羊肚菌多糖提取、分離純化及免疫調(diào)節(jié)活性

黃 瑤，蔣 琳，劉 影，劉 露，侯怡鈴，丁 祥

(1. 西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2. 西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

羊肚菌(Morehellaesculenta)隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)盤菌綱(Discomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，因其酷似羊肚，從而得名羊肚菌[1]。野生羊肚菌，子實(shí)體個(gè)頭中等或偏小，菌蓋橢圓形且表面類似蜂窩狀，頂端鈍圓，菌柄近白色，味道鮮美，是很好的食用和藥用真菌[2-3]。

真菌多糖主要是從真菌的子實(shí)體、菌絲體等中提取出來的一種生物多糖，在抗菌、抗腫瘤等方面有重要作用[4]。真菌多糖結(jié)構(gòu)對(duì)其活性的影響很大，通常多糖活性好的，其結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜[5]。目前對(duì)于羊肚菌多糖的研究集中在抗腫瘤和抗氧化兩方面[6-9]，但對(duì)羊肚菌多糖免疫方面的活性報(bào)道甚少，因此，本研究主要集中在探究羊肚菌多糖對(duì)免疫細(xì)胞的活性影響，對(duì)后續(xù)羊肚菌多糖的免疫調(diào)節(jié)通路提供理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，筆者以四川省小金縣的野生羊肚菌為研究材料，采用熱水浸提法、DEAE-纖維素層析法得到羊肚菌多糖，通過高效凝膠滲透色譜(HPGPC)和傅里葉紅外光譜技術(shù)(FT-IR)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并對(duì)羊肚菌多糖的免疫調(diào)節(jié)能力初步探究，以期為羊肚菌的藥用價(jià)值研究提供一定的理論支撐。

1 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羊肚菌子實(shí)體，由西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DFT-150型高速萬能粉碎機(jī)，上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司；AR2130型電子天平、WBK-3B型電熱恒溫水浴鍋，上海奧豪斯儀器有限公司；Spring-K40型超純水儀，重慶艾科浦公司；KE-6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；Epoch 酶標(biāo)儀，美國(guó)基因有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱， Thermo 公司；SE-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；96 孔微量培養(yǎng)板，上海凌初環(huán)保儀器有限公司；DMI 3000型倒置熒光顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；HPGPC 220高效凝膠色譜儀，美國(guó)Aglient公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

本實(shí)驗(yàn)涉及的實(shí)驗(yàn)藥品均為分析純。無水乙醇(95%)，安徽安特生物化學(xué)有限公司；NaOH、HCl、濃H2SO4、苯酚和NaCl，四川生工科技有限公司；DEAE-纖維素，生興生物技術(shù)(南京)有限公司；CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(A cell counting kit)，上海碧云天生物技術(shù)研究所；磷酸鹽酸緩沖液(PBS)，自制；RPMI1640 培養(yǎng)基、0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司；胎牛血清、雙抗， Clark Bioscience ；小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、淋巴細(xì)胞B、淋巴細(xì)胞T，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌多糖的提取

稱取干燥后的羊肚菌子實(shí)體200.0 g，放于95%乙醇中浸泡24 h(除去多酚及少量的蛋白質(zhì)等)，烘干備用。用粉碎機(jī)將烘干的羊肚菌子實(shí)體粉碎后，于裝有適量蒸餾水的90 ℃水浴鍋中煮6 h(不斷攪拌)，煮3次[10]；12 000 r/min離心后將上清液合并收集(約2 000 mL)，高溫濃縮至200 mL，加入4倍體積的無水乙醇[11]，用玻璃棒攪拌直到產(chǎn)生絮狀沉淀，再次12 000 r/min離心收集沉淀，干燥后得到羊肚菌粗多糖[12]。

1.2.2 羊肚菌多糖的分離純化

采用DEAE-纖維素柱層析法和透析法對(duì)羊肚菌粗多糖進(jìn)一步分離純化[13-14]。將烘干后的羊肚菌粗多糖加入適量的蒸餾水使其充分溶解，約150 mL離心待用；電子天平稱取50.0 g DEAE cellulose 52色譜填料樹脂[15]，并將其活化待用；配制不同濃度的NaCl溶液(0、 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L)作為洗脫液待用；配制0.5 mol/L的NaOH和0.5 mol/L的HCl溶液備用；將活化好的纖維素輕輕倒入玻璃柱中，靜置12 h讓纖維素自然沉淀。靜置完成后，沿壁緩緩加入5 mL多糖溶液，依次用不同濃度的洗脫液過柱，用試管收集洗脫液(每管10 mL)并用硫酸苯酚法檢測(cè)[16]，繪制洗脫曲線，合并含多糖的洗脫液濃縮后，用截留分子量為7 000的透析袋透析，濃縮干燥后得到的固體樣品即羊肚菌多糖，命名為ME-X。

1.2.3 ME-X分子量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17-18]采用HPGPC對(duì)ME-X純度進(jìn)行鑒定，同時(shí)測(cè)定其分子量。精確稱取5.0 mg ME-X樣品，在1 mL重蒸水中充分溶解，超聲5 min，用HPGPC 220高效凝膠色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的數(shù)據(jù)用凝膠色譜(GPC)軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 ME-X的紅外光譜分析

采用KBr壓片法，稱取干燥的ME-X樣品5.0 mg于研缽，加入適量KBr粉末充分碾碎后壓片，在傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)400～4 000 cm-1的范圍檢測(cè)[19]。

1.2.5 ME-X對(duì)淋巴細(xì)胞T和B及RAW264.7細(xì)胞的增殖作用

用CCK-8(cell counting kit)法檢測(cè)ME-X對(duì)淋巴細(xì)胞T和B及RAW264.7細(xì)胞的增殖效果[20-21]，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞，將其細(xì)胞密度稀釋至1.0×105個(gè)/mL，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL細(xì)胞稀釋液，邊緣的孔加入200 μL PBS緩沖液，保持無菌水環(huán)境的同時(shí)可消除邊緣效應(yīng)。在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的ME-X溶液[22-23](終質(zhì)量濃度為1.25、5、10和20 μg/mL)，陽性對(duì)照組中每孔加入100 μL的脂多糖(LPS)溶液[24-25](終質(zhì)量濃度為10 μg/mL)，空白對(duì)照組中則加入等體積的完全培養(yǎng)液。在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8溶液5 μL放于培養(yǎng)箱孵育3 h后，拍照，并用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光值(A450)[26]。將吸光值轉(zhuǎn)換為增殖率，并繪制以增殖率為縱坐標(biāo)、ME-X濃度為橫坐標(biāo)的曲線。按式(1)計(jì)算細(xì)胞增殖率。

(1)

式中：P為細(xì)胞增殖率，%；A1為空白對(duì)照組孔的平均吸光度值；A2為實(shí)驗(yàn)組孔的平均吸光度值;實(shí)驗(yàn)組即為陽性對(duì)照組和4個(gè)ME-X藥物組。

1.2.6 ME-X對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響

選取對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞，將其細(xì)胞密度稀釋至1.0×105個(gè)/mL，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL細(xì)胞稀釋液，邊緣的孔加入200 μL PBS緩沖液，保持無菌水環(huán)境的同時(shí)可消除邊緣效應(yīng)。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的ME-X溶液[22-23](終質(zhì)量濃度為1.25、5、10和20 μg/mL)，陽性對(duì)照組中每孔加入100 μL的LPS溶液[24-25](終質(zhì)量濃度為10 μg/mL)，空白對(duì)照組中則加入等體積的完全培養(yǎng)液。在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用移液槍移除上清液，每孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.075%中性紅溶液，恒溫培養(yǎng)箱中吞噬15 min。棄中性紅，并用200 μL預(yù)冷的PBS清洗3次，最后每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液(乙醇與乙酸體積比為1∶ 1，現(xiàn)配現(xiàn)用)，在培養(yǎng)箱中37 ℃下裂解2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)540 nm處吸光值A(chǔ)540，將吸光值轉(zhuǎn)換為吞噬率，并繪制以吞噬率為縱坐標(biāo)、ME-X濃度為橫坐標(biāo)的曲線[27]。按式(2)計(jì)算細(xì)胞吞噬率。

(2)

1.2.7 統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均用Mean±SD表示，用t-test檢驗(yàn)差異的顯著性，與對(duì)照組對(duì)比顯著以*表示(P<0.05)，極顯著以**表示(P<0.01)。

2 結(jié)果與討論

2.1 羊肚菌多糖的提取及分離純化

200 g羊肚菌子實(shí)體采用熱水浸提法和醇沉法后得到粗多糖40 g，得糖率20%。采用DEAE cellulose-52色譜柱，用不同濃度的NaCl溶液作為流動(dòng)洗脫相，洗脫曲線如圖1所示。由圖1可知：除0.1 mol/L NaCl洗脫時(shí)出現(xiàn)一個(gè)較大的洗脫峰外，其他洗脫液段均未出現(xiàn)洗脫峰，說明只有0.1 mol/L NaCl洗脫液含真菌多糖。收集所有0.1 mol/L NaCl段的多糖溶液，濃縮干燥后得到的固體樣品即羊肚菌多糖，命名為ME-X。

圖1 ME-X的DEAE cellulose-52色譜柱層析洗脫曲線Fig.1 Chromatogram of ME-X on a DEAE-cellulose 52 column

2.2 ME-X高效凝膠滲透色譜(HPGPC)結(jié)果

采用HPGPC對(duì)ME-X的純度進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，ME-X的HPGPC洗脫曲線中有1個(gè)較高對(duì)稱峰，且峰較高峰面積較寬，提示ME-X是一種比較純的生物多糖，其重均分子量(Mw)為16 348，數(shù)均分子量(Mn)為13 050；峰值分子量(MP)為16 348；Z均分子量(MZ)為1 089 260；Z+1均分子量(MZ+1)為2 166 652。

圖2 ME-X的HPGPC洗脫曲線Fig.2 Chromatogram of ME-X on HPGPC

2.3 ME-X的FT-IR分析

圖3 ME-X的紅外分析圖Fig.3 FT-IR spectra of ME-X

2.4 ME-X的免疫增殖作用

2.4.1 ME-X對(duì)淋巴細(xì)胞T增殖的影響

淋巴細(xì)胞T是由部分骨髓干細(xì)胞遷移至胸腺后分化成熟的，具有免疫活性的細(xì)胞，簡(jiǎn)稱T細(xì)胞，主要參與機(jī)體的細(xì)胞免疫[30]。ME-X刺激后T細(xì)胞增殖效果如圖4所示。由圖4可知：與空白對(duì)照組相比，ME-X藥物組與脂多糖(LPS)陽性對(duì)照能顯著地促進(jìn)T細(xì)胞增殖，并呈一定的劑量關(guān)系。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)，其增殖率和藥物濃度成正相關(guān)；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，增殖率最高為31.18%，表明該濃度的ME-X對(duì)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖效果最好；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度在20 μg/mL時(shí)，其增殖率隨藥物濃度升高反而有所下降。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對(duì)照組比圖4 ME-X對(duì)T細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of ME-X on the proliferation of T cell

T細(xì)胞的增殖形態(tài)如圖5所示。隨著ME-X濃度的增大，細(xì)胞加速分裂，成團(tuán)變大。在用10 μg/mL的ME-X刺激T細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞成團(tuán)最大且最多。

圖5 ME-X對(duì)T細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of ME-X on the cell morphology of T cell

2.4.2 ME-X對(duì)淋巴細(xì)胞B增殖的影響

淋巴細(xì)胞B簡(jiǎn)稱B細(xì)胞，來源于骨髓的多功能干細(xì)胞，能夠分泌抗體，是體液免疫的主要介質(zhì)[31]。B細(xì)胞的增殖效果如圖6所示，陽性對(duì)照組為10 μg/mL的LPS，ME-X質(zhì)量濃度為1.25、5、10和20 μg/mL。由圖6可知：與空白對(duì)照組相比，藥物組增殖效果均達(dá)到極顯著，當(dāng)ME-X多糖質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL時(shí)，其增殖率達(dá)到49.60%；當(dāng)ME-X多糖質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，其增殖率最高，達(dá)到63.02%。同時(shí)LPS陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，也具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其增殖效果比藥物組差很多，其增殖率僅19.62%。

B細(xì)胞增殖形態(tài)如圖7所示，正常狀態(tài)的B細(xì)胞呈圓形，懸浮并集簇生長(zhǎng)，但成團(tuán)細(xì)胞數(shù)較少；經(jīng)ME-X刺激后，細(xì)胞增殖明顯加快，細(xì)胞數(shù)量顯著升高，且成團(tuán)細(xì)胞又大又多。

圖7 ME-X對(duì)B細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.7 Effects of ME-X on the cell morphology of B cell

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對(duì)照組比圖6 ME-X對(duì)B細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effects of ME-X on the proliferation of B cell

2.4.3 ME-X的對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響

巨噬細(xì)胞來源于血液中的單核細(xì)胞，是一種具有多種功能的免疫細(xì)胞，可參與機(jī)體先天性免疫和細(xì)胞免疫[32]。本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用CCK-8法檢測(cè)ME-X對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：當(dāng)加藥(ME-X和LPS)刺激時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖效果為極顯著(P<0.01)；細(xì)胞增殖對(duì)藥物劑量具有一定依賴性，當(dāng)ME-X質(zhì)量濃度僅為1.25 μg/mL時(shí)，測(cè)得的增殖率達(dá)到51.44%；值得注意的是，ME-X質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖效果最佳，增殖率達(dá)63.12%。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對(duì)照組比圖8 ME-X對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響Fig.8 Effects of ME-X on the proliferation of RAW264.7 cell

圖9 ME-X對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.9 Effects of ME-X on the cell morphology of RAW264.7 cell

ME-X刺激巨噬細(xì)胞增殖形態(tài)如圖9所示。由圖9可見：空白對(duì)照組細(xì)胞較少，幾乎為圓形，分散生長(zhǎng)；在ME-X的刺激下，巨噬細(xì)胞快速增殖分裂，細(xì)胞體積變大，不同程度伸出偽足，細(xì)胞數(shù)量明顯增多。說明ME-X能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖。

2.5 ME-X對(duì)巨噬細(xì)胞(RAW264.7)吞噬中性紅能力的影響

在ME-X刺激下，巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力如圖10所示。由圖10可知：在低濃度ME-X和LPS作用下，RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅的能力顯著提高；隨著藥物濃度加大，吞噬效果顯著加強(qiáng)，并且和藥物濃度呈正相關(guān)；值得注意的是，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)，吞噬率最大，為22.49%，表明該濃度下RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅的能力最強(qiáng)。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對(duì)照組比圖10 不同濃度的ME-X對(duì)RAW264.7 細(xì)胞吞噬中性紅的影響Fig.10 Effects of different concentration ME-X on neutral red phagocytosis of RAW264.7 cells

3 結(jié)論

國(guó)內(nèi)對(duì)多糖的研究雖然開始比較晚，但隨著各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，對(duì)真菌多糖的提取、分離純化工藝的研究越來越成熟，為后續(xù)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性以及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究以四川省小金縣野生羊肚菌為對(duì)象，用熱水浸提法，DEAE-cellulose column柱層析法等分離純化后得到多糖ME-X。分別用ME-X刺激T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞并探究其增殖效果，同時(shí)用中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而探究ME-X的免疫活性。

傅里葉紅外光譜和HPGPC結(jié)果顯示，ME-X含有多糖的特征峰，且其重均分子量為1.635×104；ME-X能顯著提高免疫細(xì)胞增殖，且對(duì)ME-X濃度具有一定的依賴性。當(dāng)ME-X質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，淋巴細(xì)胞T、B的增殖效果最佳，增值率分別為31.18%、63.02%；當(dāng)ME-X質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞增殖效果最佳，增值率為63.12%，同時(shí)該濃度刺激巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力也最強(qiáng)，吞噬率為22.49%。

綜上，ME-X作為一類生物大分子，是一種很好的免疫調(diào)控資源。但是關(guān)于ME-XD具體化學(xué)結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)控作用的相關(guān)分子機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。