豬丹毒桿菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗

陳關雄 向必勇 幸更東 臺曉媛*

（1.石林彝族自治縣畜牧獸醫(yī)總站，云南石林 652200；2.云南省種羊繁育推廣中心，云南尋甸 655200；3.玉溪市紅塔區(qū)畜禽改良站，云南玉溪 653100）

豬丹毒（Swine erysipelas）是由紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的豬的一種急性熱性傳染病[1]。1876年Koch首次從患有敗血病小鼠的血液中分離出本菌，1882年Louis Pasteur首次從病豬體內(nèi)分離到本菌[2]。目前該病在世界上大多數(shù)國家都有分布，呈散發(fā)或流行性發(fā)生，不同年齡、性別和品種的豬均有易感性，但以3個月以上的生長豬發(fā)病率最高，牛、羊、馬、犬、家禽及一些鳥類均可發(fā)病，也能危害人類健康[3-4]。臨床病例可分為急性型、亞急性型和慢性型，急性型表現(xiàn)為體溫急劇升高至42℃以上，病豬突然死亡，在頸部、耳后以及胸腹側等處的皮膚上出現(xiàn)形狀不同的紅斑，手指按壓會褪色；亞急性型表現(xiàn)為，在頸部、背部、胸側以及四肢外側等皮膚上出現(xiàn)不同大小的深紅色疹塊，扁平凸起，彼此間存在清晰界限；慢性型表現(xiàn)為皮膚壞死，漿液性纖維素性關節(jié)炎和疣狀心內(nèi)膜炎[5]。

豬丹毒的實驗室診斷主要分為細菌的分離鑒定、血清學診斷和聚合酶鏈式反應（PCR）[6－7]。本研究通過對臨床疑似豬丹毒發(fā)病死亡的生豬進行解剖，采集腎臟、脾臟和淋巴結進行細菌的分離培養(yǎng)，通過形態(tài)觀察、生化鑒定、動物試驗及藥物敏感性試驗來進行診斷和分析，為豬丹毒的預防和治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 石林縣某養(yǎng)殖戶臨床疑似豬丹毒發(fā)病死亡的生豬，經(jīng)解剖，無菌采取腎臟、脾臟、淋巴結等組織待用。

1.1.2 培養(yǎng)基 鮮血瓊脂培養(yǎng)基、5%馬血清瓊脂培養(yǎng)基、5%馬血清肉湯培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇、棉子糖、甘露醇、菊糖、蕈糖、蔗糖、水楊苷、尿素、H2S、MR、VP、靛基質、明膠。

1.1.4 試驗設備 高壓滅菌鍋、超凈工作臺、生物顯微鏡、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、試管、培養(yǎng)皿等，抗菌藥物藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 將采集到的腎臟、脾臟等樣品無菌操作劃線接種于鮮血培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h－48h，觀察菌落形態(tài)特征，挑取可疑菌落再次劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基或5%馬血清瓊脂培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)，然后進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細菌的形態(tài)特征。

1.2.2 分離菌株的鑒定

（1）鏡檢：挑取分離菌落均勻涂布于載玻上，經(jīng)酒精火焰固定后進行革蘭氏染色、鏡檢。

（2）糖發(fā)酵試驗：挑取分離菌株分別接種于含5%馬血清的糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，根據(jù)指示劑的顏色變化，觀察分離菌株對糖的分解利用情況。

（3）生化試驗：挑取分離菌株分別進行尿素試驗、H2S試驗、MR試驗、VP試驗、靛基質試驗、明膠穿刺試驗，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h（明膠穿刺試驗20℃）后，觀察并記錄結果。

1.2.3 動物試驗 將分離菌株接種于5%馬血清肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，取肉湯培養(yǎng)物1ml經(jīng)胸肌分別接種3只家鴿，另取1ml肉湯培養(yǎng)物經(jīng)皮下接種2只豚鼠作對照，連續(xù)觀察一周，記錄發(fā)病及死亡情況。對攻毒死亡家鴿進行解剖，采取心血和肝臟等進行涂片染色和分離培養(yǎng)，并與分離菌株進行對照分析。

1.2.4 藥物敏感性試驗 挑取豬丹毒分離純培養(yǎng)菌株接種于5%馬血清肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，取100μl培養(yǎng)物均勻涂布于5%馬血清瓊脂培養(yǎng)基，正向置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃干燥1h，用無菌攝子夾取藥敏紙片貼于瓊脂表面，37℃倒置恒溫培養(yǎng)24h后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，記錄試驗結果。結果判定參照美國臨床試驗室標準委員會（CLSI）2012版（標準）執(zhí)行標準進行，同時以杭州微生物試劑有限公司提供的紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判定標準作為參考。

2 結果

2.1 培養(yǎng)特性與細菌形態(tài)

37℃培養(yǎng)24h后，在鮮血瓊脂上形成針尖大小，露珠樣菌落，菌落呈圓形、灰白色，表面光滑、濕潤，中部凸起，邊緣整齊，菌落直徑1-2mm。革蘭氏染色陽性，菌體平直或稍彎曲的纖細小桿菌，兩端鈍圓，無鞭毛、無莢膜、不產(chǎn)生孢，呈V形、短鏈或堆狀排列（圖1、2）。

圖1 鮮血瓊脂培養(yǎng)物（100×16 革蘭氏染色）

圖2 馬血清肉湯培養(yǎng)物（100×16 革蘭氏染色）

2.2 生化試驗

在加有5%馬血清的糖培養(yǎng)基中可發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)生；不發(fā)酵蔗糖、甘露醇、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、菊糖、蕈糖、水楊苷。能產(chǎn)生H2S，不產(chǎn)生靛基質，MR及VP試驗無陰性，不分解尿素（詳見表1）。

表1 分離菌株生化試驗結果

2.3 明膠穿刺試驗

明膠穿刺試后，分離菌株沿穿刺線橫向四周生長，呈試管刷狀，不液化明膠（圖3）。

圖3 明膠穿刺試驗

2.4 動物試驗

將分離菌株培養(yǎng)物分種接種3只家鴿和2只豚鼠，在接種后18h，家鴿表現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬松、活躍程度下降、不食等癥狀；接種72h后，3只家鴿全部死亡，2只豚鼠均健康；觀察至第7天，2只豚鼠仍然健康存活。對死亡的3只家鴿進行解剖，無菌采取家鴿的心血、肝臟分別進行涂片染色和分離培養(yǎng)。經(jīng)涂片染色，可見大量纖細的革蘭氏陽性小桿菌，呈V形、短鏈或堆狀排列；將采集的肝臟、脾臟樣品劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，形成針尖大小，露珠樣菌落，挑取菌落染色鏡檢和生化鑒定均和分離菌株的結果一致（圖4、5）。

圖4 鴿子肝臟觸片（100×16 革蘭氏染色）

圖5 鴿子心血觸片（100×16 革蘭氏染色）

2.5 藥敏試驗

選用青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟等14種抗生素對分離菌株進行藥敏試驗，結果分離菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢曲松四種藥物敏感，對紅霉素、氟苯尼考兩種藥物中度敏感，對頭孢氨芐、多西環(huán)素、恩諾沙星、甲氧芐氨嘧啶、阿奇霉素、復方新諾明、丁胺卡那霉素、左氧氟沙星耐藥（詳見表2）

3 討論

本研究通過對病死生豬的組織樣品進行分離培養(yǎng)、鏡檢形態(tài)、生化鑒定、動物回歸試驗，確定分離菌株為豬丹毒桿菌。

表2 藥物試驗結果

豬丹毒、豬瘟、豬肺疫在20世紀80年代和90年代初并稱我國養(yǎng)豬業(yè)三大傳染病[8]，然而，隨著豬丹毒、豬瘟、豬肺疫疫苗和青霉素等抗菌藥物的使用，豬丹毒臨床病例已慢慢減少，在臨床上已很難見到發(fā)病的情況。近年來，國家對生豬疫病防控重點隨著生豬疫病的流行情況發(fā)生了改變，生豬養(yǎng)殖場（戶）生豬疫病的防控重點也主要以病毒性疫病為主，往往忽略了細菌性疫病的防治，然而，丹毒絲菌可感染包括哺乳動物、禽和魚類等70多種動物，對鹽腌、火熏、干燥、腐敗和日光等自然環(huán)境抵抗力強；加之，由于抗生素殘留問題，許多飼料生產(chǎn)企業(yè)已不在飼料中添加抗生素或減少抗生素的添加量；再之，豬丹毒與豬瘟、豬流行性腹瀉、豬藍耳、豬圓環(huán)等疫病伴發(fā)，能加重本病的發(fā)生與流行等原因，造成豬丹毒有卷土重來之勢，生豬養(yǎng)殖場（戶）應重視豬丹毒的防治工作。

本研究通過選擇臨床常用、革蘭氏陽性菌敏感、廣譜的14種抗菌藥物，對分離菌株進行了藥物敏感性試驗，結果顯示，分離的豬丹毒桿菌對青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟和頭孢曲松四種藥物敏感，對紅霉素、氟苯尼考中度敏感，其余藥物均出現(xiàn)了耐藥的情況。在臨床診療過程中，治療豬丹毒首選的藥物還是青霉素類抗生素，當發(fā)現(xiàn)使用的抗生素治療效果不好時，應及時分離菌株進行藥物敏感性試驗，篩選敏感抗菌藥物來進行治療，避免濫用藥物，以提高治療的效果，降低經(jīng)濟損失。