貴長獼猴桃莖段高效再生體系的建立

趙許朋 劉勇 魏加練

摘要：以貴長獼猴桃莖段為外植體，研究不同激素組合培養(yǎng)基對愈傷組織誘導、不定芽分化增殖、無菌苗生根等的影響。結果表明，貴長獼猴桃莖段在MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上愈傷組織誘導率相對最高，達100.0%，且愈傷組織生長狀況相對較好，質地最優(yōu)，呈黃白色濕潤致密狀，在MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上不定芽出芽率相對最高，達83.33%，在MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上不定芽增殖率相對最高，達100%，繼代培養(yǎng)6代時的平均繁殖系數(shù)達6.48;不定芽在含IBA 0.6 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根率相對最高，達到95.83%，且形成龐大的根系，50株試管苗經煉苗移栽成活率可達96.0%。

關鍵詞：貴長獼猴桃;莖段;增殖;植株再生

中圖分類號： S663.404+.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0043-04

獼猴桃為獼猴桃科獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）多年生藤本果樹，雌雄異株，在我國發(fā)現(xiàn)最早，其種群數(shù)量、分布范圍均為世界之首，有“獼猴桃故鄉(xiāng)”之稱[1]。獼猴桃果實中含有豐富的維生素C、多種礦物質及膳食纖維，素有“水果之王”的美譽[2]。貴長獼猴桃為貴州省選育的中華獼猴桃優(yōu)良品種[3]，被國家質檢總局認定為國家地理標志保護產品[4]，具有十分廣闊的研究和應用前景。自貴長獼猴桃出現(xiàn)伊始，學者們主要對其病害防治、生理特性、保鮮等方面[5-7]開展研究，而有關其組織培養(yǎng)離體再生的研究幾無報道。

組織培養(yǎng)是一項通過無性繁殖方式快速再生植株的生物技術，其育苗效率高于扦插嫁接等傳統(tǒng)繁殖手段，且具有保持母本優(yōu)良性狀、克服有性繁殖造成品種退化的優(yōu)勢[8-11]。組織培養(yǎng)技術是品種遺傳改良和遺傳轉化等技術的基礎，從20世紀70年代開始，組織培養(yǎng)技術育苗已成為獼猴桃良種繁育的重要方法[12-13]。本研究以貴長獼猴桃幼嫩莖段為外植體，通過組織培養(yǎng)對其愈傷組織誘導、愈傷組織分化不定芽、無菌苗生根等進行研究，以建立貴長獼猴桃莖段高效再生體系，為其快速繁殖和遺傳轉化研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 枝條采集與消毒處理

于貴州省修文縣谷堡鄉(xiāng)獼猴桃基地采集貴長獼猴桃（Actinidia chinensis cv. Guichang）幼嫩枝條，洗凈，短截成長約3 cm的無腋芽莖段;75%乙醇消毒處理40 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）消毒處理9 min;用無菌水沖洗3～4次，切成長為0.5～1.0 cm的莖段。

1.2 愈傷組織的誘導

將消毒處理的莖段作為外植體，接種到以MS為基礎培養(yǎng)基，含2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）質量濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg/L、6-芐氨基嘌呤（6-BA）質量濃度分別為02、0.4 mg/L 不同激素組合的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1周、光照培養(yǎng)3周，每處理接種莖段24個，重復3次，處理編號依次為A1～A6（表1）;調查愈傷組織生長狀況，統(tǒng)計愈傷組織誘導率。

1.3 不定芽的誘導與增殖

1.3.1 不定芽的誘導 挑選質地致密、生長旺盛的愈傷組織，接種到以MS為基礎培養(yǎng)基，含6-BA質量濃度分別為4.0、5.0、6.0 mg/L、萘乙酸（NAA）質量濃度分別為0.2、0.3 mg/L 不同激素組合的不定芽誘導培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1周、光照培養(yǎng)8周，每處理接種愈傷組織24個，重復3次，處理編號依次為B1～B6（表2）;調查統(tǒng)計不定芽誘導情況。

1.3.2 不定芽的增殖 取長1 cm左右的不定芽，接種到以MS為基礎培養(yǎng)基，含6-BA質量濃度分別為2.0、3.0、4.0 mg/L、NAA質量濃度分別為0.5、1.0 mg/L、赤霉素（GA3）質量濃度為 0.4 mg/L 不同激素組合的不定芽增殖培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)3周，每處理接種不定芽24個，重復3次，處理編號依次為 C1～C6（表3）;連續(xù)繼代培養(yǎng)6代，調查統(tǒng)計不定芽繁殖情況。

1.4 不定芽生根與試管苗移栽

切取長約3 cm的不定芽，接種到含吲哚丁酸（IBA）質量濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的1/2 MS固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)2周，每處理接種不定芽24個，重復3次，處理編號依次為D1～D6（表4）;調查統(tǒng)計不定芽生根率和不定根數(shù)量。將生根情況較好的帶根苗轉入以珍珠巖為基質的1/2 MS培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)2周，檢查根系發(fā)育狀況;打開50株組培苗的瓶蓋進行煉苗1周，洗凈根系，移栽至裝有珍珠巖、田間土壤比例為1 ∶ 4的營養(yǎng)缽中培養(yǎng)2周，每天適量澆水;統(tǒng)計移栽成活率。

1.5 組織培養(yǎng)條件

試驗在無菌條件下進行，培養(yǎng)基中同時加蔗糖、瓊脂粉分別為30、8 g/L，pH值為5.85。組織培養(yǎng)環(huán)境條件溫度為 （25±2） ℃，光照度4 500 lx、光照周期為16 h/d。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同激素組合對貴長獼猴桃莖段愈傷組織誘導的影響

試驗結果表明，接種后1周，莖段始膨大萌動，接種后2周左右分化出愈傷組織（圖1-1），接種后4周莖段愈傷組織誘導率達到最大。由表1可見，處理A6的愈傷組織誘導率相對最低，為80.2%，處理A1、A4、A5的愈傷組織誘導率最高，高達100.0%，顯著高于其他3個處理（P<0.05），其中，愈傷組織在A5培養(yǎng)基上生長狀況相對較好，質地最優(yōu)，呈黃白色濕潤致密狀。因此，貴長獼猴桃莖段愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為A5，即MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

2.2 不同激素組合對貴長獼猴桃不定芽誘導與增殖的影響

2.2.1 不定芽的誘導 由表2、圖1-2、圖1-3可見，組織培養(yǎng)2周，愈傷組織開始變綠;組織培養(yǎng)7周，處理B2、B5培養(yǎng)基上最先分化出不定芽;組織培養(yǎng)9周，不定芽分化基本穩(wěn)定，處理B2的不定芽出芽率相對最高，達83.33%，顯著高于其他5個處理（P<0.05），分化出的不定芽有明顯的莖、葉分化，長勢良好，其形成的平均芽數(shù)也相對最高，為7.0個，與處理B5差異不顯著（P>0.05），顯著高于其他4個處理，平均芽長為1.7 cm，略短于B5培養(yǎng)基，且相互間差異不顯著。因此，貴長獼猴桃不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基為B2培養(yǎng)基，即 MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

2.2.2 不定芽的增殖 由表3、圖1-4可見，接種不定芽培養(yǎng)1周，腋芽開始萌動，2周左右有新的不定芽增殖;處理C2、C3的增殖效果相對最好，增殖率達100.00%，處理C1的增殖效果相對最差，增殖率為87.50%，顯著低于其他5個處理（P<0.05），說明貴長獼猴桃在一定濃度的6-BA、NAA、GA3刺激下，較易發(fā)生增殖現(xiàn)象，且增殖效果良好;培養(yǎng)后6周，新生芽出現(xiàn)簇生狀;不定芽處理C3培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)6代，其平均繁殖系數(shù)相對最高，達到6.48，顯著高于其他5個處理，且不定芽生長旺盛。因此，貴長獼猴桃不定芽最佳增殖培養(yǎng)基為C3培養(yǎng)基，即MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

2.3 IBA不同濃度對貴長獼猴桃不定芽生根的影響及煉苗移栽

由表4可見，接種后1周開始萌生不定根，處理D4培養(yǎng)基的生根率相對最高，為95.83%，與處理D3、D5差異不顯著（P>0.05），顯著高于其他3個處理（P<0.05），其平均生根數(shù)相對最多，為4.04條，顯著高于其他5個處理，其根平均長度相對較長，為0.52 cm，顯著低于處理D3，顯著高于其他4個處理。將處理D4的生根不定芽轉入含1/2 MS液體培養(yǎng)基的珍珠巖基質中進行根系增殖，結果顯示，無菌苗生長旺盛，根的長度增長、數(shù)量明顯增加，且有側根增生，培養(yǎng)2周左右時形成龐大的根系，有利于試管苗移栽成活（圖1-5）。50株試管苗煉苗移栽成活48株，成活率達到96.0%，且生長良好（圖1-6）。因此，貴長獼猴桃不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

3 結論與討論

獼猴桃組織培養(yǎng)是學者們研究的一個熱點，具有十分廣闊的應用前景。本試驗研究貴長獼猴桃莖段組織培養(yǎng)離體再生時發(fā)現(xiàn)，莖段在MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+ 蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上愈傷組織誘導率相對最高，達100.0%，且誘導出的愈傷組織生長良好，與Kim等的研究結果[14-15]一致。

愈傷組織分化成不定芽是組織培養(yǎng)的一個關鍵點，更是一個難點，有些植物因無法從愈傷組織分化成不定芽而阻礙了其再生體系的建立[16]。在獼猴桃組織培養(yǎng)過程中，常用的植物生長調節(jié)劑有玉米素（ZT）和6-芐氨基嘌呤（6-BA），且ZT效果要優(yōu)于6-BA[17-18]，但是，玉米素價格昂貴，必然會明顯增加組織培養(yǎng)的成本，而目前有6-BA代替玉米素完成獼猴桃愈傷組織分化不定芽過程的研究報道[19-20]。本試驗在誘導愈傷組織形成不定芽時采用6-BA與NAA配合使用，取得了良好的效果，不定芽出芽率高達83.33%，平均出芽數(shù)可達到7.0個，與隆前進等的研究結果[21-22]吻合。須說明的是，本研究中，不同激素配比雖然能夠誘導產生不定芽，但有的激素組合會導致不定芽頂芽萎縮、葉片膨大形成畸形苗且發(fā)育較差等現(xiàn)象產生。

對不定芽進行增殖培養(yǎng)以產生新的不定芽，這是提高試管苗數(shù)量的基礎。在研究不定芽增殖過程中，學者們多對不定芽的第1代增殖系數(shù)進行研究[9，12，23-24]，鮮見對不定芽連續(xù)繼代培養(yǎng)的研究[1]。嚴姜黎等分別對紅肉獼猴桃、紅陽獼猴桃、美味獼猴桃不定芽1代增殖培養(yǎng)進行研究，結果表明，其增殖系數(shù)分別為3.7、5.2、4.8[12，21，23]。本研究對貴長獼猴桃不定芽繼代培養(yǎng)1～6代增殖系數(shù)進行研究，結果表明，不定芽在MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)可獲得較高的增殖系數(shù)，達到6.48，且各代不定芽增殖系數(shù)相對穩(wěn)定。

不定芽生根培養(yǎng)是形成離體再生植株的一個重要環(huán)節(jié)，生根的數(shù)量和質量決定煉苗移栽的成活率[25-27]。本研究將不定芽在含IBA的1/2MS固體培養(yǎng)基上刺激生根，再轉入以珍珠巖為基質的1/2 MS壯根培養(yǎng)基上進行生根，取得了良好的生根效果，經過增殖培養(yǎng)，無菌苗根的長度延長、數(shù)量明顯增加，且伴有側根的增殖，2周左右形成龐大的根系，同時，將其煉苗移栽至裝有珍珠巖、田間土壤比例為1 ∶ 4的營養(yǎng)缽中，移栽成活率達到96.0%。

本研究以2，4-D、6-BA、NAA、GA3等為生長調節(jié)劑，形成了貴長獼猴桃莖段的高效再生體系，為貴長獼猴桃試管苗的工廠化生產和基因工程育種打下了基礎。

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