慢病毒介導(dǎo)FGFR1沉默對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

（開封市中心醫(yī)院 心胸外科，河南 開封 475000）

肺癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤的第2位，病死率居首位，對人類健康造成嚴(yán)重威脅，因此探尋早期診斷的特異性指標(biāo)成為目前肺癌的研究熱點(diǎn)[1]。成纖維生長因子受體 1（fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1）在乳腺癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，且應(yīng)用于臨床鱗狀細(xì)胞癌的篩查，在肺癌靶向治療中具有廣闊前景，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明[2-4]。本研究探討慢病毒介導(dǎo)FGFR1沉默對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期為肺癌靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

肺癌細(xì)胞A549、H3255、A-427購自美國典型菌種保藏中心（ATCC），腎上皮細(xì)胞293T購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑與儀器

慢病毒載體pLVTHM購自武漢淼靈生物科技有限公司，MTT試劑盒購自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司，Trizol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit購自大連寶生生物工程有限公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司，酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，BCA檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)BS、DMEM購自美國Gibco公司，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱購自中國賽默飛世爾科技有限公司（上海），F(xiàn)GFR1單克隆抗體購自武漢艾美捷科技有限公司，β-actin單克隆抗體購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，IRDye 680RD Donkey Anti-mouse IgG購自美國LI-COR公司，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 篩選高表達(dá) FGFR1 mRNA 的肺癌細(xì)胞

采用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、H3255、A-427肺癌細(xì)胞。用Trizol法分別提取細(xì)胞總RNA，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書將提取的總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用德國 Mastercycler?ep realplex 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀檢測 FGFR1 mRNA 的相對表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)體系25μl，包括總cDNA 2μl，正反向引物各 1μl，SYBR 12.5μl，無 RNA 酶水補(bǔ)足反應(yīng)體系至25μl。反應(yīng)程序采用兩步法，退火溫度設(shè)置為60℃。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)≥2次，每次設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以A549做均一化處理，用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，篩選出FGFR1 mRNA表達(dá)較高的肺癌細(xì)胞。FGFR1和內(nèi)參基因GAPDH引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物列表

1.4 慢病毒表達(dá)載體 LV-shFGFR1 的構(gòu)建、包裝及病毒顆粒的制備

FGFR1特異性siRNA引物：5’-CGCAAGTAACGT ACCGTAATA-3’，位于FGFR1基因 96～116 bp處，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。限制性內(nèi)切酶MluⅠ、ClaⅠ雙酶切pLVTHM，將目的片段經(jīng)DNA連接酶插入到酶切過的慢病毒表達(dá)載體，將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體（LV-shFGFR1）轉(zhuǎn)化至TOP10，篩選陽性克隆。將LV-shFGFR1、空載體分別與輔助包裝質(zhì)粒（pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝干擾病毒顆粒，收毒，滴定至5×109TU/ml。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

收集病毒上清，加至A549細(xì)胞中，感染復(fù)數(shù)為10，同時(shí)加入病毒感染增強(qiáng)液和聚凝胺（5μg/ml），感染shFGFR1病毒作為干擾組，感染空載體病毒作為空載體組，未進(jìn)行感染的作為對照組。96 h后用熒光顯微鏡檢測重組慢病毒感染情況。

1.6 細(xì)胞檢測

1.6.1 qRT-PCR檢測 FGFR1 mRNA 提取各組細(xì)胞的總 RNA，參照 PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄總 RNA 為 cDNA，用 Mastercycler?ep realplex qRT-PCR儀檢測FGFR1 mRNA相對表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)體系20μl，包括總cDNA 2μl，正反向引物各1μl，SYBR 10μl，無 RNA 酶水 6μl。反應(yīng)程序采用兩步法，退火溫度設(shè)置為60℃。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)≥2次，每次設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以對照組做均一化處理，用2-ΔΔCt法計(jì)算 mRNA相對表達(dá)量。

1.6.2 Westernblotting 檢測 FGFR1 蛋白 采用細(xì)胞裂解液（含PMSF）裂解各組細(xì)胞，8 000 r/min離心15 min，收集上清，放置4℃條件下備用。利用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考說明書。根據(jù)檢測的蛋白濃度進(jìn)行半定量，10% SDSPAGE分離蛋白，采用全濕法350 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂乳室溫封閉2 h，PBS緩沖液洗滌5次，3 min/次。一抗即FGFR1單克隆抗體（1∶1 000稀釋）或β-actin單克隆抗體（1∶1 000稀釋）室溫孵育 2.5 h，PBST 洗膜 3次，PBS洗膜 2次，5 min/次。室溫條件下避光，熒光二抗（IRDye 680RD Donkey Anti-mouse IgG,1 ∶ 20 000 稀釋）孵育 1.5 h，PBST洗膜3次，PBS洗膜2次，高壓ddH2O洗滌2次，3 min/次。采用Odyssey?紅外成像系統(tǒng)分析蛋白相對表達(dá)量。

1.6.3 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖 使用 MTT 測定各組細(xì)胞的增殖活力。將細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后將其分為對照組、空載體組及感染組。對各組細(xì)胞采用不同方式處理后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于干擾0、12、24、48和72 h后，加入20μl/孔MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后棄上層溶液，加入1 300μl/孔DMSO，振蕩溶解12 min。采用酶標(biāo)儀測定470 nm處光密度（optical density,OD）值。

1.6.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞按 1.0×105個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，對各組細(xì)胞采用不同方式處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，適量PBS緩沖液洗滌3次，75%預(yù)冷乙醇保存，4℃過夜。PBS洗滌 3次，37℃條件下 20μl RNA 酶孵育細(xì)胞 20 min，避光條件下20μl碘化丙啶（propidium iodide,PI）染色，4℃孵育30 min。采用FACScan流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分析，利用ModFit LT細(xì)胞周期分析軟件對凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6.5 Hoechest染色檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔接種于含有飛片的24孔板中，培養(yǎng)48 h，棄上清，PBS緩慢洗滌 3次，每孔加入 2 ml 4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min，棄固定液，PBS緩慢洗滌3次，6 min/次，超凈臺中風(fēng)干。避光條件下于飛片中央滴加 200μl Hoechest 33258 工作液，室溫染色20 min，PBS輕柔洗去染色液，洗滌3次，6 min/次，用鑷子小心取出飛片，濾紙小心吸去飛片多余液體，自然風(fēng)干飛片，于干凈載玻片上滴加抗熒光猝滅劑1滴，于飛片細(xì)胞一側(cè)小心放置于滴加有抗熒光猝滅劑的位置上進(jìn)行封片，封片后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549 細(xì)胞中 FGFR1 mRNA 呈高表達(dá)

A549、H3255、A-427細(xì) 胞 中 FGFR1 mRNA 的相對表達(dá)量分別為（1.11±0.06）、（0.62±0.04）和（0.71±0.02），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=109.339，P=0.000）；A549細(xì)胞高于H3255和A-427細(xì)胞（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3 種肺癌細(xì)胞中 FGFR1 mRNA 相對表達(dá)量比較（±s）

2.2 慢病毒穩(wěn)定感染 A549 細(xì)胞

感染96 h后，熒光顯微鏡檢測病毒感染A549細(xì)胞情況顯示，空載體組和干擾組細(xì)胞綠色熒光蛋白陽性率均＞90%，表明重組慢病毒對A549細(xì)胞有較好的親嗜性。見圖2。

圖2 A549 細(xì)胞病毒感染情況（×100）

2.3 干 擾組A549 細(xì)胞 中 FGFR1 mRNA 表達(dá)下調(diào)

以β-actin為內(nèi)參基因，對照組、空載體組、干擾組A549細(xì)胞中FGFR1 mRNA相對表達(dá)量分別為（1.09±0.12）、（1.07±0.10）和（0.21±0.03），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=89.787，P=0.000）；空載體組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干擾組低于對照組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 干擾組細(xì)胞中 FGFR1 蛋白表達(dá)下降

圖3 各組FGFR1 mRNA 相對表達(dá)量比較（±s）

以GAPDH作為內(nèi)參，對照組、空載體組、干擾組A549細(xì)胞中FGFR1蛋白相對表達(dá)量分別為（0.42±0.09）、（0.39±0.07） 和（0.08±0.01）， 經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.344，P=0.001）；空載體組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干擾組低于對照組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組FGFR1 蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

2.5 各組細(xì)胞增殖情況

干擾組、空載體組、對照組0、12、24、48和72 h的細(xì)胞增殖情況比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=75.321，P=0.000）；②3組細(xì)胞增殖情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.364，P=0.000）；③ 3組細(xì)胞增殖情況隨時(shí)間變化趨勢有差異（F=91.637，P=0.000）。見表2和圖5。

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較

圖5 各組細(xì)胞 OD 值變化趨勢（±s）

2.6 干擾組細(xì)胞凋亡率上升

經(jīng)Hoechest染色顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為（17.2±1.32）%，空載體組為（17.3±1.24）%，干擾組為（25.32±2.14）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.296，P=0.000）；空載體組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干擾組高于對照組和空載體組（P＜0.05）。Hoechest染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致。見圖6～8。

圖6 流式細(xì)胞凋亡圖

圖7 各組細(xì)胞凋亡情況（Hoechest染色×400）

圖8 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s）

3 討論

肺癌是目前世界范圍內(nèi)病死率最高的疾病[5]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌所占比例較大[6]。小細(xì)胞肺癌具有發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移較快和侵襲力強(qiáng)等特點(diǎn)，小細(xì)胞肺癌初治時(shí)較易獲得良好的療效，但后期治療極易對藥物產(chǎn)生耐藥性，出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7]。非小細(xì)胞肺癌具有癌細(xì)胞增長緩慢，且轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散較晚等特點(diǎn)[8]。通常非小細(xì)胞肺癌患者不易被察覺，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中、晚期，也因此導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者病死率居高不下[9]。肺癌受許多因素調(diào)控，機(jī)制極其復(fù)雜，其中包括一些基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)發(fā)生變化等[10-13]。

FGFR1基因編碼的蛋白為酪氨酸激酶受體，是一個(gè)跨膜蛋白，成纖維生長因子受體可與FGFR1蛋白細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致FGFR1蛋白結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域發(fā)生磷酸化，從而活化STAT、Rap1、MAPK和PI3K-Akt等信號通路[14]。隨著對FGFR1研究的不斷深入，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用也越來越不容忽視。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中FGFR1相對表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，由此說明FGFR1為癌癥相關(guān)基因[15]。由于常用的放化療在肺癌治療上有生存率低和預(yù)后效果不理想等缺點(diǎn)，人們迫切需要一種新的治療方法來彌補(bǔ)放化療的不足，因此分子靶向治療走進(jìn)了人們的視線，并隨著研究的不斷深入，目前分子靶向治療藥物已進(jìn)入臨床應(yīng)用，例如以EGFR為靶點(diǎn)的易瑞沙和特羅凱便屬于該類藥物[16-17]。本研究利用肺癌細(xì)胞系，闡明慢病毒介導(dǎo)FGFR1沉默對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為肺癌分子靶向治療的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR檢測各組FGFR1 mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，A549細(xì)胞中FGFR1 mRNA相對表達(dá)量高于H3255和A-427細(xì)胞，因此本研究通過慢病毒介導(dǎo)抑制FGFR1表達(dá)來探討FGFR1對A549肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。siRNA是一種短片段dsRNA，能夠利用慢病毒載體對siRNA進(jìn)行介導(dǎo)，在核酸內(nèi)切酶作用下，降解同源互補(bǔ)的mRNA，從而導(dǎo)致目的基因無法變大，呈現(xiàn)抑制狀態(tài)[18]。本研究結(jié)果顯示，干擾組FGFR1 mRNA相對表達(dá)量較對照組下調(diào)，表明慢病毒表達(dá)質(zhì)粒能夠干擾FGFR1基因的轉(zhuǎn)錄。采用Western blotting檢測各組FGFR1蛋白相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，干擾組FGFR1蛋白相對表達(dá)量較對照組下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證慢病毒表達(dá)質(zhì)粒能夠干擾FGFR1蛋白的表達(dá)。Western blotting檢測結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量檢測結(jié)果一致，表明無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上，干擾組FGFR1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均表現(xiàn)為下調(diào)。過往研究表明，當(dāng)FGFR1表達(dá)受到抑制時(shí)可有效抑制胃癌細(xì)胞增殖[19]。本研究通過MTT比色法發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾組中細(xì)胞增殖率下降，說明慢病毒介導(dǎo)的FGFR1基因沉默能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，與過往相關(guān)研究一致[19]，表明在肺癌細(xì)胞中FGFR1相對表達(dá)量下調(diào)也能有效抑制癌細(xì)胞增殖。相關(guān)研究表明，在卵巢癌中FGFR1相對表達(dá)量下調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加對藥物的敏感性[20]。本研究中FGFR1細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，干擾組細(xì)胞凋亡率高于對照組，表明慢病毒介導(dǎo)的FGFR1基因沉默能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，與過往其他癌癥研究結(jié)果一致[20]。本研究通過對照組與空載體組的對比，可以排除慢病毒載體本身對FGFR1表達(dá)產(chǎn)生影響的干擾。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)的FGFR1沉默，顯著抑制FGFR1表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。提示FGFR1可能參與肺癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程，同時(shí)也說明FGFR1有潛力成為新的藥物分子靶標(biāo)，但還需對其進(jìn)一步驗(yàn)證，本研究結(jié)果為肺癌基因治療提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。