液質(zhì)聯(lián)用法監(jiān)測玉屏風顆粒原藥材的投料分析研究

羅華玲，王小林，朱敏鳳，馮想，袁茂華，黎小虎，林海霞

(樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000)

玉屏風為中醫(yī)扶正固表的傳統(tǒng)名方，其顆粒劑由黃芪、防風、白術(shù)(炒)三味藥組成，具有益氣、固表、止汗之功效，主要用于表虛不固，自汗惡風，面色晄白，或體虛易感風邪者。玉屏風顆粒為國家中藥保護品種，收載于《中國藥典》2015年版一部[1]。根據(jù)中醫(yī)藥理論及方解，中藥復方制劑是依據(jù)君臣佐使的原則組方給藥，其療效是各味藥綜合作用的體現(xiàn)。在本方中黃芪重用益氣固表，實衛(wèi)止汗，為君藥；白術(shù)健脾益氣，助黃芪益氣固表，為臣藥；防風走表而御風邪，為佐藥。玉屏風顆粒質(zhì)量標準中僅以黃芪的主要有效成分黃芪甲苷作為質(zhì)量控制指標，難以全面控制復方制劑的質(zhì)量。那么某些制藥廠為了提高自己市場競爭力，會降低其生產(chǎn)成本，利用質(zhì)量標準的不完善，在生產(chǎn)中會少投或不投某些藥材，或直接加入質(zhì)量標準中有質(zhì)控的有效成分，那么這些藥品，雖然沒有按生產(chǎn)工藝投料生產(chǎn)，擔按質(zhì)量標準檢驗卻還是合格。這就造成質(zhì)量不同的玉屏風顆粒價格高低不一，擾亂市場，同時也不能確保人民群眾用藥的安全性和有效性[2]。經(jīng)查閱文獻，國內(nèi)外對玉屏風顆粒有效成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)的檢測方法報道并不多見，主要的測定方法有 RP-HPLC(反相高效液相色譜法)[3-4]、HPLC-ELSD(高效液相-蒸發(fā)光散射檢測)[5]、UV(紫外可見分光光度法)[6]、UPLC(超高效液相色譜法)[7]，但都僅以一、兩種有效成分作為監(jiān)測對象，未見有全面測定玉屏風顆粒中各有效成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)含量的報道，更無應(yīng)用HPLC-MS/MS法全面監(jiān)測玉屏風顆粒中原藥材(黃芪、防風、白術(shù))投料情況的報道。

因此本實驗從監(jiān)測制藥廠家生產(chǎn)的中成藥是否按工藝投料方面著手，以中成藥玉屏風顆粒為研究對象，應(yīng)用HPLC-MS/MS檢測方法，測得混合對照藥材(黃芪、防風、白術(shù))、對照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)、市售玉屏風顆粒樣品的一級質(zhì)譜圖及二級質(zhì)譜圖，選取各自的特征峰進行對比分析，即可監(jiān)測玉屏風顆粒中原藥材(黃芪、防風、白術(shù))的投料情況；通過測得的HPLC-MS/MS色譜峰面積，可同時對質(zhì)控成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)進行準確定量。該方法能更全面、快捷地監(jiān)控玉屏風顆粒的投料情況及質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SIL-20AHT型高效液相色譜儀-API3200型質(zhì)譜儀(高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源，美國AB SCIEX公司)；數(shù)據(jù)處理軟件analyst Software(版本1.4.2Build1465，美國AB SCIEX公司)；電子天平(mettle toledo)；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器(上海躍進醫(yī)用光用器械廠)。

1.2 材料

黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201616，純度：97.4%)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(中國食品藥品檢定研究院，批號111978-201501，純度：99.9%)；升麻苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111522-201511，純度94.8%)；黃芪(蒙古黃芪，中國食品藥品檢定研究院，批號：120974-201311)；白術(shù)(中國食品藥品檢定研究院，批號 120925-201109)；升麻(興安升麻，中國食品藥品檢定研究院，批號：121182-201102)；玉屏風顆粒(市售藥品，廣東環(huán)球制藥有限公司，批號分別為 170101、160608、160318，規(guī)格為5g/袋×12袋/盒)。甲醇、乙醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱Inertsil ODS-3，(2.1 mm×150 mm×5 μm)；流速為0.4 mL/min；進樣量為10 μL；體積流量為0.2 mL/min；流動相以甲醇(A)-10 mmol/L醋酸銨(B)溶液,梯度洗脫(0～3 min，5%A；3～4 min,5%～95%A； 4～10 min,95%A；10～15 min,95%～5%A；15.01 min,stop)。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧ESI離子源；掃描方式：負離子；檢測方式：多反應(yīng)定性(定量)監(jiān)測；負極電離；氣簾氣流速為30 L/min；碰撞氣流速為3 L/min；毛細管電壓為-5 500 V；干燥氣溫度為450℃；加熱電離輔助氣流速為30 L/min；加熱電離輔助氣流速為30 L/min；檢測器采用負離子檢測，掃描方式采用全掃描一級質(zhì)譜、全掃描二級質(zhì)譜，質(zhì)荷比范圍100～1 000。黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷質(zhì)譜分析的條件參數(shù)見表1。

表1 黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷質(zhì)譜分析的條件參數(shù)

2.2 對照提取物及對照品溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取黃芪甲苷11.26 mg(含量以97.4%計)，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得黃芪甲苷對照品溶液109.67 μg/mL；精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 10.45 mg(含量以99.9%計)，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液104.40 μg/mL；精密稱取升麻苷11.21 mg(含量以94.8%計)，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得升麻苷對照品溶液106.27 μg/mL。

混合對照品溶液：精密量取黃芪甲苷對照品溶液1 mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液1 mL,升麻苷對照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。黃芪甲苷對照品溶液濃度為1.10 μg/mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液1.04 μg/mL，升麻苷對照品溶液1.06 μg/mL。

2.2.2 對照藥材溶液的配制

精密稱取黃芪藥材3.045 1 g，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至含醇量為70%，攪拌，靜置，濾過，濾液減壓濃縮至約1 mL，加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密稱取白術(shù)藥材1.041 9 g，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至含醇量為70%，攪拌，靜置，濾過，濾液減壓濃縮至約1 mL，加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密稱取防風藥材1.065 3 g，提取揮發(fā)油，蒸餾后水溶液濃縮至約1 mL，揮發(fā)油及濃縮水溶液置200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取玉屏風顆粒，研成細粉，精密稱定約2.5 g，置索氏提取器中，加甲醇180 mL，加熱回流至提取液無色(約6 h)，提取液過濾至200 mL量瓶中，用甲醇多次洗滌藥粉，并入量瓶中，用甲醇定容至刻度；取上述溶液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

按上述色譜及質(zhì)譜條件，將黃芪對照藥材、白術(shù)對照藥材、防風對照藥材、玉屏風顆粒、混合對照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷對照品)進行測定，記錄一級質(zhì)譜圖(圖1、圖2)、HPLC-MS/MS色譜圖(圖3)。由圖1、圖2及圖3可知玉屏風顆粒中各組分峰型良好，本方法具有較好的分離度和靈敏度，可以進行定量分析。

注：A:黃芪對照藥材;B：白術(shù)對照藥材；C:防風對照藥材;D:玉屏風顆粒圖1 黃芪對照藥材,白術(shù)對照藥材,防風對照藥材,玉屏風顆粒的一級質(zhì)譜圖

注：E：黃芪甲苷 (785.8/143.5 amu)、F：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(249.2/231.8 amu)、G：升麻苷(469.5/308.0 amu)圖2 混合對照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)一級質(zhì)譜圖

圖3 黃芪甲苷，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，升麻苷對照品的HPLC-MS/MS色譜圖

從對照品一級質(zhì)譜圖上可看出，黃芪甲苷的特征峰為785.8；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的特征峰為231.4、249.4；升麻苷的特征峰為469.5。黃芪對照藥材的特征峰為177.3、360.3、381.1、458.4、475.3、679.9、785.8；白術(shù)對照藥材的特征峰為135.4、161.4、163.8、185.7、231.7、249.9；防風對照藥材的特征峰為266.2、291.4、307.4、453.4、469.4、491.3；混合對照品的特征峰為231.4、249.4、469.5、587.5、785.8。

在市售玉屏風顆粒一級質(zhì)譜圖的特征峰：116.1、175.3、249.3、381.1、469.4、785.6，可以看到市售玉屏風顆粒與黃芪對照藥材、白術(shù)對照藥材、防風對照藥材、混合對照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)的一級質(zhì)譜圖有相應(yīng)的特征峰，由此可判斷，市售玉屏風顆粒按原藥材(黃芪、白術(shù)、防風)投料，即可確定該中成藥按生產(chǎn)工藝投料。

2.4 方法驗證

2.4.1 專屬性

分別取上述對照品溶液、供試品溶液與溶劑空白，采用HPLC-MS/MS法測定，供試品溶液總離子流色譜圖中待測峰的出峰位置處未見干擾峰，專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系試驗

標準曲線對照品溶液的制備：精密量取黃芪甲苷對照品溶液(109.67 μg/mL)(2.2項)5 mL置50 mL棕色量瓶中，定容到刻度，取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、6 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線對照品溶液。照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標，經(jīng)線性回歸，得線性回歸方程y=1.85e+004x-69.7(r=0.999 5)，結(jié)果表明在0.105～0.628 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

精密量取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液(104.40 μg/mL)5 mL置50 mL棕色量瓶中，定容到刻度，取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、6 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線對照品溶液。照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標，經(jīng)線性回歸，得線性回歸方程y=1.74e+006x+1.36e+003(r=0.999 9)，結(jié)果表明在0.104～0.626 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

精密量取升麻苷對照品溶液(106.27 μg/mL)0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線對照品溶液。照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標，經(jīng)線性回歸，得線性回歸方程y=6.16e+004x+3.95e+003(r=0.998 8)，結(jié)果表明在0.531～3.19 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗

取混合對照品溶液，照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，按“2.1分析條件” ，平行測定6次，記錄色譜圖各對照品的峰面積，并計算得黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷色譜峰面積的RSD分別為0.56%，0.80%，1.10%。

2.4.4 重復性試驗

取同一批號玉屏風顆粒顆粒(批號為170101)6份，按“2.3”項方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1分析條件”測定3個有效成分峰面積，計算樣品中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷的含量，其含量的RSD分別為1.1%、0.9%、1.6%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗

取玉屏風顆粒顆粒(批號為170101)1份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1分析條件”測定，分別于 0，2，4，8，12，24 h進行測定分析，以色譜峰面積計算，結(jié)果黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、2.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定; 將同一供試品溶液置于4 ℃冰箱中，每日進樣1次，連續(xù)測定5 d，以峰面積計算，結(jié)果黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷峰面積的RSD分別為1.8%、1.7%、2.5%。

2.4.6 加樣回收試驗

精密稱取黃芪甲苷12.05 mg(含量以97.4%計)，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得黃芪甲苷對照品溶液1.173 7 mg/mL；精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ16.85 mg(含量以99.9%計)，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液0.673 3 mg/mL；精密稱取升麻苷26.73 mg(含量以94.8%計)，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得升麻苷對照品溶液5.068 0 mg/mL。

取玉屏風顆粒(批號為170101)9份，三份為一組，研成細粉，分別精密稱取約1.2 g，置索氏提取器中，每組分別精密加入上述黃芪甲苷對照品溶液(1.173 7 mg/mL)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液(0.673 3 mg/mL)、升麻苷對照品(5.068 0 mg/mL)0.8 mL、1 mL、1.2 mL各三份；加甲醇180 mL，加熱回流至提取液無色，提取液過濾至200 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度；取上述溶液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷平均回收率分別為90.77%，93.25%, 94.26%(n=9)。玉屏風顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷回收率結(jié)果見表2。

2.5 樣品測定

取3批次玉屏風顆粒(1.2項)照(2.3項)制備方法制備供試品溶液，按“2.1分析條件”測定三種有效成分的峰面積，每批重復測定 3 次，按回歸方程計算黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷的含量，結(jié)果見表3。

2015年版《中國藥典》規(guī)定每袋玉屏風顆粒含黃芪以黃芪甲苷計，不得少于3.5 mg，未對其余兩成分作規(guī)定。根據(jù)表3結(jié)果，可知3批次樣品的黃芪甲苷含量符合標準規(guī)定。

表2 玉屏風顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷回收率試驗結(jié)果

表3 玉屏風顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷的含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

玉屏風顆粒是由黃芪、白術(shù)、防風制成的復方制劑，中藥復方是依據(jù)君臣佐使的原則組方給藥，中藥復方的療效是各味藥綜合作用的體現(xiàn)，本制劑中的主要藥效指標成分為黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷，而《中國藥典》單以一味藥(黃芪)為質(zhì)控標準來衡量，難以全面控制復方的質(zhì)量。本文應(yīng)用HPLC-MS/MS方法建立了同時檢測玉屏風顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷的定量測定方法，流動相以甲醇-10 mmol/L醋酸銨溶液按梯度程序洗脫，體積流量為0.4 mL/min，各成分得到較好的分離，且保留時間適當。

本實驗采用HPLC-MS/MS方法監(jiān)測原藥材投料情況及同時測定主要藥效指標成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷)的含量。本方法可同時進行樣品前處理及各有效成分的含量測定，在人力物力上節(jié)約了時間和成本；且通過測得原藥材(黃芪、白術(shù)、防風)、主要藥效指標成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷)、及市售玉屏風顆粒的一級質(zhì)譜圖及二級質(zhì)譜圖，選取各自的特征峰進行對比分析，可判斷該藥品生產(chǎn)時是否按工藝投料，即可全面監(jiān)測原藥材的投料情況；將樣品的色譜峰面積代入指標成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷)的線性方程中，可準確計算出玉屏風顆粒中有效指標成分黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷的含量。

研究結(jié)果顯示：含量測定的方法學考察均符合要求，該方法成本低、快速簡便、精密度好、科學合理、靈敏度高，可全面監(jiān)測和控制原藥材的投料情況，可準確地測定出玉屏風顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷的含量，并為含黃芪、白術(shù)、防風制劑質(zhì)量標準的提高研究提供參考依據(jù)；此方法不僅為玉屏風顆粒的質(zhì)量控制提供了參考和依據(jù)，同時為下一步研究玉屏風顆粒的藥動學奠定了一定基礎(chǔ)。