淺談異分化在放射誘導(dǎo)肺纖維化中的作用*

[河南省人民醫(yī)院（河南大學(xué)人民醫(yī)院） 腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450003]

放射性肺纖維化成為胸部放射治療后的嚴(yán)重并發(fā)癥，因其機(jī)制不明，無(wú)早期診斷指南，也無(wú)有效標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，最終導(dǎo)致呼吸衰竭。基于國(guó)內(nèi)外對(duì)放射性肺纖維化機(jī)制的多種假說(shuō)，本課題組提出Ⅱ型肺泡干細(xì)胞在放射誘導(dǎo)下異分化為肌成纖維細(xì)胞，通過(guò)復(fù)制放射性肺纖維化小鼠模型，運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期進(jìn)一步明確肺纖維化的可能機(jī)制，為纖維化的診療奠定基礎(chǔ)。

1 放射治療的機(jī)制

放射治療是指用離子射線治療惡性腫瘤（有時(shí)也可治療良性病變）的臨床策略，其射線種類有α射線（氦原子核）、β（電子）、X/γ射線（光子）及質(zhì)子。目前，用于腫瘤治療的離子射線主要是X射線或γ射線。質(zhì)子治療儀因價(jià)格昂貴和治療費(fèi)用高而較少在臨床使用。這些射線可將能量直接作用于生物大分子上，引起生物大分子電離和激發(fā)；也可先作用于水，使水分子產(chǎn)生一系列輻射分解產(chǎn)物（OH、H、e-、H2及H2O2等氧化物），再作用于生物大分子，這些都能導(dǎo)致機(jī)體的核酸、蛋白質(zhì)及酶類分子結(jié)構(gòu)改變和活性喪失，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，起到治療作用[1]。但射線同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織造成損傷，在肺組織中，不同類型細(xì)胞對(duì)射線的敏感性存在差異，以肺上皮細(xì)胞最為敏感。

2 肺上皮細(xì)胞修復(fù)

肺組織可分為實(shí)質(zhì)和間質(zhì)兩部分：實(shí)質(zhì)即肺內(nèi)支氣管各級(jí)分支及其終末的大量肺泡；間質(zhì)包括肺內(nèi)結(jié)締組織及其中的血管、淋巴管及神經(jīng)。肺泡是支氣管樹(shù)的終末部分，肺泡璧由單層肺泡上皮組成，肺泡上皮主要為I型和Ⅱ型上皮細(xì)胞。I型細(xì)胞負(fù)責(zé)氣體交換及調(diào)節(jié)肺泡中液體穩(wěn)態(tài)，占肺泡表面積的95%；另外5%則是Ⅱ型肺泡細(xì)胞，其作用是通過(guò)分泌表面活性物質(zhì)來(lái)維持穩(wěn)定肺泡大小與結(jié)構(gòu)。因肺與外界相通，極易受到外部有害物質(zhì)的損傷，如氧化應(yīng)激和毒性損傷。而I型細(xì)胞是終末細(xì)胞，不具有分裂增殖能力，其損傷丟失可依賴Ⅱ型上皮細(xì)胞的分化、分裂獲得修復(fù)補(bǔ)充[2]。因此，肺Ⅱ型細(xì)胞被公認(rèn)為肺上皮成體干細(xì)胞（adult stem cells,ASC）[3]。此外，肺細(xì)支氣管上皮層內(nèi)也含有可分裂、分化為細(xì)支氣管上皮的成體干細(xì)胞，即Clare細(xì)胞。

3 ASC 及其微環(huán)境

干細(xì)胞的微環(huán)境對(duì)保留干細(xì)胞未分化狀態(tài)具有重要意義。THOMSON等[4]于1998年從囊胚階段的小鼠胚胎中分離出胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell,ESC），在組織培養(yǎng)中無(wú)限增殖并不喪失多能性的潛能。然而在體外組織培養(yǎng)時(shí)，ESC釋放潘多拉盒子的分化程序，形成丑陋的多細(xì)胞腫塊，稱為畸胎瘤。與此相反，MARTIN[5]在70年代將ESC注射到小鼠胚泡中心，類似于天然生態(tài)位，ESC恢復(fù)正常使命，并有利于ESC產(chǎn)生正常的組織后代。因此，干細(xì)胞內(nèi)在分化表型特征由其微環(huán)境決定。成體干細(xì)胞也同樣依賴其微環(huán)境，卵巢生殖干細(xì)胞微環(huán)境是一種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，能誘導(dǎo)成體干細(xì)胞分化為卵泡細(xì)胞，使相對(duì)早期階段的異位卵泡祖細(xì)胞去分化[6]。最近的研究表明，這些微環(huán)境提供其擴(kuò)散、分化或保持休眠的信號(hào)[7]。細(xì)胞的相互作用是通過(guò)粘附或間隙連接調(diào)節(jié)ASC保留和分布[8]；細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc,ECM）組成三維細(xì)胞外網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)形成保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)生物物理過(guò)濾器，作為促進(jìn)免疫反應(yīng)、血管生成和組織再生的媒介[9]；可溶性蛋白因子通過(guò)改變其局部有效濃度、生物利用度和穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)對(duì)靶細(xì)胞的作用，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、Wnt3、Notch及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β（transforming growth factor-β,TGF-β）等[10-11]。

4 TGF-β 與肺纖維化

TGF-β是一種多效能因子，1985年首次被ASSOIAN等[12]從人血小板中分離出來(lái)，到目前已發(fā)現(xiàn)TGF-β的6個(gè)亞型，而哺乳動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)TGF-β1、TGF-β2及 TGF-β3。KHALIL等[13]1991年 發(fā) 現(xiàn)，TGF-β在肺纖維化發(fā)生過(guò)程中起重要作用。其中，TGF-β1作用更加顯著?，F(xiàn)有大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，TGF-β1是重要的致纖維化細(xì)胞因子之一，發(fā)現(xiàn)該因子在肺纖維化組織中高表達(dá)[14]。DAS等[15]通過(guò)在體和離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在人細(xì)胞株還是小鼠中，TGF-β1都有很強(qiáng)的促纖維化作用。P17是一種TGF-β抑制劑，在IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞和小鼠肺纖維化模型中能抑制TGF-β介導(dǎo)的肺纖維化[16]。此外，通過(guò)對(duì)人類特發(fā)性肺纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，抗纖維化藥物干擾素-γ（interferon-gamma IFN-γ）能降低肺組織中TGF-β水平[17]。有關(guān)TGF-β誘導(dǎo)肺纖維化的機(jī)制復(fù)雜，但PANDIT等[18]研究結(jié)果顯示，TGF-β 可下調(diào) Let-7 miRNA。而 Let-7 miRNA 的下調(diào)可誘導(dǎo)小鼠肺Ⅱ型上皮干細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，肺泡間隔增厚，膠原合成增加，纖維化發(fā)生[18]，提示TGF-β導(dǎo)致肺纖維化的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Let-7 miRNA實(shí)現(xiàn)。

5 Let-7 miRNA 與肺纖維化

MicroRNA（miRNA）是長(zhǎng)約 22 nt非編碼 RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中。這些miRNA可通過(guò)3’非翻譯區(qū)的互補(bǔ)位點(diǎn)與靶mRNA結(jié)合，通過(guò)mRNA降解抑制靶蛋白產(chǎn)生[19]。因此，miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子[19]，如miRNA-126通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體2/4信號(hào)通路中的TOMI，參與囊性纖維化[20]。miRNA-192以Smad3依賴的方式介導(dǎo)腎纖維化[21]。用博來(lái)霉素誘導(dǎo)的纖維化組織中有161種miRNA表達(dá)差異[22]。直接照射或暴露于氧化應(yīng)激的藥物時(shí)，miRNA微陣列分析表明組織中許多miRNA被上調(diào)或下調(diào)，特別是Let-7家族的miRNA可能對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)更為顯著[23]。在40個(gè)特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）組織和20個(gè)對(duì)照肺組織微陣列上進(jìn)行原位雜交，顯示IPF中Let-7 miRNA降低[24]。提示Let-7 miRNA為正常干細(xì)胞所必需，因?yàn)樯险{(diào)Let-7 miRNA可完全恢復(fù)干細(xì)胞正常表型[25]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)let-7 miRNA是Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的靶分子，其表達(dá)受Wnt/β-catenin的抑制[25]。

6 Wnt/β-catenin 途徑與肺纖維化

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑可分為決定細(xì)胞命運(yùn)的經(jīng)典途徑、控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及組織極性的非經(jīng)典途徑。Wnt/β-catenin途徑是通過(guò)β-catenin的核內(nèi)移位，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。Wnt/β-catenin途徑啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在腦、腸、皮膚及肺等正常組織的發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用[26]。Wnt途徑在乳腺癌中可增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞的擴(kuò)增[25]。IPF組織中微陣列分析顯示與Wnt/β-catenin通路有關(guān)基因被上調(diào)[27]。同時(shí)對(duì)IPF患者肺Ⅱ型細(xì)胞更詳細(xì)地分析發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路中相關(guān)的靶蛋白都有增加[28]。期間涉及的潛在分子途徑尚未完全確定，但通過(guò)使用mRNA微陣列篩選測(cè)定法，已鑒定Let-7 miRNA作為Wnt-β-連環(huán)蛋白途徑的下游靶標(biāo)[25]。該過(guò)程通過(guò)激活Lin28蛋白，使Let-7 precursor miRNA 轉(zhuǎn)化為 Let-7 mature miRNA 的過(guò)程受抑制實(shí)現(xiàn)[25]。因而筆者提出，在肺纖維化發(fā)生時(shí)，可能存在 TGF-β-Wnt/β-catenin-Lin28-let-7 miRNA調(diào)控軸。

7 肌成纖維細(xì)胞與肺纖維化

IPF患者中，ECM含量是正常肺組織的2～3倍，其主要由膠原纖維（Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ及Ⅶ）、纖連蛋白、彈性蛋白及蛋白多糖組成，大量肺纖維化研究證實(shí)，肌成纖維細(xì)胞是膠原和ECM的最主要來(lái)源[29]。正常的傷口愈合后期，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞通過(guò)凋亡來(lái)減少。但在IPF患者中特別是纖維化病灶中，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞數(shù)量保持不變[30]。有研究表明，在IPF組織中成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞數(shù)量越多，預(yù)后越差[31]。近年來(lái)許多學(xué)者認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞有3種來(lái)源[32]：①器官自身:基質(zhì)成纖維細(xì)胞；②骨髓“纖維細(xì)胞”；③上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。以上3種假設(shè)未被證實(shí)，然而目前不同原因?qū)е碌睦w維化肌成纖維細(xì)胞確切來(lái)源還不清楚。

綜上所述，肺組織上皮在胸部放療過(guò)程中會(huì)造成一定的損傷，正常情況下通過(guò)Ⅱ型肺泡上皮干細(xì)胞的增殖、分化進(jìn)行修復(fù)。肺纖維化患者中，上皮細(xì)胞沒(méi)有得到補(bǔ)充修復(fù)，而為膠原和ECM所取代。纖維化組織中 TGF-β、Let-7 miRNA、Wnt/β-catenin途徑中相關(guān)的靶蛋白、肌成纖維細(xì)胞都有改變。同時(shí)已證實(shí) TGF-β 可下調(diào) Let-7 miRNA，而 Let-7 miRNA又受到Wnt/β-catenin途徑抑制（該過(guò)程通過(guò)激活Lin28蛋白實(shí)現(xiàn)）。筆者可假設(shè)放射導(dǎo)致TGF-β升高，通過(guò)Wnt/β-catenin途徑激活Lin28蛋白，抑制成熟Let-7 miRNA形成，使肺泡Ⅱ型干細(xì)胞在缺乏Let-7miRNA的情況下沒(méi)有正常分化，而異分化為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞又進(jìn)一步產(chǎn)生ECM，從而導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。然而假設(shè)需要被證實(shí)，希望筆者接下來(lái)的課題能確認(rèn)TGF-β、Wnt/β-catenin及Let-7 miRNA相關(guān)性，同時(shí)闡明肺纖維化發(fā)生的確切機(jī)制。