綜述牛奶中黃曲霉毒素M1的檢測方法

張 佳 左英芳 王 丹 關(guān)婷婷 秦 娜

（焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，河南焦作 454003）

1 理化性質(zhì)

黃曲霉毒素 M1（Aflatoxin M1，AFM1），分子式為 C17H12O7，熔點(diǎn)（裂解溫度）299℃，是黃曲霉毒素中一種二氫呋喃雜萘鄰?fù)苌?。研究表明，AFM1是黃曲霉毒素B1（AFB1）的羥基化衍生物，即由AFB1轉(zhuǎn)化而成。它常溫下呈片狀結(jié)晶，溶于乙腈、甲醇、氯仿、丙酮等極性有機(jī)溶劑，非極性溶劑（乙醚、正己烷、石油醚等）不溶解。AFM 1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐熱耐酸。AFM 1 毒性和致癌性均強(qiáng)，是已知的20種黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的，僅次于AFB1，相當(dāng)于5倍的氰化鉀，40倍的砒霜。經(jīng)機(jī)體吸收后，作用于肝臟，易引起肝腫瘤和肝癌。

2 牛奶中AFM1限量標(biāo)準(zhǔn)

AFM1是牛奶質(zhì)量安全風(fēng)險評估的主要危害因子，各國分別制定牛奶中AFM1限量。其中歐盟各國對嬰幼兒配方牛奶限量為0.025 μg/kg，我國規(guī)定嬰兒乳品限量值為不得檢出，牛乳中AFM1限值為0.5 μg/kg[1]。

3 檢測方法

目前牛奶中AFM1檢測方法主要有薄層色譜分析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）和快速檢測法。

3.1 TLC法

TLC法為定性半定量法。利用黃曲霉毒素M1在365nm波長下發(fā)出藍(lán)紫色熒光的特性，提取、濃縮、分離樣品，在薄層板上顯示熒光，對照標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度，定量含量。此法為AFM1的經(jīng)典方法，設(shè)備簡單，適用于大規(guī)模的篩查研究，缺點(diǎn)為半定量方法，試驗(yàn)步驟多，干擾因素多且因接觸AFM1有安全危害。

3.2 HPLC法

利用免疫親和柱或C18柱反復(fù)進(jìn)行萃取和洗脫，分離試樣中的AFM1，結(jié)合熒光檢測器定量含量。方法為：100ml試樣加熱至40℃，加入1.0gNaCl，5000r/min離心15min，50ml清澈液緩慢過免疫親和柱或C18柱，10ml水、4ml乙腈洗脫備用。色譜條件為：Thermo Scientific Hypersil BDS C18 柱，25%乙腈水作流動相，365 nm激發(fā)波長、435 nm發(fā)射波長，20 μl進(jìn)樣量，外標(biāo)法定量。胡宏?duì)N等用此方法測得回收率為 68～85%，分離能力強(qiáng)、特異性好、結(jié)果可靠準(zhǔn)確。但所需儀器昂貴，前處理麻煩，需用免疫親和柱，檢測成本高。

3.3 LC-MS法

LC-MS法是利用質(zhì)荷比的分析方法，試樣各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶電荷的離子，再其在電場和磁場中運(yùn)動軌跡的不同，分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，進(jìn)而定性定量。此法作為廣泛使用的定量方法，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度更高、選擇性更強(qiáng)的特點(diǎn)，但與HPLC法相比均所用設(shè)備昂貴，成本高。兩種方法都需用到免疫親和柱，由于牛奶中含有大分子蛋白質(zhì)，即使超高速離心也難以得到澄清液體，導(dǎo)致過柱速度過于緩慢，大大降低實(shí)驗(yàn)效率。左英芳等在GB5009.24-2016基礎(chǔ)上，將免疫親和柱改為Bond Elut Plexa 固相萃取柱，用乙腈提取，3ml液體過柱，增加正己烷和20%丙酮-二氯甲烷凈化，結(jié)果表明節(jié)約時間成本、增加實(shí)驗(yàn)效率、減少檢測成本，滿足實(shí)驗(yàn)靈敏度要求，但存在固相萃取柱選擇性較低、響應(yīng)度較低的問題。姜學(xué)涯等結(jié)合牛奶特性，乙腈提取，加入乙酸鋅及亞鐵氰化鉀溶液，震蕩離心取上清液過濾膜備用。采用Inersil ODS-3色譜柱，以0.1%甲酸和甲酸銨溶液-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速：0.25 ml/min，正離子模式監(jiān)測，MRM模式定量分析。該法解決了常規(guī)方法前處理程序繁瑣、樣品難過柱的問題，結(jié)果表明前處理成本僅為國標(biāo)法比的1/8，檢測效率提高了2倍，且能準(zhǔn)確定性定量。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附快速檢測法

此法為定性方法，結(jié)合抗原抗體的免疫反應(yīng)、酶的高效催化作用，生成有色物質(zhì)，肉眼觀看顏色深淺判斷含量，適用于風(fēng)險監(jiān)測等大規(guī)模樣本監(jiān)測的普選和初篩，具有結(jié)果準(zhǔn)確，操作步驟簡單、成本較低的優(yōu)點(diǎn)，因此在食品檢測、分析化學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。李江等用60%甲醇水提取試樣，采用1∶4純水稀釋，酶聯(lián)免疫法測定AFM1。結(jié)果表明AFM1的回收率在90%～110%之間，符合方法要求（50%～120%），且快速、穩(wěn)定。胡宏?duì)N等研究比較了酶聯(lián)免疫吸附快速檢測法和HPLC法，發(fā)現(xiàn)快速檢測法快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高，但重復(fù)性差，偶爾存在假陽性和假陰性等缺點(diǎn)，從而提出處理批量樣品時，結(jié)合快速法和HPLC法，先初步篩選出陽性樣品，再利用HPLC法準(zhǔn)確定性定量，可大大提高效率。李松勵等采用酶聯(lián)免疫吸附測定的方法對河北省、河南省、黑龍江省、山東省和內(nèi)蒙古自治區(qū)5個主產(chǎn)區(qū)的5 080份生鮮乳進(jìn)行測定，系統(tǒng)分析我國當(dāng)前AFM1的污染現(xiàn)狀，得出污染發(fā)生率為 4.6%，我國AFM1的污染情況正在改善，冬季污染發(fā)生率為11.2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出春秋夏季，故冬季需提前做好飼料防霉脫毒等污染防控措施。