不同產(chǎn)地和不同環(huán)境生長(zhǎng)的金線蓮的ISSR遺傳特性分析

趙會(huì)賢， 黃宛禎， 黃麗英

金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.]為蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生草本植物，別名金線蘭、金線草等，主要分布在福建、浙江、云南和臺(tái)灣等地區(qū)[1]。民間以全草入藥，被視為珍稀名貴藥材,享有“藥王”、“金草”等美稱[2]。近年來(lái)的研究表明，金線蓮主要含有黃酮類、核苷類、多糖類、生物堿、微量元素等幾大類物質(zhì)[3]，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值日漸受到重視，因而造成了人為的過(guò)度采摘，加上其對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，野生金線蓮資源現(xiàn)已瀕臨滅絕[4]。更有不法商家用斑葉蘭或其他廉價(jià)蘭科植物冒充金線蓮以換取高額利潤(rùn)。因而，迫切需要一種可以用于鑒別金線蓮的技術(shù)手段[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在中藥學(xué)領(lǐng)域逐漸滲透與發(fā)展[6]，基于分子標(biāo)記的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphism DNA,RAPD)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)(inter-simple sequence repeat,ISSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)等鑒定方法已成為中藥四大鑒定方法的重要補(bǔ)充[7-10]。ISSR是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和電泳為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，不需要再?gòu)?fù)雜地構(gòu)建基因文庫(kù)、雜交和同位素顯示等步驟，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單快速,多態(tài)性高，重復(fù)性好[11]。

目前，關(guān)于金線蓮ISSR分子標(biāo)記的研究?jī)H見(jiàn)3篇文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]，且多是對(duì)金線蓮的產(chǎn)地或與近緣種植物的差異性進(jìn)行研究。本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)來(lái)自福建省內(nèi)不同種類、不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)方式的金線蓮進(jìn)行研究，嘗試從分子水平上對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)探討組織培養(yǎng)的金線蓮、種植金線蓮和野生金線蓮的遺傳特性差異。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本 20份樣本材料均于2017年3-4月購(gòu)自福建省內(nèi)的不同地區(qū)，經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)學(xué)系張永紅教授鑒定為金線蓮藥材。取樣時(shí)，均選取健康無(wú)病蟲害植株頂端的前三片嫩葉作為實(shí)驗(yàn)材料。樣本信息及編號(hào)如表1所示：

表1 不同金線蓮供試材料

1.1.2主要試劑 液氮；植物基因組DNA提取試劑盒(批號(hào)：DP022，GeneMark)；酶、堿基等混合物Premix TaqTM(批號(hào)：RR901A，日本Takara公司)；核酸染料Gold view(批號(hào)：DH392-5，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；DNA Marker(300～5 000 bp，批號(hào)：111108-50，北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)；100 bp梯度DNA Marker(100～3 000 bp，批號(hào)：SM0321,Thermo Scientific)。

1.1.3主要儀器 渦旋震蕩儀(IKA Vortex Genius 3，杭州雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Neofuge18R，力康發(fā)展有限公司)；電子天平(BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；超微量分光光度計(jì) (Nanodrop2000 Spectrophotometer，Thermo Scientific)；PCR擴(kuò)增儀(T100TM Thermal Cycler，美國(guó)BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+，美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測(cè) 選用植物基因組DNA提取試劑盒分別提取20個(gè)樣本的DNA。用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量、大小和完整性，保存于-20℃冰箱中備用。濃度及純度檢測(cè)結(jié)果如表2所示：20份樣本材料的基因組DNA的純度值A(chǔ)260/280近似分布在1.7～1.9，符合實(shí)驗(yàn)需求[12]，可用于后續(xù)操作。

1.2.2PCR引物工作液的制備 根據(jù)哥倫比亞大學(xué)公布的96條ISSR引物序列，參考文獻(xiàn)[13-15]，優(yōu)選出30條，由上海生工公司合成。將30條引物干粉經(jīng)高速冷凍離心機(jī)(5 000 r/min，25 ℃,10 min)離心后小心開(kāi)蓋，按照瓶身標(biāo)注加入指定體積的ddH2O，制備30種引物的工作液，使其濃度均為10 μmol/L。

1.2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的優(yōu)化 參照文獻(xiàn)[12,16]，設(shè)計(jì)針對(duì)本實(shí)驗(yàn)的流程及參數(shù)。優(yōu)選出18號(hào)金線蓮樣本的基因組DNA，對(duì)ISSR-PCR體系中的模板和引物加入量、反應(yīng)體積、反應(yīng)循環(huán)數(shù)、退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)使用Premix Taq溶液，使用時(shí)只需在制品溶液中加入模板和引物便可進(jìn)行PCR反應(yīng)。優(yōu)化的最終條件為：反應(yīng)體積25 μL，其中包括模板DNA 1 μL(約40 ng)，引物1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 10.5 μL，2×Premix Taq 12.5 μL。

表2供試材料的基因組DNA濃度及純度

Tab2The genomic DNA concentration and purity of the tested samples

編號(hào)100 μL洗脫液定容ρDNA(μg·mL-1)純度A260/28050 μL洗脫液定容ρDNA(μg·mL-1)純度A260/280135.51.8169.31.77242.31.7878.21.77334.31.7774.11.80427.71.7766.11.76529.71.7862.81.74644.91.7588.51.79751.31.7987.21.80843.01.7792.71.81937.21.8157.31.821029.41.8264.41.801160.91.75120.11.851237.51.7461.41.781341.01.7793.91.801441.01.7872.41.761553.21.8298.71.831671.51.76136.41.801743.41.7579.91.801834.71.7465.71.741966.31.72111.31.732052.61.6690.01.69

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s→50～55 ℃退火30 s→72 ℃延伸40 s；循環(huán)40次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存[17]。

ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 按照優(yōu)化出的反應(yīng)體系擴(kuò)增20個(gè)樣本材料。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳成像后，最終篩選出15條多態(tài)性好，穩(wěn)定性高、擴(kuò)增條帶清晰的引物進(jìn)行ISSR遺傳分析，見(jiàn)表3。選擇0.5×TBE電泳緩沖液，在1.7%瓊脂糖凝膠電泳上加入15 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)以300～5 000 bp和100 bp梯度兩種分子量標(biāo)準(zhǔn)作為擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量標(biāo)記，凝膠中含有5% Gold view核酸染料。100 V電壓，電泳1.5 h，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照。引物UBC811的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

圖1 引物UBC811對(duì)20個(gè)樣本的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig 1 ISSR-PCR amplification results of 20 samples by primer UBC811

2 結(jié) 果

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性統(tǒng)計(jì) 根據(jù)20個(gè)樣本的ISSR-PCR凝膠電泳圖，每個(gè)清晰可辨的條帶代表一個(gè)變異，在相同遷移位置上，有條帶的計(jì)為1，無(wú)帶的計(jì)為0，構(gòu)建擴(kuò)增位點(diǎn)矩陣。15個(gè)引物共擴(kuò)增出130條帶，每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)如表3所示。

表3 15種引物的堿基序列及擴(kuò)增條帶數(shù)

2.2遺傳相似系數(shù)和聚類關(guān)系分析 用NTSYS-Pc 2.1和POPGENE32聚類軟件，非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，得到樣本間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離矩陣如表4所示。由表4可知，19和20號(hào)樣本間遺傳相似系數(shù)為1，遺傳距離為0，其余金線蓮樣本材料間遺傳相似系數(shù)在0.647 6～0.971 4范圍內(nèi)變化，遺傳距離在0.029 0～0.434 5范圍內(nèi)變化。其中3號(hào)和4號(hào)樣本遺傳相似系數(shù)最大，為0.971 4；遺傳距離最小，為0.029 0，表明二者之間具有較近的親緣關(guān)系。13號(hào)樣本(南靖習(xí)禮尖葉組培金線蓮)與19和20號(hào)樣本(三明永安野生金線蓮)遺傳相似系數(shù)最小，為0.647 6，遺傳距離最大，為0.434 5，說(shuō)明13號(hào)樣本與二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

基于ISSR-PCR擴(kuò)增位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)矩陣，選用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建福建金線蓮樣本間聚類關(guān)系如圖2所示。用POPGENE 32軟件分析得：平均觀察等位基因數(shù)為1.619 0，平均有效等位基因數(shù)為1.374 8，平均Nei's遺傳多樣性指數(shù)為0.215 9，平均Shannon信息指數(shù)為0.322 0，多態(tài)性比率為61.90%[18]，擴(kuò)增條帶的分子量大多位于300～2 000 bp。聚類分析結(jié)果最低相似系數(shù)為0.73，最高相似系數(shù)為1。當(dāng)相似系數(shù)取0.78時(shí)，可將20個(gè)金線蓮樣本分為3類。

UPGMA：非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法.圖2 供試樣本間UPGMA聚類關(guān)系圖Fig 2 The UPGMA clustering map of the tested samples

3 討 論

對(duì)PCR反應(yīng)體系優(yōu)化時(shí)，選取每一類別中具有代表性的樣本，與優(yōu)選的引物在初始條件下進(jìn)行擴(kuò)增，最終擴(kuò)增效果最佳的為18號(hào)金線蓮樣本和UBC811引物。在此條件下，篩選出15種ISSR引物對(duì)20份樣本材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，通過(guò)提取高純度的基因組DNA、優(yōu)化最佳的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序、統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)，最終獲得樣本間的遺傳相似系數(shù)和親緣關(guān)系圖。結(jié)果表明，相同種類、相同產(chǎn)地的金線蓮大多可以聚為一個(gè)類群，且二者對(duì)樣本間遺傳差異性的影響超過(guò)由生長(zhǎng)方式引起的差異。如聚類關(guān)系圖中的第一類，其中1，2，7，8，17號(hào)樣本均是種類為紅霞的金線蓮，表明同一個(gè)種類的樣本具有較近的親緣關(guān)系；第二類為標(biāo)號(hào)為3，4，5，6，10，11，12 的樣本類群主要是產(chǎn)地為三明永安的金線蓮。11和12號(hào)樣本雖購(gòu)自南靖，但根據(jù)廠家提供的信息，二者均源自三明，因而劃分為同一類群也屬合理。其中的3號(hào)金線蓮為組織培養(yǎng)樣本，4號(hào)金線蓮為林下種植樣本，二者遺傳相似系數(shù)最大，遺傳距離最小，具有最近的親緣關(guān)系。生物的遺傳是基因型和自然環(huán)境長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果，這表明經(jīng)組織培養(yǎng)的金線蓮在長(zhǎng)期的生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了適應(yīng)能力，使得生長(zhǎng)方式對(duì)其遺傳變異的影響逐漸減弱。第三類中的19和20號(hào)樣本均為三明永安野生金線蓮，分析結(jié)果顯示二者相似系數(shù)接近于1，其形態(tài)學(xué)主要區(qū)別為葉片有無(wú)明顯的金色葉脈，推測(cè)二者最初可能源自同一個(gè)品系，后來(lái)表達(dá)了不同的表型性狀，這也表明本實(shí)驗(yàn)采取的分析方法具有較高的實(shí)用性和可信性。

ISSR技術(shù)作為一種鑒別種質(zhì)資源親緣關(guān)系的有效和實(shí)用工具，具有較高的多態(tài)性。金線蓮作為一種名貴中草藥，福建是其主要產(chǎn)區(qū)，省內(nèi)種植戶相對(duì)較多。本研究采用ISSR技術(shù)進(jìn)行金線蓮的遺傳特性研究，對(duì)于日后福建省金線蓮的培育種植、資源保護(hù)、藥物開(kāi)發(fā)及藥材市場(chǎng)的治理都具有重要的意義，同時(shí)也為野生金線蓮資源瀕臨滅絕的現(xiàn)狀提供了新的思路。后期將在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究不同種類、產(chǎn)地及生長(zhǎng)方式對(duì)金線蓮中一些重要化學(xué)成分和藥效的影響。