甲基強的松龍通過下調ERK1/2-NF-κB信號通路減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓炎癥

張 健， 曾育琦， 沈 輝， 康德勇， 張 靜， 陳曉春

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘疾病，是引起中青年人致殘的主要原因，其發(fā)病機制尚未完全闡明。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)具有與人類MS相似的臨床病理及免疫學特征，是模擬MS較好的動物模型。目前認為，致炎性T淋巴細胞介導的免疫反應是MS及EAE的主要發(fā)病機制。1型輔助性T細胞(helper T cells，Th1)和Th17細胞及其分泌的細胞因子通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起炎癥細胞浸潤、髓鞘脫失及軸索損害。這一過程涉及多條信號通路。Agrawal等發(fā)現(xiàn)，細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1)敲除小鼠較野生型小鼠對EAE更易感，臨床癥狀更嚴重[1]。在MS患者的腦組織及EAE小鼠的脊髓中檢測到活化的核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)[2-3]。這些研究提示ERK-NF-κB信號通路在EAE的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

本研究應用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)免疫誘導雌性C57BL/6小鼠，建立EAE模型，待小鼠發(fā)病后給予甲基強的松龍(methylprednisol，MP)治療，在體觀察EAE小鼠的臨床癥狀、脊髓病理及炎癥介質變化，進一步探索其可能機制，為MP的臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 8～10周齡雌性C57BL/6小鼠，購于上海斯萊克實驗有限公司[許可證號SCXK(滬)2007-0005，合格證號200700506479]。鼠源MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由上海生物工程有限公司合成，采用高效液相色譜儀純化，HPLC純度>98%；福氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)、百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、羅克沙爾堅牢藍染料(luxol fast blue，LFB)(美國Sigma公司)；滅活結核桿菌(mycobacterium tuberculosis H37Ra)(美國Difco公司)；MP(大連輝瑞制藥公司)；一抗磷酸化ERK1/2，ERK1/2及磷酸化NF-κB，NF-κB(美國Cell Signaling公司)，T-bet和RoRγt(美國Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立及動物分組 每只小鼠配制200 μL乳化劑(MOG35-55300 μg，結核桿菌500 μg)，于雙側脅部皮下分4點注射免疫小鼠，每側2點，每點50 μL乳化液[4]。于免疫當日(0天)及48 h(2 d)腹腔內注射400 ng PT。免疫后每天同一時間點測量小鼠的體質量并進行神經(jīng)功能評分[5]：無癥狀為0分；尾部癱瘓為1分；共濟失調、后肢輕癱為2分；雙后肢癱瘓為3分；四肢癱瘓為4分；死亡為5分。

將MOG35-55誘導的10～14 d發(fā)病且神經(jīng)功能評分為1～4分的EAE小鼠隨機分為溶媒組(腹腔注射PBS 0.1 mL)和MP組(腹腔注射MP 40 mg/kg)，每組9～12只，于每日同一時間(10：30 am)腹腔注射給藥，每天1次，共給藥7 d；另取9只同齡小鼠作為對照組(Control組)，每日腹腔注射0.1 mL PBS，連續(xù)注射7 d。所有小鼠于免疫后第29天處死。

1.2.2組織病理學染色 每組取3只小鼠，經(jīng)3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，將預冷的4%多聚甲醛-0.1 mmol/L PBS(pH=7.2)由左心室內灌注，冰面上快速取小鼠腰膨大，置于預冷的4%多聚甲醛-0.1 mmol/L PBS，4 ℃固定24 h后石蠟包埋，沿脊髓橫切面連續(xù)切片，行H-E及LFB染色。根據(jù)以下評分標準定量炎癥情況[6]：無細胞浸潤為0分；脊膜細胞浸潤為1分；軟脊膜少許炎癥細胞浸潤(1～10個/視野)為2分；軟脊膜中等量炎癥細胞浸潤(11～100個/視野)為3分；大量炎癥細胞浸潤(>100個/視野)為4分。髓鞘脫失定量采用以下標準[7]：無髓鞘脫失為0分；軟脊膜下輕度髓鞘脫失為1分；顯著軟膜下血管周圍脫髓鞘為2分；融合血管周圍及血管下脫髓鞘為3分；累及一半以上脊髓范圍髓鞘脫失為4分；大片髓鞘脫失延及整個脊髓為5分。每組剩余小鼠經(jīng)0.1 mmol/L的PBS灌注后，冰上快速分離脊髓，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3透射電鏡檢查 電鏡標本取材后經(jīng)3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定2 d(4 ℃)，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定1.5 h，PBS漂洗；70%酒精飽和醋酸鈾染液塊染，酒精-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片80 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色5 min，透射電鏡(EM 208型，荷蘭飛利浦公司)下觀察、攝影。

1.2.4實時熒光定量PCR 抽提小鼠脊髓總RNA，逆轉錄為cDNA，由熒光定量PCR儀(ABI 7500，美國ABI公司)進行定量檢測。引物序列由上海生物工程有限公司合成。

IFN-γ：

F1：5′-ATGGCTGTTTCTGGCTGTTACT-3′

R1：5′-GGATTTTCATGTCACCATCCTT-3′

IL-17：

F1：5′- GCAATGAAGACCCTGATAGA-3′

R1：5′- TCTTCTCGACCCTGAAAGTGA-3′

IL-4：

F1：5′-GTCCTCACAGCAACGAAGAAC-3′

R1：5′-TGATGCTCTTTAGGCTTTCCA-3′

IL-5：

F1：5′-ACAAGCAATGAGACGATGAGG-3′

R1：5′-CCACGGACAGTTTGATTCTTC-3′

IL-21：

F1：5′-CCATCAAACCCTGGAAACAATA-3′

R1：5′-TCTTTGGGTGTCCTTTTCT CAT-3′

IL-23：

F1：5′-ATCCAGTGTGAAGATGGTTGTG-3′

R1：5′-AGTAGGGAGGTGTGAAGTTGCT-3′

IL-10：

F1：5′-ACAGCCGGGAAGACAATAACT-3′

R1：5′-GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA-3′

T-bet：

F1：5′-CAACCAGCACCAGACAGAGAT-3′

R1：5′-CAAGACCACATCCACAAACATC-3′

RoRγt：

F1：5′-ATGCCAACAACCACACAGTCT-3′

R1：5′-TGAGGAAGTGGGAAAAGTCAA-3′

GAPDH：

F1：5′-CAGTGGCAAAGTGGAGTTGTTG-3′

R1：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′

實時PCR反應體系：2×ROX 10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL，無RNA酶水7.8 μL。反應條件：50 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸60 s，進行40個循環(huán)。反應結束后進行熔解曲線分析引物的特異性。用相對定量2-△△Ct法比較各組間炎癥因子及轉錄因子mRNA的相對表達差異。每份標本均重復檢測3管，取均值作為目的基因的表達水平。

1.2.5Western-blot測定 脊髓組織經(jīng)超聲裂解后，采用BCA法進行蛋白定量后取50 μg樣品，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕電轉移法將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫下封閉液封閉1 h，將膜移入用封閉液稀釋的一抗(pERK1/2，ERK1/2，T-bet，RoRγt，pNF-κB及NF-κB均為1∶1 000稀釋)。4 ℃孵育過夜，洗液洗滌，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的IgG二抗(1∶1 000～1∶2 000稀釋)反應60～90 min，洗液洗滌，化學發(fā)光法顯色，X射線底片曝光，actin作為內參照(1∶2 000稀釋，英國Abcam公司)。

2 結 果

2.1MP改善EAE小鼠的臨床神經(jīng)功能 重復性方差分析顯示，各組間總體主效應——時間(P<0.001)和組別(P<0.01)均有統(tǒng)計學意義，并且存在交互作用(P<0.001，圖1)。與溶媒組比較，MP組的臨床神經(jīng)功能評分明顯降低，停止腹腔注射MP后，臨床癥狀無復發(fā)。

2.2MP減輕EAE小鼠脊髓炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失 對照組小鼠H-E染色顯示，脊髓未見炎性細胞；LFB染色顯示，藍色髓鞘排列規(guī)則，著色均勻；電鏡顯示，小鼠脊髓髓鞘板狀結構清晰，細胞器結構致密完整。溶媒組小鼠H-E染色見脊髓大量炎癥細胞浸潤，小血管周圍可見血管套形成，動物炎癥

圖1 小鼠臨床神經(jīng)功能評分Fig 1 Clinical score of mice

評分為(3.24±0.45)分；LFB染色見脊髓白質區(qū)有大小不等片狀髓鞘脫失，髓鞘纖維松散，空泡形成；髓鞘脫失評分為(3.45±0.30)分；透視電鏡可見小鼠髓鞘呈板狀剝脫、崩解斷裂、空泡形成，軸索腫脹結構疏松。MP組小鼠脊髓炎癥細胞較溶媒組明顯減少，炎癥細胞浸潤評分為(1.58±0.43)分；LFB染色顯示髓鞘排列較清晰，髓鞘脫失評分為(1.26±0.50)分，髓鞘破壞情況較溶媒組明顯減輕，2組比較差別有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05，圖2)。

A1～A3，B1～B3為H-E染色； C1～C3為LFB染色； D1～D3為EM染色. A1，B1，C1，D1：對照組，H-E染色未見炎癥細胞，LFB染色見髓鞘結構清晰，電鏡下見髓鞘結構清晰，細胞器致密完整；A2，B2，C2，D2：溶媒組，H-E染色見大量炎癥細胞浸潤，LFB染色見脊髓白質片狀髓鞘脫失，電鏡下見髓鞘結構紊亂板層脫失；A3，B3，C3，D3：甲基強的松龍組，H-E染色見脊髓炎癥細胞較溶媒組明顯減少，LFB染色見脊髓白質部分髓鞘結構破壞，電鏡下見部分髓鞘結構破壞.圖2 EAE鼠脊髓組織病理學改變Fig 2 Histology of spinal cord tissues in EAE-inflicted mice

2.3MP影響EAE模型鼠脊髓細胞因子mRNA表達 實時熒光PCR方法檢則結果發(fā)現(xiàn)，MP組小鼠脊髓促炎性細胞因子IFN-γ，IL-17，IL-21及IL-23明顯下降，分別為溶媒組的33.32%，8.08%，36.03%及48.61%，而抑炎性細胞因子IL-5，IL-4及IL-10明顯升高，分別為溶媒組的2.39，5.98及1.77倍，差別具有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05，圖3A)。

2.4MP抑制Th1/Th17特異性譜系轉錄因子mRNA水平及蛋白表達 與溶媒組比較，MP組Th1細胞特異性譜系轉錄因子T-bet和Th17細胞特異性轉錄因子孤核受體RoRγt的mRNA表達，分別下降了68%和52.5%(n=3，P<0.05，圖3B)，蛋白水平分別下降了71%和73%(n=3，P<0.05，圖4)。

n=3. MP:甲基強的松龍； EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎. A：細胞因子mRNA相對表達量； B：轉錄因子T-bet和RoRγt mRNA表達量. 與溶媒組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.圖3 甲基強的松龍對EAE鼠脊髓細胞因子和轉錄因子mRNA表達的影響Fig 3 The expression of cytokines and transcription factors mRNA in spinal cords after MP treatment

2.5MP下調EAE模型鼠脊髓ERK1/2及NF-κB蛋白磷酸化水平 溶媒組小鼠較對照組小鼠脊髓pERK1/2和pNF-κB蛋白表達增高，分別為對照組的2.27及2.29倍(n=4，P<0.05，圖5)。MP處理后，小鼠脊髓中pERK1/2及pNF-κB明顯下降，分別下降了67.5%及61.1%(n=4，P<0.05)。

3 討 論

MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病，其發(fā)病機制復雜多樣。目前針對MS的治療主要以減輕患者惡化期的癥狀、縮短病程、改善殘疾程度及防止并發(fā)癥為主要目標。短期大劑量糖皮質激素治療可促進MS患者急性發(fā)病期的神經(jīng)功能恢復，但其作用機制仍未完全闡明[8-9]。

n=3. MP:甲基強的松龍； EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎. A：轉錄因子蛋白印跡圖； B：T-bet相對蛋白表達量； C：RoRγt相對蛋白表達量. 與對照組比較，#：P<0.05；與溶媒組比較，☆：P<0.05.圖4 甲基強的松龍對EAE鼠脊髓轉錄因子蛋白表達的影響Fig 4 The expression of cytokines and transcription factors in spinal cords after MP treatment

n=3. MP:甲基強的松龍； EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎. A：pERK1/2及pNF-κB蛋白印跡圖； B：pERK1/2相對蛋白表達量； C：pNF-κB相對蛋白表達量. 與對照組比較，#：P<0.05； 與溶媒組比較，☆：P<0.05.圖5 甲基強的松龍抑制EAE鼠pERK1/2和pNF-κB蛋白表達Fig 5 MP inhibited the pERK1/2-NF-κB signaling pathway

本研究通過建立MS動物模型——EAE鼠模型，待EAE出現(xiàn)臨床癥狀時，給予人工合成的中效糖皮質激素(MP)治療，模擬臨床急性發(fā)病MS患者用藥，在體研究MP的可能作用靶點，以期進一步指導臨床治療。研究發(fā)現(xiàn)，MP可改善EAE鼠的臨床神經(jīng)功能評分，減輕脊髓炎性細胞浸潤及髓鞘脫失，7 d后撤除MP，小鼠臨床癥狀未出現(xiàn)復發(fā)，提示MP具有減輕炎癥反應及髓鞘損傷的作用。

MS最重要的發(fā)病機制是免疫失衡[10-11]。目前普遍認為，Th1通過分泌IFN-γ等細胞因子參與MS和EAE的致病過程，而Th2細胞分泌的IL-10及IL-4具有抗炎作用，對MS和EAE的病理發(fā)展有保護作用。近年發(fā)現(xiàn)一種高度致炎性細胞因子IL-17，主要由Th17細胞分泌，Th17細胞與Th1細胞共同參與EAE發(fā)生發(fā)展[12-13]。IFN-γ及IL-17協(xié)助致炎性T細胞通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)，導致自身免疫反應，募集更多效應細胞，擴大炎癥反應，促進淋巴毒素或腫瘤壞死因子等炎質介質釋放，引起髓鞘廣泛脫失[14-15]。本實驗顯示，EAE小鼠脊髓的IFN-γ及IL-17明顯高于對照組，證實Th1/Th17與EAE病情的嚴重程度密切相關。小鼠發(fā)病后給予MP治療，脊髓致炎性細胞因子IFN-γ，IL-17，IL-21及IL-23 mRNA表達水平明顯降低，抑炎性細胞因子IL-4，IL-5及IL-10 mRNA表達水平升高。同時Th1/Th17細胞特異性譜系轉錄因子T-bet/RoRγt mRNA及蛋白表達降低。提示MP可能影響EAE小鼠脊髓中T淋巴細胞分化，下調致炎性細胞因子釋放，上調抑炎性細胞因子，起免疫調節(jié)作用。

本研究中，MOG35-55誘導EAE發(fā)病后，小鼠脊髓中pNF-κB及pERK1/2表達顯著增高，與小鼠神經(jīng)功能障礙、脊髓病理損傷密切相關。MP治療后，pNF-κB及pERK1/2表達明顯下降，且與小鼠神經(jīng)功能及脊髓病理損傷改善一致。因此，推測pERK1/2由胞質轉位到核內，進而介導NF-κB等轉錄因子活化，促進T淋巴細胞活化增殖，參與細胞內多種反應，可能與T細胞相關免疫性疾病的治療有關。MP對ERK1/2-NF-κB的抑制作用可能是其抗炎的主要機制之一。

綜上所述，MP可能通過抑制ERK1/2-NF-κB信號通路，下調Th1/Th17產(chǎn)生的致炎細胞因子，上調Th2產(chǎn)生的抑炎細胞因子，從而改善EAE神經(jīng)功能評分，減輕脊髓炎性細胞浸潤及髓鞘脫失。