萬古霉素在金黃色葡萄球菌中的耐藥性研究進展

魏 利，李桂秋

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，哈爾濱 150001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一種重要的人類病原體，在19世紀80年代就已經(jīng)被認為是化膿性膿腫的病因[1]。SA感染的范圍從輕微的皮膚和軟組織感染到威脅生命的心內(nèi)膜炎、慢性骨髓炎、肺炎或菌血癥，這些感染性疾病的發(fā)病率和病死率均較高[2]。在20世紀中期，抗生素如青霉素和甲氧西林的出現(xiàn)和使用，最初被證明對治療SA感染有效。然而，SA對這些抗生素迅速產(chǎn)生耐藥性，且耐青霉素金黃色葡萄球菌感染進一步發(fā)展成為難治的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)。近年來，萬古霉素雖然被認為是治療嚴重MRSA感染的標準方法，但臨床上已分離出SA對萬古霉素敏感性降低的中介耐藥株[3]，主要是廣泛報道的異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌[heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus，hVISA，最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)≤2 μg/mL]和萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,VISA，MIC 4～8 μg/mL)，或是較少見的對萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,VRSA，MIC≥16 μg/mL)?，F(xiàn)對萬古霉素在SA中耐藥性的研究進展進行綜述。

1 流行病學

1997年，日本平松啓一教授團隊首次發(fā)現(xiàn)一株對萬古霉素的敏感性降低的SA[4]，該團隊從1例接受心臟手術(shù)后胸骨切口發(fā)生化膿性感染患者的分泌物中分離培養(yǎng)出了MRSA，給予該患者萬古霉素聯(lián)合氨芐西林/舒巴坦和阿貝卡星治療后痊愈。隨后，許多國家開始篩選VISA/hVISA。Song等[5]使用瓊脂平板篩選法篩選分離了來自12個亞洲國家的1 349株MRSA，58株確認為是hVISA，發(fā)生率為4.3%；Lewis等[6]報道在2005—2007年英國血流感染的195例SA標本中檢測出hVISA發(fā)生率約為18.0%；Sun等[7]收集了來自14個城市的MRSA，在1 012株MRSA中hVISA的發(fā)生率為13%～16%。不同國家和地區(qū)分離培養(yǎng)出VISA/hVISA菌株數(shù)不同，如Mynarczyk等[8]從來自波蘭的103株SA菌株中分離VISA/hVISA，分離率為4.8%；Garnier等[9]收集法國2 300株SA菌株，其中VISA/hVISA的分離率為11.1%；Rybak等[10]對美國的356株SA菌株分離VISA/hVISA，分離率為7.6%；Casapao等[11]對美國的66株SA菌株分離VISA/hVISA，分離率為18.8%。各國家或地區(qū)的分離率不同，這些差異的主要原因可能是不同患者、不同地域和不同的檢測方法造成的。

2 VRSA和VISA的分子機制

2.1VRSA的分子機制 VRSA(MIC≥16 μg/mL)由轉(zhuǎn)座子Tn1546編碼的VanA操縱子編碼，通過保留原始的腸球菌質(zhì)粒或通過將萬古霉素耐藥腸球菌質(zhì)粒中的Tn1546轉(zhuǎn)換成葡萄球菌常駐質(zhì)粒而發(fā)揮耐藥作用[12]。

細菌細胞壁的主要成分是交聯(lián)的肽聚糖，肽聚糖主要由通過甘氨酸橋和五肽(UDP-MurNAc-L-Ala-D-iso-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala)彼此交聯(lián)的聚糖鏈N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸組成。在革蘭陽性菌中，萬古霉素通過與新合成的UDP-MurNAc-五肽的倒數(shù)第2個D-Ala-D-Ala殘基形成非共價氫鍵，抑制后期肽聚糖的合成，從而破壞下游肽聚糖組裝。所以，當給予萬古霉素治療SA感染后，萬古霉素-五肽復合物可在細胞內(nèi)形成,進而抑制細胞壁的合成，殺死細菌[13]。

VanA操縱子介導的萬古霉素耐藥主要通過兩個重要步驟：①水解與萬古霉素結(jié)合的二肽D-Ala-D-Ala肽聚糖前體；②不能結(jié)合萬古霉素的D-Ala-D-Lac肽聚糖前體的合成[14]。VanA操縱子由VanA、VanH、VanX、VanS、VanR、VanY和VanZ基因組成。VanA操縱子是通過由VanS和VanR編碼的雙重傳感器-調(diào)節(jié)子系統(tǒng)控制的，分別識別萬古霉素并激活操縱子的轉(zhuǎn)錄[15]。VanA、VanH和VanX是萬古霉素抗性表型必不可少的部分，其中，VanA和VanH負責合成縮肽D-Ala-D-Lac；VanA是催化D-Ala-D-Lac縮酚酸酯酯鍵形成的連接酶；VanH是通過還原丙酮酸鹽形成D-Lac的脫氫酶[16]；VanX是D，D-二肽酶，水解D-Ala-D-Ala酯鍵，確保減少新形成的D-Ala-D-Lac縮酚酸肽與結(jié)合UDP三聯(lián)肽聚糖前體的競爭。VanY是一種D,D-羧基肽酶，通過促進已經(jīng)附著在莖五肽結(jié)構(gòu)末端的D-Ala-D-Ala二肽的裂解來執(zhí)行類似的功能，但不是必需功能[17]。VanZ的作用尚不清楚，但它可能與SA對替考拉寧的耐藥性有關(guān)。

2.2VISA的分子機制 VISA通常與持續(xù)感染、萬古霉素治療時間延長等有關(guān)。hVISA表型是指親代SA對萬古霉素敏感(MIC≤2 μg/mL)，而子代SA可以含有少量能在萬古霉素≥4 μg/mL培養(yǎng)基中生長的耐藥亞群[18]。盡管近年來對hVISA的研究取得了一定的進展，但hVISA發(fā)展的分子機制尚未完全確定。如Roch等[19]證明，SA暴露于非糖肽類抗生素如β內(nèi)酰胺類可能會引發(fā)hVISA表型。Haaber等[20]報道USA300菌株暴露于黏菌素，增強了萬古霉素的耐藥性，證明這種現(xiàn)象是在基因表達水平上進行調(diào)節(jié)，因此是可逆的。上述研究為hVISA的發(fā)展是表觀遺傳學過程提供了證據(jù)。

目前普遍認為VISA對萬古霉素具有均一的耐藥性，VISA是由長期使用糖肽類抗生素治療的hVISA發(fā)展而來[19-20]。VISA表型的基本特征包括由差異調(diào)節(jié)的細胞壁生物合成和刺激途徑引起的細胞壁厚度增加，肽聚糖的交聯(lián)減少，與細胞壁更新相關(guān)酶的自溶活性降低，表面蛋白質(zhì)譜改變，輔助基因調(diào)節(jié)因子(agr)系統(tǒng)的功能障礙和生長特性變化[21]。近年來，已形成多種研究VISA表型的分子遺傳基礎(chǔ)的方法。Katayama等[22]通過向萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌(vancomycin susceptible S. aureus，VSSA)毒株N315的6個不同基因中引入序列突變來產(chǎn)生實驗室衍生的VISA毒株，研究發(fā)現(xiàn)VSSA菌株最有可能逐步發(fā)展成萬古霉素中介菌株，通過獲得突變且每個突變都可以降低萬古霉素的易感性。

VISA耐藥的分子機制尚不明確，但是編碼雙重調(diào)節(jié)系統(tǒng)的基因突變(如與糖肽抗性相關(guān)的graRS和walKR對VISA的耐藥性)至關(guān)重要。DNA依賴性的RNA聚合酶β亞基的基因編碼能夠通過增加細胞壁的厚度增加對萬古霉素的耐藥性[23]。graRS差異調(diào)節(jié)細胞壁生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，與在VISA表型中起作用的基因和調(diào)節(jié)子有關(guān)[24]。graRS上調(diào)生物膜合成操縱子中的基因，導致生物膜生產(chǎn)增加。兩項獨立研究發(fā)現(xiàn)，graRS中的點突變降低了對萬古霉素的易感性，此外，graRS上調(diào)dlt操縱子和mprF/fmtC基因，與磷壁酸丙氨?；图毎陔姾傻母淖冇嘘P(guān)[23-24]。graRS突變與全球調(diào)節(jié)因子阻遏毒素(rot)和agr的修飾表達有關(guān)[19,23]。在hVISA和VISA菌株中，agr功能降低，有利于萬古霉素耐藥性的發(fā)展，并有可能促進生物膜的生成，最終增加hVISA的存活率[25]。VISA分離株在vraSR基因中具有非沉默突變,這種突變可能導致下游超過40個細胞壁合成基因的上調(diào)，包括產(chǎn)生細胞壁衍生物如D-Ala-D-Ala)所需的基因[26]。walKR是與VISA表型相關(guān)的另一種雙組分基因調(diào)控系統(tǒng)，通過獲得的突變或插入IS256下調(diào)walKR操縱子導致多糖合成增加，細胞壁厚度增加，自溶減少[18,24]。另外，與VSSA菌株相比，VISA菌株可能通過使醋酸鹽的分解代謝下降，從而導致細菌的生長特性發(fā)生改變、細胞死亡改變，抗生素耐受性以及細胞間黏附的多糖合成增加[27]。產(chǎn)生萬古霉素中介表型的上述遺傳修飾可以在不同分離株之間有顯著差異，某些突變通常與特定的SA譜系有關(guān)。盡管如此，Vidaillac等[28]證明親本遺傳背景不一定能導致VISA表型的突變，而來源于相同親本分離株的平行分離株可以在各種環(huán)境壓力下獲得不同突變。Berscheid等[29]證明，VSSA菌株在體外的序列突變可產(chǎn)生萬古霉素MIC≥32 μg/mL的分離株，超過了VRSA的折點。這種機制與VanA型萬古霉素抗性相反，萬古霉素不能與修飾的D-Ala-D-Lac肽結(jié)合。hVISA/VISA分離株細胞壁更厚，肽聚糖交聯(lián)的減少和游離D-Ala-D-Ala殘基過量是在細胞壁內(nèi)作為萬古霉素的靶標；另外，結(jié)合D-Ala-D-Ala的萬古霉素在細胞壁積累，從而阻礙萬古霉素的進一步擴散[17,29]。然而，有研究表明[30]，萬古霉素耐藥水平較高的VISA菌株較不穩(wěn)定，往往恢復到與hVISA或萬古霉素耐藥性的較低水平。

3 臨床分類和治療

臨床上感染hVISA/VISA患者越來越普遍，感染后會引起萬古霉素治療的失敗。影響VISA和hVISA的臨床因素較多，其中一個重要因素是缺乏前瞻性對照研究。臨床上普遍認為SA中低水平的萬古霉素耐藥與萬古霉素治療失敗和不良的臨床結(jié)果有關(guān)。為提高hVISA/VISA檢出率，2006年，臨床實驗室標準化協(xié)會將SA對萬古霉素耐藥臨界值進行了更新，規(guī)定VISA的MIC為4～8 μg/mL，MIC≤2 μg/mL為VSSA，MIC≥16 μg/mL為VRSA[31]。臨床研究普遍認為，對于MIC>8 μg/mL的VISA感染，糖肽類抗生素的治療并不是最佳的[32]。另外，對于深部膿腫、骨髓炎和心內(nèi)膜炎等有大量hVISA感染，可考慮手術(shù)治療[32]。

達托霉素是hVISA和VISA感染的替代治療選擇，有研究指出，在體外菌株的萬古霉素高MIC值與達托霉素的非敏感性之間具有相關(guān)性[33]。由于達托霉素的殺菌活性取決于使用濃度，故需要較高劑量達托霉素MIC治療心內(nèi)膜炎和以抗微生物穿透力差為特征的感染部位的hVISA和VISA感染[34]。體外研究觀察到在模擬心內(nèi)膜贅生物中用高劑量達托霉素[10 mg/(kg·d)持續(xù)8 d]和劑量遞減[10 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d，接著6 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d方案與標準方案6 mg/(kg·d)，持續(xù)8 d]和劑量遞增[6 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d，然后10 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d]，兩種方案相比,劑量遞減方案對hVISA毒株的殺傷作用顯著增加(P<0.024)[34]。以上達托霉素給藥方法可能導致體內(nèi)菌血癥更快治愈，并防止達托霉素不敏感的情況出現(xiàn)[34]。然而，尚未發(fā)表評估高劑量達托霉素給藥劑量和適當持續(xù)時間的體內(nèi)研究。高劑量達托霉素單獨用于hVISA或VISA感染患者的作用尚不清楚。在有更多證據(jù)可供使用前，對于可能存在hVISA或VISA感染風險的患者(如高細菌負荷感染，萬古霉素治療失敗)考慮使用達托霉素時需要謹慎。

Mdicines公司開發(fā)的新型糖肽類抗菌藥物奧利萬星，對包括耐萬古霉素的葡萄球菌、腸球菌等革蘭陽性菌具有良好抗菌活性，通過多重作用機制防止耐藥性產(chǎn)生，進而減少耐藥形成[38]。

4 小 結(jié)