之間的關(guān)系研究仍然較少。在器官移植排斥中，CaN的活性與肝移植術(shù)后的臨床結(jié)局有關(guān)[25]。在長達兩年隨訪中，Sanque S等[17]發(fā)現(xiàn)在肺移植患者（N=107）中CaN的活性與急性和慢性排斥反應(yīng)有關(guān)。

臨床實驗中，Sommer C團隊以NFAT下游基因（IL-2、IFN-γ和GM-CSF）的相對表達監(jiān)測CsA和Tac的藥效，發(fā)現(xiàn)NFAT RGE可以有效地指示移植術(shù)后患者AR及感染并發(fā)癥的發(fā)生[23，26，27]。通過監(jiān)測CsA谷濃度水平和NFAT RGE可以評估老年患者腎移植術(shù)后的心血管風(fēng)險、腎功能和其它副作用，如感染、惡性腫瘤[27]等。同樣，通過NFAT下游基因監(jiān)測Tac藥效可以指示腎移植患者感染并發(fā)癥的發(fā)生[28]。前瞻性臨床試驗（n=22）也證實，監(jiān)測NFAT下游基因表達可以作為肝移植術(shù)后檢測CNIs藥效的一種可靠措施[29]。此外，一項關(guān)于CsA的大型前瞻性隨機干預(yù)試驗正在進行，該項研究是第一個評估穩(wěn)定腎移植患者免疫檢測方法、優(yōu)化免疫抑制效果的隨機對照研究。

4 結(jié)論和展望

雖然目前的CNIs的藥效測定方法多數(shù)仍停留在實驗室階段，到真正應(yīng)用于臨床實踐還有一段距離；但不可否認的是，CNIs藥效的測定為了解生物效應(yīng)和免疫抑制程度提供了一種新策略，有助于評估CNIs藥物效應(yīng)。在未來，CNIs藥效的測定有望成為輔助TDM、優(yōu)化CNIs個體化給藥的新措施。