嗜酸乳桿菌肽聚糖的六種提取方法比較研究

楊　旭,朱靜靜,潘道東,吳　振,曾小群,孫楊贏,曹錦軒

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江寧波 315211)

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嗜酸乳桿菌肽聚糖的六種提取方法比較研究

楊旭,朱靜靜,潘道東*,吳振,曾小群,孫楊贏,曹錦軒

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江寧波 315211)

比較嗜酸乳桿菌肽聚糖的六種提取方法,得到提取肽聚糖的最適方法并對此方法下提取的肽聚糖進(jìn)行初步評價(jià)。最適提取方法步驟如下:三氯乙酸脫磷壁酸,乙醚脫脂,十二烷基磺酸鈉結(jié)合胰蛋白酶去除蛋白質(zhì),此方法下肽聚糖的平均得率為16.48%。溶菌酶實(shí)驗(yàn)及肽聚糖結(jié)構(gòu)測定結(jié)果顯示提取的肽聚糖為高純度肽聚糖且電鏡下成片狀,并保持完整的菌體形態(tài)。氨基酸分析結(jié)果表明肽聚糖的主要氨基酸組成為丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和亮氨酸,為肽聚糖免疫效應(yīng)的研究提供了理論基礎(chǔ)。

肽聚糖,嗜酸乳桿菌,提取方法,結(jié)構(gòu)測定

肽聚糖(Peptidoglycan,PG)又稱粘肽,是細(xì)菌細(xì)胞壁的特有組成部分,是由肽聚糖單體重復(fù)排列的復(fù)雜的大分子聚合物。每個(gè)肽聚糖單體由聚糖和肽組成,其中肽包括四肽鏈和肽間橋兩部分;聚糖由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-(1,4)糖苷鍵連接而成[1]。大量研究表明,肽聚糖具有抗癌活性,可以提高機(jī)體非特異性免疫,是一種無毒性的非特異性免疫增強(qiáng)劑[2-6]。高純度的肽聚糖有利于其免疫特性的研究及免疫效應(yīng)的發(fā)揮,因此,要提取高純度的肽聚糖,就需要去除乳酸菌細(xì)胞壁中蛋白質(zhì),脂類和磷壁酸等成分[7]。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)是第三代發(fā)酵劑,可以在腸道中定植抑菌,改善腸道微生物菌群的平衡,提高機(jī)體免疫及抑制腫瘤形成[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究也表明,嗜酸乳桿菌肽聚糖可以抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[10-11]。但現(xiàn)有的關(guān)于肽聚糖提取的研究主要集中于雙歧桿菌,并未對提取效果及肽聚糖的產(chǎn)量和純度進(jìn)行評價(jià)和分析。目前,關(guān)于嗜酸乳桿菌肽聚糖提取的報(bào)道較少,更缺乏有效提取高純度肽聚糖的方法。本研究以嗜酸乳桿菌ATCC4356為模式菌株,比較了六種提取肽聚糖的方法,以獲得有效的提取高純度肽聚糖的方法,為肽聚糖提取的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

嗜酸乳桿菌ATCC4356本實(shí)驗(yàn)室保存;MRS肉湯培養(yǎng)基杭州生物試劑公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)(化學(xué)純)、三氯乙酸(TCA)(分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶(Trypsin>250N·F·U·mg-1)Solarbio;乙醚(分析純)杭州高晶精細(xì)化工有限公司。

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;H2500R-2高速冷凍離心機(jī)、H-2050R高速冷凍離心機(jī)長沙湘儀;Infinite200pro酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司; Nicolet6700傅里葉變換紅外FT-IR光譜儀美國Thermo公司;A200氨基酸自動(dòng)分析儀德國安米諾西斯。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌體的收集將-20 ℃保存的嗜酸乳桿菌菌液按2%接種量于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化,將活化后的菌種按2%接種量,加入新鮮MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h,水浴煮沸10 min,以防止肽聚糖自溶,4000 r·min-1離心15 min,收集菌體沉淀,用滅菌生理鹽水洗滌3次,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2肽聚糖的提取方法根據(jù)國內(nèi)外已報(bào)道的肽聚糖的幾種提取方法[12-15]加以總結(jié)與調(diào)整,得出六種提取方法,具體如下:A:SDS→Trypsin→TCA→乙醚,B:TCA→乙醚→SDS→Trypsin,C:TCA→SDS→乙醚→Trypsin,D:SDS→TCA→Trypsin→乙醚,E:SDS→TCA→乙醚→Trypsin,F:TCA→SDS→Trypsin→乙醚。

上述提取方法中各試劑的作用分別為:SDS:常用的離子型表面活性劑,不僅可以使細(xì)胞膜破裂,與膜蛋白的疏水部分結(jié)合使其分離,而且還能破壞膜蛋白內(nèi)部的非共價(jià)鍵,使蛋白變性,采用濃度為5%,沸水浴30 min,室溫下 10000 r·min-1離心15 min,熱蒸餾水洗至無SDS,取沉淀;TCA:蛋白質(zhì)沉淀劑及磷壁酸提取劑,采用濃度10%,沸水浴25 min,快速冷卻后4 ℃ 10000 r·min-1離心15 min,取沉淀;Trypsin:采用濃度為2 mg·mL-1的Trypsin在Tris-HCl緩沖體系(pH7.8)中水解16 h,4 ℃ 10000 r· min-1離心15 min,取沉淀;乙醚:相似相溶的原理進(jìn)行脫脂,采用濃度50%,作用時(shí)間20 h,4 ℃ 10000 r· min-1離心15 min,并依次用75%乙醇、50%乙醇、蒸餾水洗滌,離心取沉淀。

1.2.3提取的肽聚糖各指標(biāo)的測定方法

1.2.3.1蛋白質(zhì)含量的測定參照孟凡倫等[14]的方法并加以修改,分別稱取1 mg上述六種方法提取的肽聚糖樣品溶于1 mL 0.15 mol·L-1的NaOH中,37 ℃水解1 h,4 ℃ 8000 r· min-1離心15 min取上清,用Bradford法[16]測蛋白質(zhì)含量。

1.2.3.2總糖含量的測定參照國標(biāo)GB/T 15672-2009食用菌中總糖含量的測定,用苯酚-硫酸法測定肽聚糖總糖含量。

1.2.3.3氨基己糖含量的測定肽聚糖是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞酸兩種氨基糖經(jīng)β-1,4糖苷鍵連接間隔排列形成的多糖支架[1]。參照張世民等[17]的方法并加以調(diào)整。分別取0.1 mg·mL-1的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL以及提取的肽聚糖1 mL置于帶塞試管中,加蒸餾水補(bǔ)至1 mL,以蒸餾水為空白對照,各加入乙酰丙酮0.5 mL,混勻后依次于沸水中水浴25 min,冰浴5 min,再加入無水乙醇1 mL,對二甲氨基苯甲醛0.5 mL,充分混勻后25 ℃水浴1 h,于530 nm測定吸光度,計(jì)算氨基己糖的含量。

1.2.3.4肽聚糖得率的測定分別測定上述六種方法提取的肽聚糖的質(zhì)量和提取前菌體的質(zhì)量,根據(jù)以下公式計(jì)算肽聚糖得率。

肽聚糖得率(%)=(提取的肽聚糖的質(zhì)量/提取前菌體質(zhì)量)×100

1.2.3.5溶菌酶酶解實(shí)驗(yàn)參考馬西藝等[15]在肽聚糖研究中使用的方法。溶菌酶可以定向的水解β-1,4糖苷鍵,降低肽聚糖的分子量,從而降低吸光度。將上述六種方法提取的肽聚糖配制成相同的濃度,經(jīng)溶菌酶酶解后,通過吸光度的測定可知提取肽聚糖純度。用pH6.2的磷酸緩沖液將肽聚糖配制1 mg·mL-1的溶液,加溶菌酶使其終濃度為200 μg·mL-1,搖床于37 ℃,120 r·min-1振搖13 h,在不同時(shí)間點(diǎn)測定450 nm處吸光值的變化。

1.3最適提取方法獲得的肽聚糖的結(jié)構(gòu)測定

1.3.1紅外光譜分析取1 mg肽聚糖,用100 mg KBr壓片,用傅立葉變換紅外光譜分析儀進(jìn)行光譜掃描,波長掃描范圍為400～4000 cm-1,分析圖譜。

1.3.2紫外光譜分析取肽聚糖1 mg于100 mL純水中,混勻后用酶標(biāo)儀在波長190～400 nm下進(jìn)行光譜掃描,掃描間距2 nm,觀察圖譜。

1.3.3肽聚糖經(jīng)溶菌酶溶解后分子量測定用pH6.5的磷酸鹽緩沖液將肽聚糖配制成1 mg·mL-1的溶液,加溶菌酶使其終濃度為200 μg·mL-1,搖床于37 ℃,120 r·min-1處理10 h,離心機(jī)于4 ℃ 8000 r·min-1離心15 min后取上清,在垂直板電泳槽中進(jìn)行不連續(xù)電泳。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%,濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%,1×Tris-tricine-SDS緩沖液。上樣緩沖液與樣品按1∶4混合,煮沸5 min后上樣。80V電泳至濃縮膠與分離膠交界處后,增大電壓至150 V至距凝膠底部0.5～1 cm左右停止。

1.3.4肽聚糖掃描電鏡觀察采用2.5%的戊二醛將肽聚糖固定后梯度脫水,表面鍍金后用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.3.5氨基酸組成及含量分析在110 ℃真空下,使用6 mol·L-1的HCl對肽聚糖樣品進(jìn)行水解,24 h后,用氨基酸自動(dòng)分析儀測定。

2　結(jié)果與分析

2.1肽聚糖各提取方法相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果

圖1　六種方法提取的肽聚糖各指標(biāo)測定結(jié)果Fig.1　The results of different detection indexes for six extraction methods of peptidoglycan注:Ⅰ:蛋白質(zhì)含量測定；Ⅱ:總糖含量測定；Ⅲ:氨基己糖含量測定；Ⅳ:肽聚糖得率；A:SDS→Trypsin→TCA→乙醚；B:TCA→乙醚→SDS→Trypsin；C:TCA→SDS→乙醚→Trypsin；D:SDS→TCA→Trypsin→乙醚；E:SDS→TCA→乙醚→Trypsin；F:TCA→SDS→Trypsin→乙醚；不同字母代表差異顯著,p<0.05。

2.1.1蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:y=0.00364x+0.2722,其決定系數(shù)R2=0.9966。如圖1(Ⅰ)所示,根據(jù)不同提取方法下肽聚糖蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果可以看出:在六種提取方法中,B、C兩種方法下所得的肽聚糖中蛋白質(zhì)含量低,提取方法較好,但B方法先用TCA去除磷壁酸的方法較先用SDS沉淀蛋白,所提取物中蛋白質(zhì)含量更低,表明其可以更好的除去菌體蛋白。

磷壁酸按其在細(xì)胞表面固定的方式可以分為脂磷壁酸和壁磷壁酸兩種。其中壁磷壁酸不深入質(zhì)膜,其末端以磷酸二酯鍵與肽聚糖的N-乙酰胞壁酸殘基連結(jié);而脂磷壁酸可跨越肽聚糖層,其末端以磷酸共價(jià)連接于質(zhì)膜中糖脂的寡糖基部分[18]。TCA去除磷壁酸后,增加了菌體細(xì)胞的通透性,使得內(nèi)容物流出,可以更好的去除肽聚糖之外的其他雜質(zhì)。

2.1.2總糖含量的測定結(jié)果總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:y=0.0101x+0.1155,其決定系數(shù)R2=0.9982。根據(jù)苯酚-硫酸法測定六種提取方法得到的肽聚糖中總糖含量如圖1(Ⅱ)所示,B、F兩種提取方法得到的總糖含量較其他方法高,且差異顯著,表明B、F兩種提取方法得到的肽聚糖純度較高。

2.1.3氨基己糖含量的測定結(jié)果氨基己糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:y=0.0092x+0.0859,其決定系數(shù)R2=0.9971。六種提取方法得到的肽聚糖中氨基己糖含量如圖1(Ⅲ)所示,提取方法B得到的氨基己糖含量最高,且和其他五種提取方法得到的氨基己糖含量之間存在顯著差異,表明采用提取方法B可以獲得較好的提取效果。作為由雙糖單位,四肽尾,還有肽橋聚合而成的大分子的肽聚糖,氨基己糖的測定可以作為評價(jià)肽聚糖的有效的指標(biāo)。

2.1.4肽聚糖含量的測定結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用相同質(zhì)量的菌體去磷壁酸,去脂,去蛋白得到產(chǎn)物肽聚糖,因此去除雜質(zhì)效果最好的方法即為最適提取肽聚糖的方法。如圖1(Ⅳ)所示,提取方法B的肽聚糖得率雖然低于提取方法C的得率,但是兩種提取方法得到的肽聚糖得率無顯著差異。這表明B、C兩種提取方法均可以達(dá)到較好的去雜效果。此外,在脫磷壁酸后,脫脂和脫蛋白的先后對產(chǎn)量的影響不存在顯著的差異,表明先采用脫磷壁酸方法對提取肽聚糖起著關(guān)鍵性的作用。

2.1.5溶菌酶溶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,經(jīng)溶菌酶的作用后,六種提取方法所得肽聚糖的吸光值均下降,表明提取的肽聚糖均可以被溶菌酶降解,從而驗(yàn)證六種提取方法下獲得的產(chǎn)物均為肽聚糖。提取方法B得到的肽聚糖達(dá)到的酶解終點(diǎn),其OD值穩(wěn)定,吸光值最小,表明提取方法B獲得的肽聚糖純度最高,效果最好。

圖2　六種提取方法所得肽聚糖的溶菌酶溶解曲線Fig.2　The digestion curves of PG degraded by Lysozyme of six extraction methods

綜上所述,最好的提取方法為B:TCA→乙醚→SDS→Trypsin,即先用TCA脫磷壁酸,再用乙醚脫脂,最后SDS結(jié)合胰蛋白酶去蛋白的方法提取的肽聚糖純度最高。因?yàn)榱妆谒峥纱┩负竦碾木厶菍?跨越質(zhì)膜,脫除磷壁酸等于在細(xì)胞壁上開孔,在保證菌體形態(tài)的同時(shí),可以使內(nèi)容物流出,乙醚脫脂更增大了細(xì)胞壁的通透性,加速上述行為的發(fā)生,利于后續(xù)菌體蛋白的去除,得到高純度的肽聚糖。此方法下肽聚糖得率為16.48%,凍干后肽聚糖為白色絮狀物。

2.2最適提取方法所得肽聚糖結(jié)構(gòu)測定結(jié)果

2.2.1肽聚糖紅外光譜分析結(jié)果肽聚糖的紅外光譜圖如圖3所示,所提取的肽聚糖在3406 cm-1有峰,表明此處有-OH的伸縮振動(dòng),3300 cm-1有峰表明此處有-CH基團(tuán)的伸縮振動(dòng),2930 cm-1處有峰,表明此處有亞甲基-CH2反對稱伸縮。三處的峰均為糖類物質(zhì)的特征吸收峰。此外,1650 cm-1有峰,為酰胺特征吸收峰,1540 cm-1處的峰為N-H彎曲以及C=N伸縮振動(dòng)峰,1392 cm-1處的峰來自對稱甲基的變形振動(dòng)。1234 cm-1的峰值為C-O單鍵的伸縮振動(dòng),也為糖類的特征吸收峰。1063 cm-1處的吸收峰為C-O-C的伸縮振動(dòng)峰,可能說明N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-(1,4)糖苷鍵連接[19-20]。紅外光譜顯示上述峰均為肽聚糖的吸收峰,無其他明顯的雜峰出現(xiàn),表明提取的物質(zhì)為高純度肽聚糖。

圖3　肽聚糖紅外光譜分析Fig.3　The FITR spectral analysis of PG

2.2.2肽聚糖紫外光譜分析結(jié)果肽聚糖的紫外光譜分析見圖4,肽聚糖在258 nm和280 nm處均無明顯的吸收峰,表明采用此方法提取肽聚糖,除蛋白和核酸的效果較好,同時(shí)也表明,采用TCA結(jié)合SDS的方法可以達(dá)到好的除雜的效果。

圖4　肽聚糖紫外光譜分析Fig.4　The UV spectral analysis of PG

2.2.3肽聚糖經(jīng)溶菌酶酶解產(chǎn)物分子量測定結(jié)果肽聚糖經(jīng)溶菌酶酶解后分子量測定如圖5所示,提取的肽聚糖經(jīng)SDS-PAGE在10 ku處有明顯的單一條帶,表明提取的嗜酸乳桿菌肽聚糖純度高,其經(jīng)溶菌酶酶解后產(chǎn)物分子量約為10 ku。

圖5　肽聚糖經(jīng)溶菌酶酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig.5　The SDS-PAGE of PG dissolved by lysozyme注:M通道為marker,1、2通道為樣品。

2.2.4肽聚糖掃描電鏡結(jié)果肽聚糖掃描電鏡如圖6所示,提取后的肽聚糖掃描電鏡下觀察成片狀,而且基本呈現(xiàn)了完整的細(xì)胞形態(tài),說明通過此方法可以提取完整形態(tài)的肽聚糖。肽聚糖結(jié)構(gòu)的完整可使其保持全菌的一些重要的生物學(xué)特征,并且和細(xì)胞功能有密切的關(guān)系,完整肽聚糖功能的研究可為菌體在機(jī)體的免疫作用的研究奠定基礎(chǔ)。

圖6　肽聚糖掃描電鏡圖(10000×)Fig.6　SEM analysis of PG(10000×)

2.2.5氨基酸組成及含量分析結(jié)果氨基酸自動(dòng)分析儀分析結(jié)果見表1,從表中可以看出,嗜酸乳桿菌肽聚糖共含有17種氨基酸,其中含量較高的五種分別是丙氨酸,谷氨酸,賴氨酸,天冬氨酸和亮氨酸。其含量(μmol·g-1)比為丙氨酸∶谷氨酸∶賴氨酸∶天冬氨酸∶亮氨酸=5.2∶3.08∶2.66∶2.32∶1。這五種氨基酸可能組成了連接在N-乙酰胞壁酸3號碳原子上的短肽及肽橋。研究發(fā)現(xiàn),肽聚糖免疫效應(yīng)的產(chǎn)生(如NOD1通道的激活)可能與肽聚糖肽鏈上第三個(gè)氨基酸以及肽橋的交聯(lián)結(jié)構(gòu)有關(guān)[21]。肽聚糖氨基酸成分及含量的測定可以為嗜酸乳桿菌肽聚糖免疫活性的研究提供理論基礎(chǔ)。

表1　嗜酸乳桿菌肽聚糖氨基酸組成及含量Table 1　The compositions and contents of amino acids of PG

3　討論與結(jié)論

肽聚糖能增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫作用,被應(yīng)用于水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖,提高動(dòng)物的免疫力[22-23],其產(chǎn)品可以代替抗生素,為解決抗生素濫用問題找到了新的突破口,具有廣闊的應(yīng)用前景,故有效提取高純度肽聚糖方法具有重要意義。目前提取肽聚糖的方法大多從Sekine等人[12]建立的方法衍生而來,提取方法各異,未對提取的效果和肽聚糖的純度進(jìn)行檢測,尚缺乏有效的提取高純度肽聚糖的方法,使得肽聚糖仍停留于實(shí)驗(yàn)室的研究,未能進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。本研究根據(jù)現(xiàn)報(bào)道的肽聚糖的提取方法加以總結(jié)及調(diào)整,得出六種提取方法并進(jìn)行了比較研究,得到了有效提取高純度肽聚糖的方法。即先用TCA去除磷壁酸,再用乙醚脫脂,最后用SDS結(jié)合胰蛋白酶去蛋白。其肽聚糖得率為16.48%,高于前期研究[24-25],并且肽聚糖的純度高,紫外掃描也顯示無核酸吸收,紅外光譜顯示提取物為高純度肽聚糖。其主氨基酸組成有五種,分別為丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、亮氨酸,它們組成了連接在N-乙酰胞壁酸3號碳原子上的短肽及肽橋。所得的肽聚糖成品為白色絮狀物質(zhì),掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)為片狀,并保持細(xì)胞原有的形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)獲得了有效提取高純度肽聚糖的方法,為解決肽聚糖研究和應(yīng)用的瓶頸問題提供研究基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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[24]劉景圣,蔡丹,孫濤,等. 嗜酸乳桿菌細(xì)胞壁肽聚糖的分離提取[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(4):605-609.

[25]朱麗,韓德權(quán),張家玲,等. 植物乳桿菌細(xì)胞壁肽聚糖的分離及鑒定[J]. 黑龍江大學(xué)：自然科學(xué)學(xué)報(bào),2011,28(1):113-120.

Comparison of six extraction methods of peptidoglycan inLactobacillusacidophilus

YANG Xu,ZHU Jing-jing,PAN Dao-dong*,WU Zhen,ZENG Xiao-qun,SUN Yang-ying,CAO Jin-xuan

(Department of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Six extraction methods of peptidoglycan ofLactobacillusacidophiluswere compared and analyzed to get the optimal method,and its product was primarily evaluated. The steps of the optimal extraction way of peptidoglycan were as follows:the phosphate wall acid was removed with trichloroacetic acid(TCA),then the fat was skimmed with ether,finally,protein was removed with sodium dodecylsulphate(SDS)and trypsin.Under the method,the average extraction output was 16.48%.The results of structure determination and the experiment of lysozyme solution showed that the extracted peptidoglycan was pure. Under scanning electron microscopy(SEM),the peptidoglycan was schistose and maintained complete cell morphology ofLactobacillusacidophilus. Amino acid analysis suggested that alanine(Ala)and glutamic acid(Glu),lysine(Lys),aspartic acid(Asp)and leucine(Leu)were the principal amino acid components of peptidoglycan and the result would provide a theoretical basis for the study on the immune effect of peptidoglycan.

peptidoglycan;Lactobacillusacidophilus;extraction methods;structure determination

2016-01-12

楊旭(1989-)，男，碩士，研究方向：乳品微生物，E-mail:yangxu12598@163.com。

潘道東(1964-)，男，博士，教授，研究方向：乳品科學(xué)及禽肉加工技術(shù)研究，E-mail:daodongpan@163.com。

國家自然科學(xué)基金(41276121、31471598)；寧波市重大攻關(guān)項(xiàng)目(2011C11017)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0066-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.004