棉花腈水解酶基因GhNIT響應(yīng)非生物脅迫和激素的表達(dá)分析

潘澤，李鴻彬

生長素是植物體內(nèi)重要的激素之一，其在細(xì)胞內(nèi)的合成對于植物的整體生長發(fā)育、不同器官的發(fā)育以及植物響應(yīng)脅迫非常重要[1-5]。在植物細(xì)胞內(nèi)，吲哚 -3-乙酸（Indole-3-cetic cid，IAA）是生長素的主要存在形式，其合成主要通過色氨酸依賴型和非色氨酸依賴型兩種途徑[6-7]。腈水解酶（Nitrilase，NIT）在不同的合成途徑中起到關(guān)鍵作用，不僅是催化色氨酸依賴型的IAA合成途徑的關(guān)鍵步驟，也有可能是非色氨酸依賴型的IAA生物合成的關(guān)鍵酶[8]。研究表明：擬南芥中有4個腈水解酶基因NIT1-NIT4，該基因家族編碼一個小分子蛋白用于催化吲哚-3-乙腈（Indole-3-acetonitrile，IAN）轉(zhuǎn)化為植物激素 IAA[9]。

生長素在局部和遠(yuǎn)側(cè)均可發(fā)揮作用，生長素的局部效用由其局部合成、結(jié)合和降解速率以及其轉(zhuǎn)運(yùn)位點決定，這對于植物生長和響應(yīng)環(huán)境有重要的意義[4，10]。除了NIT外，在擬南芥中也已經(jīng)鑒定出幾個色氨酸依賴型生長素合成酶包括SUR1[11]，SUR2[12]細(xì)胞色素P450、CYP79B2/B3[13-14]和黃素單加氧酶YUCCA(YUC)[15]。黃素單加氧酶（Flavin-containing monooxygenases，F(xiàn)MO）的突變分析表明YUCCA家族基因在局部生長素合成中具有相同的功能，且YUCCA家族基因的表達(dá)對于植物不同器官的發(fā)育以及植物響應(yīng)脅迫非常重要[5，10]。此外，早期研究表明，外源施加生長素延緩豆類植物葉片脫落[16-17]，生長素可以刺激如乙烯（Ethylene）和脫落酸（ABA）等促使植物衰老的激素的合成[18-19]。

目前，關(guān)于棉花GhNIT基因響應(yīng)非生物脅迫和激素的表達(dá)研究鮮有報道，本研究在前期獲得棉花腈水解酶基因GhNIT的基礎(chǔ)上，分析了該基因參與纖維發(fā)育和各組織器官發(fā)育的表達(dá)特征，克隆獲得該基因的啟動子并進(jìn)行了順式作用元件分析，通過qRT-PCR和RT-PCR檢測，并分析GhNIT基因響應(yīng)非生物脅迫和植物激素時的表達(dá)特征，從而為進(jìn)一步研究GhNIT基因參與棉纖維發(fā)育的功能及其通過催化生長素IAA的合成調(diào)控植物生長發(fā)育的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花品種為陸地棉徐州142。以栽培于石河子大學(xué)實驗場試驗田的陸地棉為材料，采摘開花后0、3、5、10、15、20、25 和 30d 的棉桃，剝離收集纖維并凍存于-80℃?zhèn)溆?；收集開花后3 d的陸地棉根，莖，葉，花和花藥凍存于-80℃保存，用于RNA提取及后續(xù)的基因表達(dá)分析。

1.2 方法

1.2.1 GhNIT基因啟動子序列分析

選取棉花GhNIT基因翻譯起始位點上游1500 bp的核苷酸序列，利用 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 在線預(yù)測軟件預(yù)測順式作用元件。

1.2.2 非生物脅迫和激素處理棉花幼苗

選取在植物培養(yǎng)室（28℃，16 h光照/8 h黑暗）條件下正常生長6周左右的陸地棉幼苗進(jìn)行如下處理：對于光照處理，先使幼苗生長于16 h光/16 h暗條件下，之后持續(xù)光照24 h；對于不同溫度處理，分別將幼苗放至42℃和4℃下培養(yǎng)；對于干旱處理：利用20%PEG灌溉幼苗；對于氧化脅迫和植物激素處理；分別利用 1 mmol/L H2O2、10 μmol/L赤霉素（GA）和10 μmol/L IAA噴施幼苗葉片。分別收集上述處理不同時間段的幼苗葉片（n=3）凍存于-80℃待用。

1.2.3 RNA的提取與cDNA的合成

用植物RNA提取試劑盒提取上述收集的試驗材料的總RNA。以獲得的總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.4 GhNIT基因的表達(dá)分析

以獲得的cDNA為模板，借助qRT-PCR和RT-PCR檢測GhNIT基因在不同組織中以及響應(yīng)非生物脅迫和激素時的表達(dá)。以棉花GhUBQ7基因作為內(nèi)參，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表1所示。qRT-PCR結(jié)果用Multi Experiment Viewer(MeV)軟件來制作和表示，RT-PCR結(jié)果以瓊脂糖凝膠電泳顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhNIT基因的組織特異性表達(dá)分析

通過RT-PCR和qRT-PCR分析GhNIT基因在棉纖維不同發(fā)育時期和不同組織的特征。結(jié)果（圖1）顯示：GhNIT基因在棉花開花后15 dpa（day post anthesis）和25 dpa的纖維組織中表達(dá)最高；GhNIT基因在棉花其它組織中均有一定表達(dá)，尤其在花瓣、花藥中表達(dá)較高。這暗示GhNIT基因可能在棉纖維的伸長發(fā)育和開花過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 GhNIT基因的順式作用元件分析

對GhNIT基因的啟動子序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示：該啟動子序列具有典型的真核基因啟動子元件（TATA-box和 CAAT-box），還包含脅迫響應(yīng)元件，如光響應(yīng)元件（Box 4、Box Ⅰ、G-box、AE-box、I-box、sp1、GA-motif、CATT-motif、ATCT-motif、TCT-motif）、熱激響應(yīng)元件（HSE）、氧化脅迫元件（ARE）、干旱響應(yīng)元件（MBS）和其他脅迫元件（TC-rich repeats），另外還包含激素響應(yīng)元件，如赤霉素響應(yīng)元件（P-box和GARE-motif）。上述結(jié)果表明非生物脅迫和植物激素可能參與調(diào)控GhNIT基因的表達(dá)。

圖2 GhNIT基因啟動子序列的分析Fig.2 Analysis of the promoter sequence of GhNIT gene

2.3 GhNIT基因響應(yīng)非生物脅迫和植物激素的表達(dá)分析

結(jié)合啟動子分析結(jié)果，本研究利用植物激素和非生物脅迫處理棉花幼苗，通過RT-PCR和qRT-PCR分析GhNIT基因在不同處理下的表達(dá)。結(jié)果（圖 3）顯示：20%PEG、高溫、低溫以及 H2O2顯著誘導(dǎo)GhNIT基因的表達(dá)，尤其是對低溫的響應(yīng)較為迅速，在4℃處理3 h后就具有顯著的誘導(dǎo)表達(dá)（圖3A、B）；當(dāng)黑暗處理16 h再恢復(fù)光照后，GhNIT基因的表達(dá)量逐漸增加，在恢復(fù)光照6 h后具有顯著的高表達(dá)并維持穩(wěn)定（圖3C）；赤霉素處理2 h后促進(jìn)了GhNIT基因的誘導(dǎo)表達(dá)；IAA處理后1 h就能夠顯著誘導(dǎo)GhNIT基因表達(dá)，隨后表達(dá)下降，并在6 h后又顯著上升（圖3D）。這表明GhNIT基因的表達(dá)受非生物脅迫和植物激素赤霉素及生長素的調(diào)控。

圖3 GhNIT基因響應(yīng)非生物脅迫和激素的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of GhNIT gene in response to abiotic stress and plant hormone

3 討論

（1）生長素是植物生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，如調(diào)控花器官和微管組織的形成[5]。有研究表明抑制YUC1和YUC4基因的表達(dá)顯著影響植物開花和維管束的形成[10]，在yuc1yuc2雙突變體中抑制YUC1和YUC4基因的表達(dá)加劇該突變體的開花和維管束形成缺陷表型[10]。擬南芥腈水解酶基因家族的4個密切相關(guān)的同工酶基因NIT1-NIT4在植物不同組織特異性表達(dá)，其中NIT1在蓮座葉中表達(dá)較高；NIT2在角果中表達(dá)較高；NIT3優(yōu)先在根中表達(dá)；而NIT4則在根、莖和角果中表達(dá)較高[9]。

本研究分析了棉花GhNIT基因的表達(dá)特征，其在伸長發(fā)育的棉纖維組織中及花器官中具有較高的表達(dá)（圖1），表明GhNIT基因可能在纖維和花的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

（2）植物體內(nèi)最主要的生長素形式是IAA，生長素合成途徑的遺傳調(diào)控表明生長素的從頭合成對于植物響應(yīng)脅迫非常重要[4]。在避光處理下，擬南芥sav3-2突變體體內(nèi)游離IAA含量沒有變化，而在野生型中游離IAA含量明顯上升，表明生長素合成相關(guān)基因TAA1參與了植物避光誘導(dǎo)下的生長素合成[20]。腈水解酶作為植物非色氨酸依賴型生長素合成的關(guān)鍵酶[8]，調(diào)控著植物細(xì)胞內(nèi)IAA的合成。擬南芥NIT1-NIT4在植物不同發(fā)育時期和不同生長環(huán)境下特異表達(dá)[9]。NIT2在植物感染葉病原體丁香假單胞菌后被特異性誘導(dǎo)表達(dá)，而NIT1、NIT3和NIT4則沒有響應(yīng)病原體的誘導(dǎo)[9]。

本研究中，棉花GhNIT基因的表達(dá)顯著受非生物脅迫和激素GA及IAA的誘導(dǎo)（圖3），表明GhNIT基因的表達(dá)可能與植物對不同逆境的適應(yīng)和響應(yīng)激素信號調(diào)控密切相關(guān)。

4 結(jié)論

NIT是調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)IAA合成的重要催化酶，本研究中棉花GhNIT基因的表達(dá)與纖維和花發(fā)育密切相關(guān)，該基因的啟動子中包含多個脅迫響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件，GhNIT基因的表達(dá)顯著受到非生物脅迫和激素GA及IAA的誘導(dǎo)。本研究結(jié)果可為深入研究腈水解酶調(diào)控植物生長發(fā)育的生物學(xué)功能及參與激素表達(dá)調(diào)控的機(jī)制解析提供參考。