胱硫醚β-合成酶基因844ins68多態(tài)性與新疆漢族乳腺癌的相關(guān)性研究

莫少華 ，劉新權(quán) ，徐春玲 ，張偉 ，程江 ，曹玉文 ，張蕾 *

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2第五師醫(yī)院，新疆 博樂 833400；3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別占全世界的12.2%和9.6%[1]。乳腺癌病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，由于腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的與正常生長(zhǎng)的細(xì)胞不同的代謝特征，使得腫瘤代謝途徑引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。目前手術(shù)治療是乳腺癌的主要治療方式，術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響患者生存率和死亡率的主要因素，因此，研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，探索乳腺癌治療的新手段是減少患者死亡率的重要途徑。

研究顯示，胱硫醚β-合成酶 (cystathione β synthase，CBS)基因突變可能對(duì)腫瘤發(fā)生具有潛在的影響[2]。CBS基因第8外顯子844位存在68bp的插入突變，該基因發(fā)生D到I的突變，產(chǎn)生三種基因型：野生DD型、雜合突變DI型、純合突變II型，使酶蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性改變，引發(fā)體內(nèi)生物學(xué)功能發(fā)生改變[3]。CBS844ins68突變與乳腺癌的關(guān)系結(jié)論不一，且存在種族、地域差別。本次研究運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)CBS844ins68基因多態(tài)性，分析CBS844ins68基因多態(tài)性與新疆漢族乳腺癌是否相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）乳腺癌組：選取2016年9月至2017年12月新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和第五師醫(yī)院住院治療的乳腺癌女性患者150例，中位數(shù)年齡52歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未行針對(duì)乳腺癌的放射和化學(xué)治療，術(shù)后均經(jīng)病理確診。納入標(biāo)準(zhǔn)符合最新WHO乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：未經(jīng)手術(shù)治療的乳腺癌患者；同時(shí)患兩種以上惡性腫瘤患者；既往腫瘤史患者；有乳腺癌家族史的乳腺癌患者。（2）對(duì)照組：隨機(jī)抽取同期來我院的健康女性體檢者150例，中位數(shù)年齡53歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：無乳腺癌家族史及其他腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：有乳腺癌家族史及其他腫瘤病史，與同期收集的病例組有生物學(xué)關(guān)聯(lián)。所有研究對(duì)象均在本地居住5年以上。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集

采集兩組研究對(duì)象外周靜脈抗凝全血6 mL，其中一管EDTAK2抗凝3 mL，用于血液基因組DNA提取，凍存于-80℃。另一管肝素抗凝3 mL，3000 r/min離心10 min，分離血漿檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。

1.2.2 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物

AFP、CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4 檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行，運(yùn)用羅氏601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。

1.2.3 血液基因組DNA提取

外周靜脈抗凝全血3 mL，按照北京天根生化科技有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒DP304-02(離心柱型)說明提取基因組DNA，測(cè)量樣本DNA在分光光度計(jì)260 nm和280 nm處的光密度(D)值，以評(píng)估所提取DNA純度和濃度并用0.7%瓊脂糖凝膠電泳判定DNA的質(zhì)量。DNA凍存于-80℃。

1.2.4 引物合成

引物序列參考有關(guān)文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，由上海生工生物有限公司合成。序列為P1：5’-CTGGCCTTGAGCCCTGAA-3’，P2：5’-GGCCGGGCTCTGGACTC-3’。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及電泳判斷基因型

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA模板2.0 μL，上下游引物各 1.0 μL，PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR引物及反應(yīng)條件為95℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，36個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min，PCR反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物 5 μL，在 2%瓊脂糖凝膠中，110V，電泳50min，美國(guó)伯樂公司Bio-RAD凝膠成像儀成像，檢測(cè)分析基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CBS844ins68基因型及其他危險(xiǎn)因素與乳腺癌的相關(guān)性用Logistic回歸分析，結(jié)果以相對(duì)危險(xiǎn)度（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）表示。

2 結(jié)果

2.1 新疆漢族乳腺癌組和對(duì)照組的一般臨床資料分析

兩組僅是否絕經(jīng)、CEA、CA15-3的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）(表 1)。

表1 乳腺癌組和對(duì)照組的一般臨床資料分析 n/%Tab.1 General clinical data analysis of breast cancer and control groups n/%

2.2 PCR及基因型鑒定結(jié)果

CBS844ins68位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度為184 bp，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳得到兩種基因型：野生型（DD型），可見184 bp一個(gè)條帶；雜合突變型（DI型），可見184bp和252 bp兩個(gè)條帶；純合子突變型（II型）未檢測(cè)到(圖 1)。

圖1 CBS844ins68擴(kuò)增圖Fig.1 CBS844ins68 amplification

2.3 CBS844ins68基因多態(tài)性在乳腺癌組和對(duì)照組的分布情況

CBS844ins68基因多態(tài)性在乳腺癌組和對(duì)照組的分布情況由表2可知：

表2 乳腺癌組與對(duì)照組CBS844ins68基因型及等位基因分布情況 n/%Tab.2 CBS844ins68 genotype and allele frequency distribution in breast cancer and control groups n/%

乳腺癌組CBS844ins68基因型DD、DI、II分別為94.0%、6.0%、0；對(duì)照組 CBS844ins68基因型 DD、DI、II分別為 96.7%、3.3%、0[l8]。乳腺癌組 CBS844 ins68等位基因D、I頻率分別為97.0%、3.0%；對(duì)照組CBS844ins68等位基因 D、I頻率分別為 98.3%、1.7%[19]，兩組基因型與等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)（表2）。

2.4 CBS844ins68基因多態(tài)性與乳腺癌的多因素分析

以乳腺癌的發(fā)生（對(duì)照=0，乳腺癌=1）作為因變量，以 CBS844ins68多態(tài)性（DD=1，DI=2)、年齡（≥50=0，＜50=1）、絕經(jīng)（未絕經(jīng) =1，絕經(jīng) =2）、AFP(＜7=0，≥7=1）、CEA (＜3.4=0，≥3.4=1）、CA125(＜35=0，≥35=1）、CA15-3(＜25=0，≥25=1）、CA19-9(＜27=0，≥27=1）、CA72-4(＜6.9=0，≥6.9=1） 為自變量，采用二分類 Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示年齡＜50歲、已絕經(jīng)、AFP≥7.0、CA15-3≥25、CEA≥3.4可增加新疆漢族乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)3-9倍（表 3）。

表3 乳腺癌危險(xiǎn)因素的 Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of breast cancer risk factors

3 討論

乳腺癌是復(fù)雜的贅生物和腫瘤細(xì)胞集合，由來自不同亞型的細(xì)胞群組成，在臨床表現(xiàn)、病理分型、免疫組化、腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平及預(yù)后呈現(xiàn)多樣性表達(dá)。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究的飛速發(fā)展，乳腺癌的遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制研究在持續(xù)深入，流行病學(xué)研究顯示[5]，遺傳因素和環(huán)境因素在乳腺癌發(fā)病過程中呈現(xiàn)出獨(dú)特影響作用。基因改變是環(huán)境致癌因子致癌作用的一個(gè)重要過程。人群中不同的CBS基因型有可能決定不同個(gè)體間CBS的表達(dá)與功能上的差異，進(jìn)而影響到體內(nèi)CBS的最終生物學(xué)效應(yīng)[6]。關(guān)于CBS基因多態(tài)性的研究較多，但尚無統(tǒng)一結(jié)論。目前CBS844ins68基因多態(tài)性與新疆乳腺癌相關(guān)性研究尚未證實(shí)，本研究選取新疆漢族乳腺癌人群為研究對(duì)象，首次探討CBS844ins68多態(tài)性與乳腺癌之間的相關(guān)性。

CBS位于染色體 21q22.3，長(zhǎng) 25～30KB，編碼 551個(gè)氨基酸。CBS基因中的突變位點(diǎn)有80多個(gè)，多數(shù)分布在第3和第8外顯子中，常見突變位點(diǎn)有844ins68、T833C等。CBS844ins68存在野生型（DD）、雜合突變型（DI）、純合突變型（II）3種基因型。DD型是CBS基因第8外顯子的844位點(diǎn)沒有插入68個(gè)核苷酸；DI型是一個(gè)染色體插入68個(gè)核苷酸，另一個(gè)染色體沒有插入68個(gè)核苷酸；II型是兩個(gè)染色體都插入了68個(gè)核苷酸，這種變化是一種基因重排引起的插入突變。由于CBS844插入產(chǎn)生提前出現(xiàn)的終止密碼子，導(dǎo)致產(chǎn)生縮短的蛋白質(zhì)及無功能的CBS酶。該基因發(fā)生突變后，其編碼的異亮氨酸取代天冬氨酸，引起CBS代謝酶活性降低。研究顯示，不同地區(qū)不同種族CBS844ins68基因型和基因頻率差異很大。鐘慧軍[7]發(fā)現(xiàn)廣西寧夏漢族基因型為DD 70.21%、DI 19.86%、II 9.93%，朱文麗[8]研究北京地區(qū)人群發(fā)現(xiàn)基因型為DD 87.4%、DI 12.6%，陳作森[9]報(bào)道山東濰坊漢族人群基因型為DD 99.32%、DI 0.68%，史嘉翊[10]研究黑龍江牡丹江地區(qū)409例朝鮮族和漢族人群發(fā)現(xiàn)均為DD基因型。Gallegos[11]對(duì)墨西哥瓜達(dá)哈拉地區(qū)323名乳腺癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CBS844ins68 DD和DI基因型突變影響墨西哥乳腺癌人群易感性。英國(guó)人群變異的DI基因型頻率為20%，哥倫比亞和智利人群DI基因型的頻率為10%[12]。人群中68BP插入的純合突變很少，在日本和印度尼西亞沒有觀察到CBS 844ins68等位基因突變體[13]。本研究結(jié)果顯示，新疆漢族乳腺癌組CBS844ins68位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分別為94.0%、6.0%、0和97.0%、3.0%；對(duì)照組基因型頻率和等位基因頻率分別為96.7%、3.3%、0和98.3%、1.7%，兩組基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這表明CBS基因CBS844ins68位點(diǎn)與新疆漢族乳腺癌發(fā)生無相關(guān)性。

本次研究發(fā)現(xiàn)新疆漢族乳腺癌人群中年齡小于50歲、已絕經(jīng)、AFP、CEA、CA15-3水平增高是乳腺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)乳腺癌高發(fā)年齡為40～49歲，西方國(guó)家為50～59歲，本次研究發(fā)現(xiàn)小于50歲人群乳腺癌發(fā)病危險(xiǎn)性增高，與Bouchardy研究結(jié)果一致[14]。瞿蕾[15]發(fā)現(xiàn)是否絕經(jīng)與乳腺癌的發(fā)生具有相關(guān)性，絕經(jīng)晚是乳腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，與本次研究結(jié)果有不一致之處，分析原因可能與納入人群不同、遺傳因素及不同地域人群飲食習(xí)慣和生活方式不同有關(guān)。張同成[16]檢測(cè)乳腺癌患者腫瘤標(biāo)志物水平發(fā)現(xiàn)AFP顯著增高，認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生引發(fā)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞激活A(yù)FP基因，AFP水平和腫瘤生物學(xué)特性、分化程度密切相關(guān)。Shao Y[17]研究顯示術(shù)前血清CEA和CA15-3水平是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CEA和CA15-3明顯升高與腫瘤大小、晚期腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wu S G[18]回顧性地分析1148例乳腺癌患者術(shù)前的CEA和CA15-3水平，發(fā)現(xiàn)術(shù)前血清CEA和CA15-3水平升高的患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率更高，提示CEA和CA15-3可用于預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)后及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)新疆漢族乳腺癌的危險(xiǎn)因素為年齡小于50歲、已絕經(jīng)、AFP、CEA、CA15-3水平增高的人群，CBS844ins68基因多態(tài)性與新疆漢族乳腺癌發(fā)生無相關(guān)性。由于本研究樣本例數(shù)較少，實(shí)驗(yàn)納入人群有限，在以后工作和研究過程中會(huì)加大樣本數(shù)，同時(shí)進(jìn)行多地區(qū)、多民族、多基因的實(shí)驗(yàn)，為臨床上治療乳腺癌提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。